中藥飼料添加劑調(diào)控仔豬腸道微生態(tài)平衡研究進(jìn)展

中藥飼料添加劑調(diào)控仔豬腸道微生態(tài)平衡研究進(jìn)展孔祥峰，印遇龍中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所畜禽健康養(yǎng)殖研究中心2010.10.17報(bào)告提綱

中藥飼料添加劑介紹腸道菌群的功能腸道菌群發(fā)育規(guī)律中草藥功效與腸道菌群腸道菌群的中草藥飼料添加劑調(diào)控中藥飼料添加劑介紹概念：中藥飼料添加劑，顧名思義就是以中藥為原料制成的飼料添加劑。分類：從營養(yǎng)角度可將飼料添加劑分為營養(yǎng)性和非營養(yǎng)性飼料添加劑兩大類。由于中藥含有多種有效成分，兼有營養(yǎng)和藥用功能，基本具備飼料添加劑的所有作用，可作為一類獨(dú)立的飼料添加劑。特性：中藥多為復(fù)雜的有機(jī)物，其組成成分均在數(shù)十種，甚至達(dá)到上百種，按照“構(gòu)效關(guān)系”理論（即一種成分可產(chǎn)生一種作用）來說，中藥具有“多能性”。中藥飼料添加劑的分類

鑒于中藥飼料添加劑的特殊性，目前尚無統(tǒng)一的分類標(biāo)準(zhǔn)。一般按照藥材來源、原料類型、產(chǎn)品作用、組方和劑型進(jìn)行分類。按藥材來源：分為植物類（山楂、黃芪等）、動物類（雞內(nèi)金、地龍等）、礦物類（麥飯石等）和化合物類。按原料類型：分為原產(chǎn)物、加工提取物（刺五加提取物、黃芪多糖等）和副產(chǎn)物（黨參莖葉、人參渣、沙棘果渣等）。按照劑型：分為常規(guī)散劑、復(fù)方提取物粉劑和顆粒劑、超微粉等劑型。目前常用的中藥飼料添加劑是常規(guī)散劑。中藥飼料添加劑的分類按照組方：分為單味中藥提取物、單味中藥、復(fù)方中藥和中西藥結(jié)合飼料添加劑。目前一般使用的是復(fù)方中藥添加劑，即在中獸醫(yī)理論指導(dǎo)下，依據(jù)君臣佐使的法則遣方用藥，以發(fā)揮其群藥的綜合作用。按產(chǎn)品作用：分為防病保健(增強(qiáng)免疫、抗菌驅(qū)蟲、健胃消食、養(yǎng)血滋陰、清熱解毒、安神行氣)、增加生產(chǎn)性能(主要用于促生長、促生殖、提高肉、蛋、奶及經(jīng)濟(jì)動物產(chǎn)品產(chǎn)量)、提高產(chǎn)品質(zhì)量(如用姜黃素改善雞蛋品質(zhì)，用紅辣椒、萬壽菊等改善肉雞的肉品質(zhì))和改善飼料品質(zhì)(如用大蒜素刺激動物食欲、延長飼料貯存期)等四類。

