第五講豬口蹄疫診斷與防疫1

第五講豬口蹄疫診斷與防疫一、概況

Foot-and–MouthDisease由口蹄疫病毒引起偶蹄獸的急性、熱性、高度傳染性的動(dòng)物疫病。OIE規(guī)定為A類(lèi)傳染病，我國(guó)定為動(dòng)物1類(lèi)傳染病。曾造成全球流行,17-19世紀(jì),德國(guó)、法國(guó)、奧地利等有報(bào)道，至20世紀(jì)，歐洲仍廣泛流行；亞洲更嚴(yán)重。迄今為止，僅新西蘭未報(bào)道口蹄疫。

澳大利亞1872年、日本1933年、美國(guó)1929年、加拿大1952年、墨西哥1954年宣布消滅口蹄疫。后采取嚴(yán)格檢疫等防范措施、并因?yàn)橛辛己玫奶烊黄琳?，未再傳入口蹄疫，屬于長(zhǎng)期無(wú)口蹄疫國(guó)家。

因該病傳播快，加上現(xiàn)代交通發(fā)達(dá)，口蹄疫一直是隱患，隨時(shí)有爆發(fā)危險(xiǎn)。如1997年臺(tái)灣豬口蹄疫，400多萬(wàn)頭豬被撲殺、銷(xiāo)毀，各種損失達(dá)80億美元。2001年，英國(guó)口蹄疫，有2300個(gè)點(diǎn)發(fā)病，撲殺牛等450萬(wàn)頭，直接和間接損失超過(guò)90億英鎊。中國(guó)：自1990年爆發(fā)以來(lái)，我國(guó)流行嚴(yán)重。主要是O型，但新疆等牛羊有A型，特別是2004年以來(lái)，發(fā)生Asia-1口蹄疫，并傳播至內(nèi)地。中國(guó)邊境國(guó)家口蹄疫流行亦嚴(yán)重，特別是南亞和西亞國(guó)家。二、世界口蹄疫流行新動(dòng)態(tài)1病毒特性發(fā)生改變，出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)毒株

口蹄疫7個(gè)主型在世界的分布不均勻，其中O型占76%。1999年，世界口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)512份病料（40個(gè)國(guó)家），49.4%分離到O型病毒。1997年臺(tái)灣、2000年韓國(guó)及日本、2001年英國(guó)均為O型口蹄疫。病毒對(duì)宿主易嗜性發(fā)生變化：1997年臺(tái)灣口蹄疫豬易感，但牛不出現(xiàn)臨床癥狀2000年韓國(guó)口蹄疫僅牛發(fā)病，2002年時(shí)僅豬發(fā)病。隱性帶毒對(duì)難以防控，可能成為以后新的傳染源O型毒株泛亞株的出現(xiàn)：該毒株具有較強(qiáng)的傳播能力和入侵能力，其宿主有牛、水牛、豬、綿羊、山羊、駱駝、鹿等。1990年在印度首次發(fā)現(xiàn)，1994年傳入沙特，1996年傳入歐洲，1998年在不丹，1999年在臺(tái)灣和東南亞，2001年在英國(guó)（英國(guó)歷史上首次流行泛亞株）。另外，泛亞毒株在不同動(dòng)物表現(xiàn)不同的臨床致病特點(diǎn)，如在伊朗引起羔羊很高的致死率，在臺(tái)灣和日本引起牛亞臨床感染，且對(duì)豬的潛伏期可由通常的2-10d縮短為36h。目前，泛亞毒株已經(jīng)成為世界口蹄疫的優(yōu)勢(shì)毒株。但是2010年中國(guó)廣泛流行緬A株。2病毒傳播速度更快，造成的危害更大因?yàn)椴《咀円?，?jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)毒株具備更強(qiáng)的入侵能力和更好的適應(yīng)環(huán)境變化的能力，從而實(shí)現(xiàn)跨國(guó)傳播。2003年3月，韓國(guó)、日本爆發(fā)口蹄疫，1個(gè)月后，病毒就進(jìn)入俄羅斯、蒙古；2001年英國(guó)爆發(fā)口蹄疫，1月后，就擴(kuò)散到愛(ài)爾蘭、法國(guó)、荷蘭，造成歐洲和世界口蹄疫的爆發(fā)。3非口蹄疫國(guó)家從新爆發(fā)口蹄疫14-15世紀(jì)，阿拉伯就有口蹄疫相關(guān)的報(bào)道；17-18世紀(jì)，德國(guó)、法國(guó)等歐洲大部分國(guó)家爆發(fā)口蹄疫；1845-1894年，歐洲嚴(yán)重流行口蹄疫，并擴(kuò)散至南美；亞洲口蹄疫流行僅次于非洲，居世界第2位，2000年前除韓國(guó)、日本、文萊、新加坡等島國(guó)，均有流行

