第二章中藥化學(xué)成分提取分離方法

第二章中藥化學(xué)成分提取分離方法

一.中藥化學(xué)成分的提取(一)溶劑提取法依據(jù)：化學(xué)成分的溶解性（極性）關(guān)鍵：提取溶劑的選擇溶劑的選擇原則：相似相溶的原則，價(jià)廉、易得、無毒、安全等。提取方法：浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、連續(xù)回流提取法。常用提取溶劑性能特點(diǎn)提取溶劑性能特點(diǎn)適宜提取成分提取方法強(qiáng)極性溶劑溶解范圍廣生物堿鹽穿透能力強(qiáng)苷類水易得、安全糅質(zhì)煎煮法糖類滲漉法有些脂溶性成分溶解不完全氨基酸有些苷類成分的酶解蛋白質(zhì)水提液易發(fā)霉、變質(zhì)水溶性雜質(zhì)多，過濾困難沸點(diǎn)高，濃縮困難親水性有機(jī)溶劑（和水可任意混溶）除去多糖、溶解范圍廣（不同濃度乙醇）蛋白質(zhì)外滲濾法（稀醇）水溶性雜質(zhì)溶出少的大多數(shù)浸漬法乙醇可抑制酶的活性化學(xué)成分回流法提取液不易發(fā)霉、變質(zhì)均可連續(xù)回流法大部分可回收利用但有揮發(fā)性、易燃燒甲醇溶解特點(diǎn)與乙醇相似，但有毒丙酮溶解性能同乙醇，但沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，作為提取溶劑不常用；但對色素溶解性能好，在分離、精制時(shí)常用。親脂性有機(jī)溶劑對化合物溶解選擇性較強(qiáng)，水溶性雜質(zhì)少、易純化，游離生物堿回流法揮發(fā)性大、易燃燒、有毒，苷元連續(xù)回流法價(jià)格昂貴，對提取設(shè)備要求高，某些苷類穿透力較弱，提取時(shí)間長，作為提取溶劑不常用。乙醚bp.35℃，極易燃氯仿bp.61℃、d1.480，不易燃，毒性大對生物堿溶解性好苯bp.80.1℃，毒性大石油醚沸程30~60℃、60~90℃、90~120℃脫脂、脫色常用于甲醇、乙醇不能任意混溶（二）水蒸氣蒸餾法適用于揮發(fā)性成分（主要是揮發(fā)油）的提取

（三）二氧化碳超臨界流體萃取技術(shù)（CO2-SFE）超臨界流體萃取技術(shù)：以超臨界流體作為萃取介質(zhì)的一種提取新技術(shù)。超臨界流體：處于臨界溫度（Tc）、臨界壓力（Pc）以上，介于氣體與液體之間的流體。特點(diǎn)：具有液體和氣體的雙重特性，如：密度與液體近似黏度與氣體近似對很多物質(zhì)有很強(qiáng)的溶解能力擴(kuò)散系數(shù)是液體的100倍（不及氣體）中藥提取常用的超臨界流體：二氧化碳（CO2）優(yōu)點(diǎn)：1.臨界溫度（Tc=31.4）接近室溫,熱敏成分穩(wěn)定.2.臨界壓力（Pc=7.37MPa）不太高,易操作.3.本身呈惰性，與化合物不反應(yīng).4.價(jià)格便宜.超臨界流體萃取中藥成分的主要優(yōu)點(diǎn)：1.可以在接近室溫下工作，防止熱敏成分的破壞或逸散。2.萃取過程幾乎不用有機(jī)溶劑，萃取物中無溶劑殘留，對環(huán)境無污染。3.提取效率高，節(jié)約能耗。二．中藥化學(xué)成分分離與精制方法分離依據(jù)分離方法分離原理或特點(diǎn)二相萃取法分配系數(shù)（K）差異逆流分溶法（CCD）液滴逆流色譜法（DCCC）高速逆流色譜法（HSCCC）液-液分配柱色譜正相色譜和反相色譜加壓液相色譜法正相色譜和反相色譜快速色譜低壓液相色譜（LPLC）中壓液相色譜（MPLC）高壓(效)液相色譜法（HPLC）分配系數(shù)（K）差異溶解度差異溶劑沉淀法水提醇沉法（水/醇法）除去多糖、蛋白質(zhì)等水溶性雜質(zhì)醇提水沉法（醇/水法）除去樹脂、葉綠素等脂溶性雜質(zhì)醇/醚（丙酮）法皂苷的純化（除去脂溶性雜質(zhì)）酸/堿法生物堿的分離純化堿/酸法酸性成分（如苷元）的分離純化試劑沉淀法鈣、鋇、鉛鹽沉淀法酸性成分的分離生物堿沉淀試劑沉淀法生物堿的分離純化結(jié)晶及重結(jié)晶化合物的進(jìn)一步精制溶解度差異物理吸附（表面吸附）無選擇性、吸附可逆、可快速進(jìn)行，應(yīng)用較多硅膠極性吸附劑氧化鋁極性吸附劑吸附性差別活性炭非極性吸附劑化學(xué)吸附有選擇性、吸附牢固或不可逆、洗脫難，應(yīng)用較少堿性氧化鋁對酚酸類（黃酮、蒽醌）的吸附酸性硅膠對生物堿的吸附半化學(xué)吸附吸附力介于上述二者之間、力量較弱聚酰胺（氫鍵吸附）大孔吸附樹脂吸附原理（范德華引力或產(chǎn)生氫鍵）分子篩原理（本身多孔性結(jié)構(gòu)的性質(zhì)決定的）吸附性差別透析法(半透膜膜孔的分子篩作用)凝膠濾過法(三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩作用)超濾法(分子大小不同引起的擴(kuò)散速度的差別)超速離心法(溶質(zhì)在超速離心作用下沉降性的差別)蛋白質(zhì)的脫鹽精制蛋白、多糖的分離及小分子化合物的分離大分子化合物精制分離同上分子大小差別