生物拮抗免疫功能營養(yǎng)功能胃腸道菌群有益作用維生素的合成與代謝蛋白質(zhì)合成與氮代謝多糖和粗纖維分解代謝脂類的分解代謝胃腸道菌群的功能胃腸道菌群的有害作用BECDA增加免疫成本競爭營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生有害氨基酸代謝物改變腸道的結(jié)構(gòu)與功能降低脂肪的消化率胃腸道菌群的功能實(shí)驗(yàn)動物：1、7、14、21和28日齡的哺乳仔豬各6頭。樣品采集：取空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物，提細(xì)菌DNA。試驗(yàn)方法與測定指標(biāo)：PCR-DGGE技術(shù)比較腸道菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性，Real-timePCR方法定量腸道優(yōu)勢菌群。哺乳仔豬腸道菌群發(fā)育規(guī)律研究細(xì)菌引物序列產(chǎn)物大小乳酸桿菌Lab-0159Univ-05155’-AAGATGCAGCTCTTGTGTTG-3’5’-ATCGTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3’356bp雙歧桿菌Bif-xfp-2294-fBif-xfp-2691-r5’-ACCAAGGTCAACCTCCTCTCTG-3’5’-TGCCCAGATTCAGCAAAGTCC-3’397bp腸桿菌F-entR-ent5’-ATGGCTGTCGTCAGCTCGT-3’5’-CCTACTTCTTTTGCAACCCACTC-3’300bp鏈球菌16S-19516S-4895’-CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT-3’5’-GTAAGATACCGTCAAGTGAGAA-3’294bp試驗(yàn)結(jié)果隨日齡增加，腸道菌群結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜多樣，且腸道后段菌群多樣性高于腸道前段；每一仔豬個(gè)體都有自己獨(dú)特的腸道微生物組成，日齡越小，不同個(gè)體間菌群差異越小。盲腸微生物DGGE圖譜結(jié)腸微生物DGGE圖譜回腸微生物DGGE圖譜試驗(yàn)結(jié)果1～7日齡仔豬胃腸道內(nèi)乳酸菌、鏈球菌和腸桿菌占細(xì)菌總數(shù)的比例較高，出生1周后乳酸桿菌豐度降低，雙歧桿菌等厭氧菌開始成為腸道優(yōu)勢菌，14天后空腸和回腸鏈球菌豐度增加。

運(yùn)用基于16SrDNA克隆文庫技術(shù)構(gòu)建了3個(gè)克隆文庫并測序分析，共得到536條非嵌合的16SrDNA全長序列。根據(jù)99%的序列相似性劃分為157個(gè)進(jìn)化型，其中主要的優(yōu)勢菌群在系統(tǒng)發(fā)育地位上基本屬于乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、羅氏菌屬、梭菌屬和葡萄球菌屬。其中21和28日齡哺乳仔豬以及21日齡斷奶后1周仔豬分別測序了171、194和171個(gè)克隆，各自劃分為40、61和56個(gè)OTUs。

