分子診斷領域的新技術和新產品

分子診斷領域的新技術和新產品

HRM概述什么是DNA的高分辨率熔解DNA高分辨率熔解的用途HRM技術優(yōu)勢小結HRM介紹基于熔解曲線的一種DNA分析技術分辨率可達單個堿基用于突變掃描、SNP分型等研究高通量、快速、低成本、操作簡單、閉管操作的新技術HRM概述概述什么是DNA的高分辨率熔解DNA高分辨率熔解的用途HRM技術優(yōu)勢小結SYBRGREENI對PCR擴增有抑制因此必需使用低濃度的染料SYBR?GreenI一些染料在熔解開始后可以重新定位非飽和態(tài)結合允許染料在熔解過程中發(fā)生重新定位，因而無法適用于HRMSYBRGREENI：非飽和染料用于HRM的新染料：SYTO9,EvaGreen,LCGreen等EvaGreen染料飽和后使其在熔解過程中沒有空位進行重組飽和染料抑制低高濃度可以使DNA達到飽和降低了染料位置重組的可能飽和染料檢測不受位點局限，既可針對已知位點，又可掃描未知位點無需序列特異性探針，檢測成本低操作簡便，PCR之后直接進行HRM分析真正實現(xiàn)閉管操作，PCR產物無需轉入其它分析裝置，直接在PCR管內分析快速、高通量、低成本，僅在普通PCR基礎上增加一個染料高分辨率熔解曲線特點概述什么是DNA的高分辨率熔解DNA高分辨率熔解的用途HRM技術優(yōu)勢小結SNP基因分型/等位基因區(qū)分突變發(fā)現(xiàn)/篩查/掃描物種鑒定HLA兼容性檢測胞嘧啶甲基化HRM的應用-舉例C12345678M病人8(GG)病人5(AA)病人1(AG)SNP基因分型/等位基因區(qū)分——基因分析SNPs在野生型DNA物種的背景下檢測出突變-靈敏度5%野生型發(fā)現(xiàn)未知突變189bp產物37%GC含量突變發(fā)現(xiàn)/篩查/掃描——

突變發(fā)現(xiàn)（體細胞突變）PeterMacCallumCancerCentreMelbourne野生型病人1335G->T病人2235G->T病人634G->T病人1838G->A差異視圖：突變檢測M.FlavescensM.AviumComplex2M.Avium26M.UlceransM.KanassiM.Tuberculosis生成自動分型報告物種鑒定——分支桿菌種屬鑒定金黃色葡萄球菌分型High-ResolutionMeltingAnalysisofthespaRepeatRegionofStaphylococcusaureus.ClinicalChemistry,54:2(2008)結論：“AnalysisofthespalocusbyHRMresolvesspasequencevariants.Thissingle-andclosed-tubesingle-stepmethodforS.aureusgenotypingcanbeeasilycombinedwiththeinterrogationofothergeneticmarkers.”20種HRM曲線重復性（灰色/黑色）2種不同基因型３組相似spa區(qū)比較20個探針SS測序母方的阿姨1病人父方阿姨母方阿姨1104關系GenericPCR-2天

X

X110404011143040311

042天病人母方阿姨12.5小時不匹配04010403HLA兼容性分析：姐姐07,13另2個哥哥07,13病人1303,1601哥哥1303,1601070113031601HLA兼容性分析：檢測胞嘧啶甲基化——MGMTHRM數(shù)據(jù)100%甲基化的50%甲基化的25%甲基化的12.5甲基化的3%甲基化的6%甲基化的未甲基化的Methylation-sensitivehighresolutionmelting(MS-HRM):anewapproachforsensitiveandhigh-throughputassessmentofmethylation,NucleicAcidsResearch,2007,35(6):e41檢測胞嘧啶甲基化——MGMT差異視圖100%甲基化的50%甲基化的25%甲基化的12.5%甲基化的6%甲基化的3%甲基化的溫度均一性（各樣本孔位溫度差異）——0.2℃以下溫度分辨率，即最小的升溫幅度——0.05℃以下快速的溫度平衡