離子交換樹脂法氨基酸、生物堿、有機(jī)酸的分離陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂離解程度不同常用色譜分離方法介紹：吸附色譜吸附劑分離原理吸附規(guī)律應(yīng)用硅膠吸附原理弱酸性、極性吸附劑廣泛（酸、堿及化合物極性越大、中性成分均可）吸附能力強(qiáng)（難洗脫）溶劑極性越小，吸附力越強(qiáng)

氧化鋁吸附原理堿性、極性吸附劑堿性、中性成分吸附規(guī)律同上（酸性成分與鋁絡(luò)合）活性炭吸附原理非極性吸附劑從稀水溶液中富集微量物質(zhì)吸附規(guī)律與上相反脫色（脂溶性色素）聚酰胺氫鍵吸附酚羥基數(shù)目多，吸附力強(qiáng)能形成分子內(nèi)氫鍵者，吸附力下降黃酮、蒽醌的分離母核芳香化程度高者，吸附力增強(qiáng)除鞣質(zhì)水（介質(zhì)）中吸附力強(qiáng)，水洗脫力弱大孔吸附樹脂吸附原理非極性化合物易被非極性樹脂吸附

糖與苷的分離分子篩原理溶劑中溶解度增大，吸附力下降（從水提液富集苷類）

非極性樹脂，極性小的溶劑洗脫力強(qiáng)生物堿的精制液-液分配色譜（分配原理）類型固定相流動(dòng)相應(yīng)用正相色譜水>BAW系統(tǒng)極性、中極性物質(zhì)分離（以PPC為例）反相色譜ODS<甲醇-水、乙腈-水最廣泛，非極性、中極性各類物質(zhì)的分離

加壓液相色譜類型壓力（Pa）分離規(guī)模分析用高壓液相色譜（HPLC）>20.2×1051mg左右制備用高壓液相色譜（HPLC）>5mg中壓液相色譜(MPLC)5.05~20.2×105>100mg低壓液相色譜(LPLC)<5.05×10510mg~1g快速色譜約2.02×105>10mg葡聚糖凝膠色譜類型原理溶脹溶劑應(yīng)用

