elisa實驗ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定Enzyme-簡稱它繼

ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱。它是繼免疫熒光(一)ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法(a)、用于檢測抗體夾心法及ELISA間接法。(二)方法一用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗33分鐘。加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，對照孔及陽性對照孔)。℃孵0.5～1小時，洗滌加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，3710～30結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，反應為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的對照OD值的2.1倍，即為陽性。用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。↓加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、及陽性孔對照)↓37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW↓(三)試包被緩沖液(PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液): 1.59克 2.93加蒸餾水至洗滌緩沖液(PH7.4 0.2 2.9 8.0 0.2Tween-200.05％加蒸餾水至牛白蛋白(BSA)0.1克加洗滌緩沖液至100ml或以羊、兔等與洗滌液配成5～10％使用終止液(2M底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):0.2MNa２HPO４(28.4克／L25.7ml0.1M檸檬酸(19.2克 TMB(10mg／5ml無水乙醇)0.5ml ABTS使用液 正常人和陽性對照聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl100μl加樣器，塑料滴頭，(四)正式試驗時，應分別以陽性對照與對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊、兔或BSA等封閉。在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前（2）包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.010μg／ml等)進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的作用，應注意防護。有條件者應使用不、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意