細胞骨架組分的熒光染色觀察

細胞生物學實驗報告細胞骨架組分的熒光染色觀察姓名:學號:班級:專業(yè):同組成員:一、實驗原理鬼筆環(huán)肽(phalloidin)是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細胞松弛素的作用相反，只與聚合的微絲結合，而不與肌動蛋白單體分子結合。它同聚合的微絲結合后，抑制了微絲的解體，因而破壞了微絲的聚合和解聚的動態(tài)平衡。由于鬼筆環(huán)肽非常特異地結合并穩(wěn)定聚合態(tài)肌動蛋白，因而對肌動蛋白的動態(tài)平衡造成嚴重影響.此外，較高濃度的鬼筆環(huán)肽對細胞有毒害作用。因此，用鬼筆環(huán)肽標記微絲并不是用于研究活體細胞的理想方法。二、 實驗目的1.掌握細胞骨架的顯示方法掌握熒光顯微鏡的使用方法了解熒光顯微鏡下細胞骨架的基本形態(tài)結構三、 實驗器材材料：CHO(中國倉鼠卵巢細胞)、雞胚成纖維細胞試劑：PEM：50mMpipes(pH6.9),5mMEGTA,5mMMgSO4,0.225M山梨醇0.5%TritonX-100溶于PEM緩沖液。4%多聚甲醛溶于PEM緩沖液。儀器超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡其它用品：蓋玻片(無菌)、35mm細胞培養(yǎng)皿、試管、移液管，滴管，酒精燈、75%酒精棉球、廢液缸。四、 方法與步驟由于上節(jié)課雞胚成纖維細胞被污染，本次實驗所用細胞為CHO細胞準備好實驗器材。(本次實驗無需在超凈臺中進行)將上節(jié)課進行細胞爬片的培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，取出蓋片，于小平皿中。37°C預溫PEM洗3次(每次1mL)TritonX-100處理約10min(1mL)37°C預溫PEM洗3次(每次1mL)37C預溫4%多聚甲醛固定細胞15min(1mL)37C預溫PEM洗3次55nMAlex-phalloidin10UL濕盒中室溫染色30min。(避光)在parafilm膜上加PEM，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片。37C預溫PEM洗數(shù)3次，滴加10叱Ho.33342復染色。熒光顯微鏡下觀察并拍照。五、注意事項蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕。注意不要弄碎蓋片，分清細胞所在面；各步洗細胞要輕，勿使細胞脫落；熒光觀察注意避光操作，防止熒光淬滅。節(jié)約試劑。六、實驗結果本次實驗我們對CHO細胞爬片結果進行了熒光染色，在熒光顯鏡下用不同波長的激發(fā)光

對細胞骨架微絲結構及細胞核進行了觀察、拍攝照片并將結果疊加。得到以下的實驗現(xiàn)象:圖1.CHO細胞微絲熒光染色圖

圖2.CHO細胞核熒光染色圖圖3.CHO細胞微絲及細胞核熒光染色合成圖從拍攝的照片可以較為清晰的看到CHO細胞骨架的微絲被染成了綠色，細胞核被染成藍色；微絲的形狀為長條的紡錘狀細絲，遍布整個細胞，在細胞中起到了類似骨架般的支撐作用；細胞核為橢圓形，之后再將兩圖合成，可觀察到細胞核被遍布的微絲結構包圍。實驗較為成功。在實驗時要注意熒光染料均存在淬滅問題，所以要盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。每步洗滌要充分，并吸去水分（但也不要干透），以免稀釋下一步的抗體或試劑，這樣才能得到清晰的熒光圖像?！緟⒖嘉墨I】桑建利，譚信.細胞生