哺乳和斷奶仔豬回腸微生物發(fā)育樹哺乳仔豬斷奶仔豬斷奶對仔豬胃腸道菌群發(fā)育規(guī)律的影響

發(fā)現(xiàn)斷奶應(yīng)激使仔豬腸道鏈球菌屬增加23%，乳酸桿菌屬降低36%，腸道菌群失調(diào)是引起腹瀉的主要原因。88%52%3.5%26.3%斷奶對仔豬回腸優(yōu)勢微生物的影響斷奶對仔豬胃腸道菌群發(fā)育規(guī)律的影響中草藥功效與胃腸道菌群中醫(yī)用藥的特色之一就是以湯劑的形式口服用藥。湯劑在發(fā)揮藥效作用前，除了在炮制、煎煮過程中會產(chǎn)生動態(tài)變化外，進(jìn)入機(jī)體后亦要發(fā)生一系列的動態(tài)變化。這種變化的第一個(gè)過程就是在消化道內(nèi)被消化液和腸內(nèi)細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化和/代謝。藥物在消化道內(nèi)的行為包括：調(diào)節(jié)腸內(nèi)微生態(tài)，引發(fā)生物活性物質(zhì)如雙歧因子分泌，產(chǎn)生生物效應(yīng)；破壞腸內(nèi)微生態(tài)平衡而促進(jìn)新的平衡系統(tǒng)建立。由此可見，腸內(nèi)細(xì)菌對中藥成分結(jié)構(gòu)的生物轉(zhuǎn)化和/代謝在中藥藥效上起著重要的作用。中草藥功效與胃腸道菌群利用中藥成分的腸內(nèi)細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化和/代謝模型體外研究中藥成分在腸內(nèi)是如何被細(xì)菌轉(zhuǎn)化和代謝的，更接近于真實(shí)情況，對揭示中藥作用機(jī)制具有十分重要的意義?！笆晃濉眹铱萍贾斡?jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目“中獸藥現(xiàn)代化技術(shù)研究與開發(fā)”的部分內(nèi)容：依據(jù)生物體內(nèi)藥物代謝轉(zhuǎn)化機(jī)理，利用益生菌和發(fā)酵技術(shù)，提高中藥有效部分的生物活性，增加其產(chǎn)量；利用中藥與益生菌間的相互作用，提高菌、藥生物學(xué)效應(yīng)，改善其生物利用度。胃腸道菌群的中草藥飼料添加劑調(diào)控實(shí)驗(yàn)動物和分組：60頭21日齡斷奶仔豬，隨機(jī)分為3組，每組20重復(fù)。處理1添加0.1%刺五加提取物，處理2添加0.02％粘桿菌素，處理3為基礎(chǔ)日糧。樣品采集：分別于試驗(yàn)開始后第7、14和28d從各處理隨機(jī)選取5頭試豬，處死后取空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物，提取細(xì)菌DNA。試驗(yàn)方法與測定指標(biāo)：體外培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)大腸桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量，PCR-DGGE技術(shù)比較腸道菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性。試驗(yàn)結(jié)果細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果表明，21日齡斷奶仔豬日糧中添加刺五加提取物，可顯著抑制腸道中大腸桿菌增殖，促進(jìn)乳酸桿菌生長，有益于斷奶仔豬的腸道健康。大腸桿菌空腸5.335±0.176c5.735±0.114b5.971±0.146a回腸5.791±0.052c6.168±0.104b6.431±0.099a盲腸5.778±0.048b6.173±0.062a6.105±0.098a乳酸桿菌空腸7.286±0.124a6.996±0.096b6.835±0.474b回腸7.859±0.105a7.574±0.072b7.520±0.084b盲腸7.661±0.077a7.698±0.096a7.547±0.088b刺五加提取物對斷奶仔豬腸道內(nèi)容物細(xì)菌數(shù)量的影響(LgCFU/g,n=5)abb腹瀉率(%)刺五加提取物對腹瀉率的影響試驗(yàn)結(jié)果添加后第7、14和28d時(shí)，提取物組盲腸內(nèi)容物細(xì)菌種類較對照組多，第28d時(shí)空腸內(nèi)容物細(xì)菌種類比對照組多；3個(gè)處理間各腸段內(nèi)容物細(xì)菌種類的相似性均達(dá)56.9%以上。提示刺五加提取物能顯著增加腸道微生物的多樣性，這是其防治斷奶仔豬腹瀉、促進(jìn)生長的機(jī)理之一。添加后第7d添加后第14d添加后第28d山藥多糖對微生物發(fā)酵的調(diào)控作用研究目的：評價(jià)分段醇沉得到的4個(gè)山藥多糖的體外發(fā)酵特性及其對腸道微生態(tài)的影響，探討其用做飼料添加劑的可行性。采用體外發(fā)酵技術(shù)評價(jià)4個(gè)山藥多糖對盲腸食糜的體外發(fā)酵特性和發(fā)酵產(chǎn)物的影響；利用PCR-DGGE技術(shù)比較腸道菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性。實(shí)驗(yàn)動物及分組：40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，單籠飼養(yǎng)。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧。處理組(II組、III組和IV組)分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.25、0.5和1.0g/kg60%醇沉山藥多糖。處死后取空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物，提取細(xì)菌DNA，測定腸道微生物和揮發(fā)酸的變化。試驗(yàn)結(jié)果處理pH值NH3（mg/dl）30%醇沉多糖組6.72±0.13B20.00±0.42B45%醇沉多糖組5.83±0.12D6.55±0.76C60%醇沉多糖組5.78±0.22D3.97±0.24D75%醇沉多糖組6.17±0.11C3.83±0.37D葡萄糖對照組5.49±0.15D3.89±0.38D培養(yǎng)液對照組7.62±0.06A26.82±0.48A山藥多糖體外發(fā)酵模式圖發(fā)酵液的pH值和NH3含量（n＝4）75%醇沉多糖發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)最優(yōu)，并顯著優(yōu)于葡萄糖；45％、60％醇沉多糖和葡萄糖組pH值最低，60％、75％醇沉多糖和葡萄糖組NH3含量最低。提示60%和75%醇沉山藥多糖是2種理想的可被豬盲腸微生物利用的碳源，并可改變微生物產(chǎn)生的SCFA含量與組成。試驗(yàn)結(jié)果60%和75%醇沉山藥多糖是2種理想的可被盲腸微生物利用的碳源，并可改變盲腸微生態(tài)區(qū)系及產(chǎn)生的短鏈脂肪酸含量與組成。60%醇沉多糖發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)最優(yōu)60%和75%醇沉多糖組盲腸微生態(tài)具有很高的相似性，且特定菌種含量顯著提高，微生物種類減少1MARK2葡萄糖組3對照組475%多糖組560%多糖組645%多糖組730%多糖組盲腸微生物DGGE電泳圖譜試驗(yàn)結(jié)果時(shí)間處理乙酸丙酸丁酸pH值第1周對照組3.8±0.24B5.2±0.26B2.4±0.24B7.1±0.48AB0.25g/kg多糖組5.5±0.37A6.4±0.66A2.9±0.28A6.6±0.48B0.5g/kg多糖組5.2±0.26A5.4±0.35B2.9±0.31A6.5±0.26B1g/kg多糖組4.0±0.47B5.0±0.85B2.3±0.30B7.4±0.20A第3周對照組4.6±0.24C6.1±0.373.2±0.26A7.0±0.110.25g/kg多糖組5.8±0.34A6.8±0.753.5±0.62A7.2±0.140.5g/kg多糖組5.3±0.22B6.6±0.383.0±0.22AB7.6±0.331g/kg多糖組4.6±0.30C6.1±0.192.6±0.21B7.5±0.35盲腸短鏈脂肪酸含量(μmol/g；n＝4)

