實(shí)驗(yàn)六蠶豆根尖微核檢測(cè)技術(shù)學(xué)時(shí)綜合性設(shè)計(jì)性

實(shí)驗(yàn)六蠶豆根尖微核檢測(cè)技術(shù)學(xué)時(shí)綜合性設(shè)計(jì)性第一頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日

由于大量新的化合物的合成，原子能應(yīng)用，各種各樣工業(yè)廢物的排出，使人們需要有一套高度靈敏、技術(shù)簡(jiǎn)單的測(cè)試系統(tǒng)來(lái)監(jiān)視環(huán)境的變化。只有真核的測(cè)試系統(tǒng)更能直接推測(cè)誘變物質(zhì)對(duì)人類或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測(cè)試是一種比較理想的方法。且有研究顯示以植物進(jìn)行微核測(cè)試與以動(dòng)物進(jìn)行的一致率可達(dá)99%以上。目前微核測(cè)試已經(jīng)廣泛應(yīng)用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。利用蠶豆根尖作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行微核測(cè)試，可準(zhǔn)確的顯示各種處理誘發(fā)畸變的效果，并可用于污染程度的監(jiān)測(cè)。第二頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)材料松滋青皮豆（蠶豆）種子四、實(shí)驗(yàn)器具、藥品試劑實(shí)驗(yàn)器具：顯微鏡，計(jì)數(shù)器，鑷子，載玻片，蓋玻片，燒杯，瓷盤等。實(shí)驗(yàn)藥品：6mol/L鹽酸，甲醇，冰乙酸，醋酸洋紅，EMS(甲基磺酸乙酯)處理液：150,200mmol/L2種處理濃度。NaN3(疊氮鈉)處理液：0.5,1.0,1.5mmol/L3種濃度。CrO3：1.0，2.5mol/L2種處理濃度污水：第三頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日五、實(shí)驗(yàn)方法1．實(shí)驗(yàn)材料的培育蠶豆根尖細(xì)胞的染色體大，DNA含量高，因而對(duì)誘變因子反應(yīng)敏感。松滋青皮豆是從不同蠶豆品種中篩選出來(lái)的一種較為敏感的品種。本品種引入后在栽培繁殖時(shí)要注意不要同其它蠶豆品種種在一起，不噴灑農(nóng)藥、以保持該品種較低的本底微核值。也可用其它蠶豆品種，但是必須設(shè)置對(duì)照組。種子成熟后，曬干貯藏于干燥器內(nèi)或4℃冰箱內(nèi)備用。

第四頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日2．浸種催芽：將實(shí)驗(yàn)用蠶豆種子按需要量放入盛有蒸餾水的燒杯中，在25℃下浸泡24小時(shí)，此間至少換水兩次．所換水應(yīng)25℃預(yù)溫。種子吸脹后；用紗布松散包裹置白磁盤中，保持濕度，在25℃溫箱中催芽12－24小時(shí)，待初生根長(zhǎng)出2—3mm時(shí)，再取發(fā)芽良好的種子，放入鋪滿濾紙的磁盤中，25℃繼續(xù)催芽，經(jīng)約36～48小時(shí)．大部分初生根長(zhǎng)至1～2cm左右，根毛發(fā)育良好，這時(shí)即可用來(lái)進(jìn)行檢測(cè)了。第五頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日3．處理每一處理選取6-8粒初生根生長(zhǎng)良好、根長(zhǎng)一致的種子，放入盛有待測(cè)物溶液的培養(yǎng)皿中，浸沒(méi)根尖。陽(yáng)性因子可采用CrO3（1.0和2.5mol/L）、NaN3（0.5、1.0和1.5mol/L）或EMS（150和200mol/L），另取一處污水作待檢測(cè)物質(zhì)，用自來(lái)水作對(duì)照，共9個(gè)處理，處理根尖6～24h(處理時(shí)間可視實(shí)驗(yàn)需要和被測(cè)液濃度而定)。第六頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日4．根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)將處理后的種子用蒸餾水浸洗三次，每次2－3min。將洗凈的種子再放入鋪好濾紙或脫脂棉的白磁盤內(nèi)25℃溫箱中恢復(fù)培養(yǎng)22－24小時(shí)。5．固定根尖細(xì)胞及制片(參考根尖壓片法)(1)將恢復(fù)培養(yǎng)后的種子，從根尖頂端，切下1cm長(zhǎng)的幼根。用卡諾氏液固定24h，固定后如果不及時(shí)制片，可換入70%的乙醇中，置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。第七?yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日6．酸解：從70％乙醇中取出固定好的根尖→流水沖洗３min→吸水紙吸干→放入盛有適量1mol/LHCl，60±0.5℃水浴保溫的青霉素瓶中→解離10min。7．染色