精確、高效能的光源

溫度準確性HRM對PCR儀的要求溫度均一性（各樣本孔位溫度差異）——0.2℃以下RGQ——+0.01℃溫度分辨率，即最小的升溫幅度——0.05℃以下RGQ——0.02℃快速的溫度平衡RGQ——流動空氣精確、高效能的光源

RGQ——LED溫度準確性RGQ——+0.25℃凱杰RGQ對于HRM的響應什么是PCR儀的溫度均一性？溫度均一性會影響什么？溫度均一性就是儀器各孔位升降時溫度的一致性，溫度的一致性直接影響PCR的擴增效率溫度均一性直接決定定量結果的準確性和重復性定量PCR實驗一般都要40個循環(huán)，溫度的微小差異都會同步無限放大，影響結果的準確性和重復性擴增效率對結果的影響：國外權威文獻對PCR儀的溫度均一性的比較文獻標題：ExpandedInstrumentComparisonofAmpliconDNAMeltingAnalysisforMutationScanningandGenotyping.（PCR擴增儀器在DNA突變掃描及分型方面的比較）ClinicalChemistry53,No.8,2007（臨床化學雜志，2007）注：臨床化學雜志（美國）是當今臨床實驗室領域最主要和最權威的期刊，除了被引用次數(shù)最多之外，還擁有最高的化學（包括生物化學）影響因子。內容摘要：Results:Theabilityofmostinstrumentstoaccuratelygenotypesingle-basechangesbyampliconmeltingwaslimitedbyspatialtemperaturevariationacrosstheplate(SDofTm0.020to0.264°C).Othervariablessuchasdatadensity,signal-to-noiseratio,andmeltingratealsoaffectedheterozygotescanning.大多數(shù)儀器由于板式加熱的板內溫度差異的問題限制了其通過熔解曲線分析單堿基差異的準確性。

air-basedinstrumentsandinstrumentswithindividualsampletemperaturecontrolhavelowerTmSDs(0.018–0.065)thantheirheat-blockcounterparts(0.092–0.274).BlocksystemswiththermalelectricheatershadlowerTmSDs(0.092–0.102)thenPeltier-basedsystems(0.117–0.274).基于空氣加熱的儀器的孔間溫度差異最小(0.018–0.065度)

Therefore,genotypingbyTm(determinedasthetemperatureat50%ofthenormalizedfluorescence)isstraightforwardandhasanaccuracydirectlycorrelatedtotemperaturehomogeneity.

因此由熔解曲線分析基因型的方法簡單直接，其準確性直接與溫度均一性（孔間溫度差異）相關。常規(guī)孔板式PCR儀的溫度均一性（精確性）96孔板內溫度差異±0.50℃（或更高）

(由此，>1.00℃的差異很常見)邊緣和四角的樣品所受的影響最顯著注意：熒光強度

1/Temp半導體模塊易損壞/耗，而出現(xiàn)“熱點”Rotor-Gene不使用半導體，因為半導體的損壞很難預測，且維修昂貴注意：Rotor-GeneQ的參數(shù)：均一性：±0.01℃，分辨率：±0.02℃冷空氣吸入離心風扇將空氣吸入倉內離心風扇促進空氣在倉內循環(huán)倉蓋打開以排出熱空氣降溫原理加熱元件關閉注意：轉子中間的孔是為了空氣均一流動設計的Rotor-GeneQ的升降溫方式——空氣加熱，離心式孔板式加熱與空氣加熱的比較孔板式加熱空氣加熱Thermalunit孔板式典型光學系統(tǒng)中心強度高于邊緣，需要加入ROX內參照來校正光強度頂部光路激發(fā)：光強度不一致問題離心式光學部分的3D動畫LEDlightsource(rotatesforeachchannel)rotorspinstubesat400rpmlensfilterset(rotatesforeachchannel)sensitivePMT(photomultiplier)detectorRotor-GeneQ的光路結構400rpm勻速離心，各樣品溫度完全一致，擴增效率均一溫度均一性：±0.01℃溫度均一性升降溫速度：最大速率>10℃/秒溫度分辨率：±0.02℃平衡時間：無需無需光路系統(tǒng)校正，無需ROX校正染料高度穩(wěn)定的LED光源終身質保，沒有昂貴的光源需要更換，沒有光強緩慢的衰減Rotor-GeneQ的溫度、光學表現(xiàn)真正勝任高分辨熔解曲線，即使是第四類SNPSanger測序：經典方法，基于末端終止法的毛細管電泳新一代測序：基于合成的實時測序焦磷酸測序（凱杰）：定量測序，短片段，針對臨床設計，靈活/快速/簡單/經濟，另有EGFR/KRAS/BRAF等成品試劑盒454測序：基因組全長測序，上千萬個堿基測序Illumna：基因組全長測序，上千萬個堿基測序SOLID：基因組全長測序，上千萬個堿基測序測序技術及平臺簡介新一代