試驗(yàn)第1周0.25和0.5g/kg多糖組盲腸食糜乙酸和丁酸含量顯著高于對照組和1.0g/kg多糖組，0.25g/kg多糖組丙酸含量顯著高于其它組。試驗(yàn)第3周0.25g/kg多糖組乙酸含量顯著高于其它組。試驗(yàn)結(jié)果0.25g/kg的60%醇沉山藥多糖可被盲腸微生物利用，改變盲腸微生態(tài)區(qū)系及其產(chǎn)生的短鏈脂肪酸含量與組成。第1周盲腸微生物DGGE電泳圖譜

第3周盲腸微生物DGGE電泳圖譜

從左到右依次Mark(1，微生物DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶)、對照組(2～4)、0.25g/kg添加組(5～7)、0.5g/kg添加組(8～10)、1g/kg添加組(11～13)唾液乳酸桿菌枯草芽孢桿菌多糖組唾液乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌含量高于對照組，且隨試驗(yàn)期延長，各多糖組優(yōu)勢菌群數(shù)量增加，處理間各重復(fù)相似性提高。結(jié)束語中藥飼料添加劑具有毒副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，長期合理使用可避免藥物殘留問題，是一種綠色飼料添加劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。中藥是我國傳統(tǒng)文化遺產(chǎn)的一顆明珠，要創(chuàng)立具有中國特色的民族飼料工業(yè)，發(fā)展中藥飼料添加劑是必由之路。在面臨良好機(jī)遇的同時(shí)，又面臨一系列嚴(yán)峻挑戰(zhàn)和激烈競爭，中藥的質(zhì)量與安全等問題也十分突出。因此，依靠現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和創(chuàng)新手段，研究開發(fā)出功能確切、營養(yǎng)平衡、安全可靠、質(zhì)量