葡聚糖凝膠分子篩（大→小）水多糖、多肽、（SephadexG）蛋白質(zhì)分離羥丙基葡聚糖凝膠分子篩（糖苷）水、極性有機(jī)溶劑適于不同類型（SephadexLH-20）吸附原理（苷元）或二者的混合溶劑化合物分離離子交換吸附樹脂樹脂類型原理應(yīng)用陽離子交換樹脂離子交換從酸水溶液中吸附堿性成分（生物堿）強(qiáng)酸性（R-SO3-H+）（陽離子）（除去酸性、中性成分）弱酸性（-COO-H+）陰離子交換樹脂離子交換從堿水溶液中吸附酸性成分（有機(jī)酸）強(qiáng)堿性（RN+(CH3)3CI-）（陰離子）（除去堿性、中性成分）弱堿性(伯、仲、叔胺)三、結(jié)構(gòu)研究化合物純度的判定方法1．結(jié)晶均勻、一致。2．熔點(diǎn)明確、敏銳（0.5~1.0℃）3．TLC(PPC):三種以上不同展開劑展開，均呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)。4．HPLC、GC也可以用于化合物純度的判斷。（二）四大光譜在結(jié)構(gòu)測定中的應(yīng)用紫外—可見光譜（UV-VIS）——共軛體系特征分子中電子躍遷（從基態(tài)至激發(fā)態(tài)）。其中，n-π*、π-π*躍遷可因吸收紫外光及可見光所引起，吸收光譜將出現(xiàn)在光的紫外區(qū)和可見區(qū)（200~700nm）。200nm400700nm紫外區(qū)（UV）可見區(qū)（VIS）應(yīng)用：推斷化合物的骨架類型——共軛系統(tǒng)，。取代基團(tuán)的推斷。如加入診斷試劑推斷黃酮的取代模式（類型、數(shù)目、、排列方式）用于含量測定（以最大吸收波長作為檢測波長進(jìn)行含量測定）。

紅外光譜（IR）分子中價(jià)鍵的伸縮及彎曲振動(dòng)所引起的吸收而測得的吸收圖譜，稱為紅外光譜。40003600300015001000625cm-1特征頻率區(qū)指紋區(qū)特征官能團(tuán)的鑒別化合物真?zhèn)蔚蔫b別羥基（酚羥基、醇羥基）3600~3200cm-1

游離羥基~3600cm-1

氫鍵締合羥基3400~3200cm-1

羰基1600~1800cm-1酮~1710cm-1酯1710~1735cm-1芳環(huán)1600、1580、1500cm-1有2~3個(gè)峰雙鍵1620~1680cm-1兩個(gè)化合物完全相同的條件1、特征區(qū)完全吻合2、指紋區(qū)也需完全一致1H-NMR（核磁共振氫譜）:信息參數(shù)：化學(xué)位移（δ）、峰面積、峰裂分（s、d、t、q、m）及偶合常數(shù)（?）（1）化學(xué)位移（δppm）:與1H核所處的化學(xué)環(huán)境（1H核周圍的電子云密度）有關(guān)電子云密度大，處于高場，δ值小電子云密度小，處于高場，δ值大~0.9-C-CH3

~1.8-C=C-CH3~2.1-COCH3

~3.0-NCH3

~3.7-OCH3

11109876543210-COOH-CHOAr-H-C=C-H常見結(jié)構(gòu)的化學(xué)位移大致范圍（要求熟記）(δ(δppm)