2000年5月24日，OIE通過(guò)54個(gè)國(guó)家為非免疫無(wú)口蹄疫國(guó)家，其中歐洲占32個(gè)，美洲12個(gè)，亞洲4個(gè)，大洋洲4個(gè)，非洲2個(gè)。1997年臺(tái)灣，2000年韓國(guó)、日本，以及2001年英國(guó)是口蹄疫變異株在原為無(wú)口蹄疫國(guó)家爆發(fā)的例證。其中日本1908年，韓國(guó)1933年就已經(jīng)消滅了口蹄疫。三、我國(guó)口蹄疫流行歷史及現(xiàn)狀主要分為以下三個(gè)階段：上世紀(jì)50-60年代主要感染牛羊，豬占0.95%。第一次1950-1953年爆發(fā)，首次在新疆，1951年西北5省流行，后至華北、華中、華東、東北，共19省市；1952年四川阿壩流行；發(fā)病牲畜數(shù)百萬(wàn)60年代起，口蹄疫疫情發(fā)生變化，豬感染比例迅速上升，70-80年代牛羊比例急劇下降，90年代豬的發(fā)病率達(dá)到歷史高峰，占總數(shù)的98%。1963年，由蘇聯(lián)、蒙古傳入O型口蹄疫（呼倫貝爾）1964年夏，蘇聯(lián)傳入A型口蹄疫（新疆、蒙古）同年，由新疆向內(nèi)地調(diào)運(yùn)耕牛，沿途從新疆、甘肅、陜西、河南、安徽、山東等在21省市流行，數(shù)百萬(wàn)頭發(fā)病近年來(lái)，又呈新特點(diǎn)（1）1999-2001年，我國(guó)爆發(fā)，以牛羊?yàn)橹鳎煞簛喼暌?，由印度及東南亞傳入我國(guó)邊境地區(qū)（2）2001-2002，我國(guó)口蹄疫回歸90年代“豬群毒”為主，泛亞株減少（3）2003年起，“豬群毒”和泛亞株并存（4）2005年6月和12月，江蘇、山東發(fā)生Asia-1口蹄疫，但被控制，沒(méi)有爆發(fā)四、診斷

由口蹄疫病毒引起偶蹄獸的急性、熱性、高度傳染性的動(dòng)物疫病。OIE規(guī)定為A類(lèi)傳染病，我國(guó)定為動(dòng)物1類(lèi)傳染病。1、病毒分離（1）病料采集家畜感染5天后，病畜食欲減退，體溫升至40℃，同時(shí)舌面水皰已形成，開(kāi)始出現(xiàn)流延，此時(shí)是采集病料的最好時(shí)間。水皰皮、水皰液、食道及咽部分泌物。屠宰后的心臟、血液、肝、脾、肺等均可用于病毒分離。（2）樣品處理水皰液及血液樣品可直接用于分離，水皰皮及組織樣品要洗去甘油，磨碎，以PBS制成懸液（1：10），10000g離心，上清過(guò)濾即可接種。（3）分離病毒細(xì)胞分離FMV能感染的細(xì)胞有牛舌上皮、犢牛腎、甲狀腺、倉(cāng)鼠腎、仔豬腎等細(xì)胞。PK、BHK等細(xì)胞系亦常用。動(dòng)物分離小鼠和豚鼠常用于分離FMV。3~4日齡的乳鼠十分敏感。頸部皮下接種0.2ml，15h后出現(xiàn)口蹄疫的癥狀，如麻痹、呼吸緊張、心肌麻痹等。病毒滴度可達(dá)（LD50）可達(dá)107左右。

豚鼠選500g以上，病料處理后0.4ml接種后肢底部，48~72h后形成水皰。（LD50）可達(dá)106左右。2、血清學(xué)診斷Neutraliazationtest(NT)FMV與相應(yīng)抗體作用后，可失去感染力。可用已知抗體檢測(cè)待檢病原。FMV的檢測(cè)一般在乳鼠或細(xì)胞上進(jìn)行。NT還可用于FMV的分型。（1）固定血清稀釋病毒法（2）固定病毒稀釋血清法（3）乳鼠中和試驗(yàn)（4）細(xì)胞中和試驗(yàn)（5）空斑減少中和試驗(yàn)反向間接血凝試驗(yàn)以抗FMV抗體致敏紅細(xì)胞，再以之檢測(cè)相應(yīng)FMV。可用于病毒的分型。乳膠凝集試驗(yàn)瓊擴(kuò)試驗(yàn)主要用于測(cè)定抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以不同血清型的純化FMV免疫豚鼠制備抗血清，經(jīng)純化后包被ELISA板，用以檢測(cè)相應(yīng)病毒，可用于FMV的分型。常用方法有間接法、夾心法等。夾心法以多抗包被，單抗夾心，效果良好。3、分子生物學(xué)診斷核酸雜交先制備特異FMV的核酸探針，以同位素或地高辛等標(biāo)記，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理進(jìn)行檢測(cè)。常用PCR方法擴(kuò)增FMDV的VP2或VP3基因的cDNA作為探針。PCR用于擴(kuò)增兩個(gè)已知序列間的DNA片段。FMV聚合酶基因中有454個(gè)基因是絕對(duì)保守的，選保守區(qū)兩端的序列分別作為引物。上游引物5-AGGACAAAGCGCTGTTCCGC-3下游引物5-TCAGGGTTGCAACCGACCGC-3另外，VP2、VP3基因具有型特異性，可用于病毒的分型。PCR檢測(cè)FMDV敏感、特異，理論上可檢測(cè)單拷貝基因。寡核苷酸指紋圖譜分析是核酸或核酸片段經(jīng)T1酶酶切后，經(jīng)電泳，少數(shù)大分子量片段在PAGE上分布的特點(diǎn)進(jìn)行比較。