改良石炭酸品紅染色：解離后材料水洗3min并吸干，挑取1個(gè)根尖的乳白色分生組織于載玻片上夾碎搗爛，滴加1～2滴染液，染色10～15min，壓片。第八頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日8．壓片

在經(jīng)染色的材料上加一滴染液，蓋上蓋玻片，覆一層吸水紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打，或以拇指垂直緊壓蓋片(注意勿使蓋片搓動(dòng))，使材料分散壓平，便于觀察。第九頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日9．鏡檢及微核識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)首先在低倍鏡下找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散均勻，分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀察。微核識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)：（1）在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。（2）小核著色與主核相當(dāng)或稍淺。（3）小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則型。每一處理觀察3個(gè)根尖，每個(gè)根尖計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的微核數(shù)并進(jìn)行記錄。第十頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日第十一頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和污染程度劃分將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按以下步驟進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理：1．計(jì)算各測(cè)試樣品（包括對(duì)照組）微核千分率（MCN‰）如果對(duì)照本底MCN‰為10‰以下，可采用如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析以確定樣品的污染程度：

MCN‰在10‰以下，表示基本沒(méi)有污染；

MCN‰在10‰－18‰?yún)^(qū)間，則表示有輕度污染；

MCN‰在18‰－30‰?yún)^(qū)間，則表示有中度污染；

MCN‰在30‰以上，則表示有重度污染；

第十二頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日也可以采用“污染指數(shù)”判別：此方法可避免因?qū)嶒?yàn)條件等因素帶來(lái)的MCN‰本底的波動(dòng)，方法如下：

污染指數(shù)在0－1.5區(qū)間為基本沒(méi)有污染；

污染指數(shù)在1.5－2區(qū)間為輕度污染；

污染指數(shù)在2－3.5區(qū)間為中度污染；

污染指數(shù)在3.5以上為重度污染；如果對(duì)照本底MCN‰為10‰以上，可采用t檢驗(yàn)（被測(cè)樣品較少時(shí)）檢測(cè)處理液致畸效果是否明顯，或以F檢驗(yàn)（被測(cè)樣品較多時(shí)）檢測(cè)各處理之間是否具有顯著的差異。第十三頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日七、注意事項(xiàng)：1.各種誘發(fā)微核的處理試劑具有一定毒性，請(qǐng)注意使用安全，并防止污染環(huán)境。2.凡數(shù)值在上下限時(shí)，定為上一級(jí)污染。3.對(duì)嚴(yán)重污染的水環(huán)境進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)處理會(huì)造成根尖死亡，應(yīng)稀釋后再作測(cè)試；4.在沒(méi)有空調(diào)恒溫設(shè)備時(shí)，如室溫超過(guò)30℃，MCN本底可能有升高現(xiàn)象，但可經(jīng)污染指數(shù)法數(shù)據(jù)處理，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。第十四頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日蠶豆根尖微核檢測(cè)記錄表試驗(yàn)號(hào)鏡檢日期鏡檢者片號(hào)第一片第二片第三片各自觀察的細(xì)胞數(shù)或微核數(shù)細(xì)胞數(shù)微核數(shù)細(xì)胞數(shù)微核數(shù)細(xì)胞數(shù)微核數(shù)總計(jì)平均微核千分率第十五頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日第十六頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日第十七頁(yè)，共二十三