推斷化合物的結(jié)構(gòu)（含1H核基團(tuán)的結(jié)構(gòu)）

（二）峰面積:磁等同質(zhì)子的數(shù)目——用積分曲線面積（高度）表示

（三）峰裂分及偶和常數(shù):磁不等同兩個(gè)或兩組1H核在一定距離內(nèi)相互自旋偶合干擾，發(fā)生的分裂所表現(xiàn)出的不同裂分符合n+1規(guī)律(n=磁等同質(zhì)子的數(shù)目)用偶合常數(shù)（J）表示峰裂分的數(shù)目峰裂分的距離不同系統(tǒng)偶合常數(shù)(JHz)大小s單峰d雙峰t三重峰q四重峰m多重峰芳環(huán)J鄰6~10HzJ間0~3HzJ對0~1Hz雙鍵J順7~11HzJ反12~18Hz飽和烴類相鄰碳原子上質(zhì)子偶合常數(shù)的大小與兩個(gè)氫原子之間的立體夾角θ有關(guān)θ=60OJ=2~4Hzθ=180OJ=9~10Hz環(huán)己烷及其類似物相鄰碳原子上質(zhì)子的偶合常數(shù)Jaa10~13Hz(θ=180O)Jae2~5Hz(θ=60O)Jee2~5Hz(θ=60O)1H-NMR核磁共振輔助技術(shù)：（1）重氫(D2O)交換——推斷活潑質(zhì)子（羥基）的存在與否（2）核增益效應(yīng)（NOE）：指在核磁共振中選擇性照射一種質(zhì)子使其飽和，則與該質(zhì)子在立體空間位置上接近的另一或數(shù)個(gè)質(zhì)子信號(hào)強(qiáng)度增高的現(xiàn)象。（3）溶劑位移：苯誘導(dǎo)位移——由于溶劑分子（苯）的接近，對化合物將發(fā)生不同的屏蔽及去屏蔽作用，使質(zhì)子化學(xué)位移發(fā)生變化的現(xiàn)象。13C-NMR（核磁共振碳譜）：FT-NMR:即脈沖傅里葉變換核磁共振。其裝置原理為采用強(qiáng)的脈沖照射使分子中所有的13C核同時(shí)發(fā)生共振，生成在馳豫期內(nèi)表現(xiàn)為指數(shù)形式衰減的正弦波信號(hào)（自由誘導(dǎo)衰減；FID），再經(jīng)傅里葉變換即成為正常的NMR信號(hào)。隨著脈沖掃描次數(shù)的增加及計(jì)算機(jī)的累加計(jì)算，13C信號(hào)將不斷得到增強(qiáng)，噪音則越來越弱。經(jīng)過若干次的掃描及累加計(jì)算，最后即得到一張好的NMR譜。由于該裝置的出現(xiàn)及計(jì)算機(jī)的引入，才使得13C-NMR用于有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)研究成為可能。信息參數(shù)：化學(xué)位移（δC）、異核偶合常數(shù)（JCH）、馳豫時(shí)間（T1）(1)化學(xué)位移：大致范圍(δC）0~200ppm不同13C核δC大小與13C核所處的化學(xué)環(huán)境（周圍電子云密度）有關(guān)

用于13C核類型的推斷

(δCppm)

150~220(c=o)

200150100500

c=cAr

50~80(c-o)

飽和碳原子（0~60）

主要結(jié)構(gòu)13C核δC的大致范圍(要求熟記)

常用13C-NMR測定技術(shù)及其特征：

(1)質(zhì)子寬帶去偶（BBO）:也叫全氫去偶（COM）.噪音去偶.采用寬頻電磁輻射照射所有1H核使之飽和后測得的13C-NMR譜（即去掉所有氫核對碳核的偶合影響）。特征：圖譜簡化，每個(gè)碳原子都為單峰，互不重疊。方便于判斷碳信號(hào)的化學(xué)位移。伯、仲、叔碳峰增強(qiáng)，季碳為弱峰（照射1H核產(chǎn)生NOE效應(yīng)）無法區(qū)別碳上連接的1H核數(shù)目。（2）偏共振去偶：（此法現(xiàn)已基本上被DEPT所替代）僅保留直接與碳原子相連1H核對碳的偶合J1CH（即去掉氫核對碳核的遠(yuǎn)程偶合J2CHJ3CH）伯（-CH3)表現(xiàn)為四重峰（q）仲（-CH2-)三重峰(t)叔（-CH-)雙峰(d)季（-C-）單峰(s)碳核（伯、仲、叔、季）類型的判斷（3）DEPT(無畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)法)：（為13C-NMR譜的一種常規(guī)測定方法）系通過改變照射1H核的脈沖寬度（或設(shè)定不同的馳豫時(shí)間）使不同類型13C信號(hào)在譜圖上呈單峰，并分別呈現(xiàn)正向峰或倒置峰脈沖寬度峰的特征Θ=450CH3↑CH2↑CH↑(↑代表正向峰)Θ=900CH↑Θ=1350CH3↑CH↑CH2↓（↓代表倒置峰）可用于區(qū)別伯（CH3）、仲（CH2）、叔（CH）碳信號(hào)與質(zhì)子寬帶去偶譜比較，還可以確定季碳（-C-）信號(hào)二維核磁共振譜（2D-NMR譜）

質(zhì)譜（MS）:1．確定分子量（高分辨質(zhì)譜可將分子量精確到小數(shù)點(diǎn)后三位）,計(jì)算分子式。2．提供其他結(jié)構(gòu)信息。如黃酮類，依碎片離子峰可以確定A-環(huán),B-環(huán)的取代模式。3．與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較用于化合物的鑒別（相同條件下，其裂解是符合一定規(guī)律的）。4．依裂解特征