T1酶的特點(diǎn)是在3-末端遇G就切開(kāi)，故可將核算切成不同大小的片段。

優(yōu)點(diǎn)是比較簡(jiǎn)便，敏感性高，能顯示出毒株之間的差異。常用于研究：毒株變異關(guān)系；大流行時(shí)病毒的起源、擴(kuò)散的去向和小流行時(shí)毒株的首發(fā)地，蔓延途徑；野毒株和疫苗毒株的比較等。五、口蹄疫的防制

（一）口蹄疫的預(yù)防措施防止國(guó)外傳入（1）禁止從有該病的國(guó)家輸入易感動(dòng)物或產(chǎn)品。（2）進(jìn)口動(dòng)物產(chǎn)品，必須經(jīng)過(guò)出口國(guó)家的政府獸醫(yī)機(jī)關(guān)檢疫，出具非疫區(qū)產(chǎn)品證明。（3）近3年內(nèi)。邊境地區(qū)發(fā)生口蹄疫，應(yīng)在邊境50~100公里的地帶，對(duì)易感的家畜普遍實(shí)施疫苗注射。（4）在國(guó)家規(guī)定的出入境口岸，設(shè)立動(dòng)物檢疫機(jī)關(guān)，對(duì)出入境動(dòng)物及產(chǎn)品進(jìn)行檢疫。（5）當(dāng)鄰國(guó)邊境發(fā)生口蹄疫時(shí)，實(shí)行邊境封鎖。（6）同鄰國(guó)簽定獸醫(yī)工作互助協(xié)定，溝通信息，共同撲滅疫情。國(guó)內(nèi)非疫區(qū)的預(yù)防（1）當(dāng)鄰近地區(qū)發(fā)生口蹄疫，應(yīng)對(duì)疫點(diǎn)周?chē)囊赘袆?dòng)物進(jìn)行免疫預(yù)防。（2）關(guān)閉動(dòng)物交易市場(chǎng)。（3）在交通要道設(shè)立檢查站，禁止從疫區(qū)運(yùn)進(jìn)易感動(dòng)物及產(chǎn)品。（4）受威脅的地區(qū)要管好畜群，不使其與病畜接觸。（5）防止各種媒介和傳播渠道傳入疫情。（6）建立疫病檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)，有利于早、快、嚴(yán)、小消滅疫情。（二）撲滅口蹄疫的措施1撲殺全部病畜和同群牲畜。2緊急屠宰疫區(qū)病畜，但不銷(xiāo)毀，無(wú)害化處理后使用，在疫區(qū)周?chē)鷮?shí)施免疫注射。該方法在落后地區(qū)使用較多。3第三種辦法是對(duì)疫區(qū)實(shí)行嚴(yán)格的封鎖政策。這是常用的方法，特別是疫情擴(kuò)散后，采用該法。我國(guó)采用的是綜合防制的方法。（三）免疫預(yù)防預(yù)防接種是防制口蹄疫的有效方法。目前使用的是O+A型的油乳劑滅活疫苗。家畜斷奶后免疫，一月后加強(qiáng)免疫，可保護(hù)半年。但新疆已出現(xiàn)亞洲1型口蹄疫，且有擴(kuò)散趨勢(shì)。（三）免疫預(yù)防預(yù)防接種是防制口蹄疫的有效方法。目前使用的是O+A型的油乳劑滅活疫苗。家畜斷奶后免疫，一月后加強(qiáng)免疫，可保護(hù)半年。但新疆已出現(xiàn)亞洲1型口蹄疫，且有擴(kuò)散趨勢(shì)。

在國(guó)內(nèi)目前生產(chǎn)口蹄疫滅活疫苗的生產(chǎn)企業(yè)有六家，分別是中牧股份蘭州生物藥品廠、蘭州獸醫(yī)研究所中農(nóng)威特公司、金宇保靈生物藥品有限公司、新疆天康畜牧科技有限公司、乾元浩保山疫苗廠及上海申聯(lián)生物制品有限公司。其中上海申聯(lián)生物制品有限公司目前僅生產(chǎn)豬口蹄疫合成肽疫苗。已注冊(cè)用于生產(chǎn)豬口蹄疫滅活疫苗毒種主要有：