基因定量測序系統(tǒng)

－焦磷酸測序

焦磷酸測序的特點新一代測序技術：基于實時合成技術的測序方式高精度定量分析：測序的同時，能夠得到基因突變比例的定量數(shù)據(jù)，定量精度達到1％～5％簡單快捷：專門針對臨床設計的短片段測序，整個實驗流程只有三步4小時內完成（24個樣本），96個樣本測序只需要5～6小時，當天下午就能夠出診斷結果靈活：通量靈活（樣本數(shù)量隨意，無需積攢樣本）應用種類靈活（一次實驗可以做多種測序）可以使用凱杰的成品檢測試劑；也可以自己研發(fā)試劑，只要針對分析的序列，設計相應的引物，輕松實現(xiàn)轉化醫(yī)學經濟：無需昂貴的開機試劑費用，成本與樣本數(shù)量一致自己研發(fā)的試劑，只需要較低的基礎運行成本

焦磷酸測序原理焦磷酸測序流程焦磷酸測序的應用及舉例焦磷酸測序設備小結焦磷酸測序技術介紹第一步：加入測序引物和試劑第二步:每次加入一種dNTP，如果結合，則產生一個焦磷酸（PPi）第三步：硫酸化酶轉化PPi為ATP，ATP使熒光素酶發(fā)出熒光(產生的光強度與結合的核苷數(shù)量成正比)第四步：多余的dNTP被降解，開始新一個循環(huán)主要特點：基于實時測序技術的檢測和定量lighttime

焦磷酸測序原理焦磷酸測序流程焦磷酸測序的應用及舉例焦磷酸測序設備小結檢測設計

測序樣本準備

Pyro測序1~2h~30min~10min

PCR擴增Regionofinterestisamplifiedwithtwoprimers–oneprimermustbebiotinylated.(~100-300bp)重要的部分是兩條引物的擴增－一條引物必須很小usingstreptavidin-coatedbeads.分離成單鏈DNAAnnealingofsequencingprimer.測序引物退火

Sequencing-by-synthesis.Sequencedatageneratedfromthefirstbasenexttothesequencingprimer.基于合成的測序。第一個測得的堿基是緊挨著測序引物的。Sequencecontextasbuiltincontrol

PyroMarkAssayDesignSoftware2.0–設計PCR和Pyro引物最簡單和可靠的方法焦磷酸測序流程PCR試樣預處理，獲得單鏈模板測序10min/24sampleSQA:35min/24sampleSNP:10min/24sample1-2h/96sample實驗設計結果分析焦磷酸測序流程

焦磷酸測序原理焦磷酸測序流程焦磷酸測序的應用及舉例焦磷酸測序設備小結Pyrosequencing（焦磷酸測序）

三種焦磷酸測序的應用

基因檢測：個性化治療，靶向治療表觀遺傳學微生物為什么要個體化醫(yī)療？－－藥物并非人人有效QuelleBrianB.Spear,MargoHeath-Chiozzi,JeffreyHuff,“ClinicalTrendsinMolecularMedicine,Volume7,Issue5,1May2001,Pages201-204抗抑郁藥哮喘藥糖尿病關節(jié)炎老年性癡呆腫瘤62%60%57%50%30%25%藥物效果=無效對A是特效藥，對B可能不是所有服用易瑞沙、特羅凱的患者必須檢測EGFR基因??！所有晚期非小細胞肺癌患者，都有檢測EGFR基因的指證。EGFR突變的預測作用已明確，攜帶這些突變基因的患者對吉非替尼（易瑞沙）或厄洛替尼（特羅凱）的反應明顯較佳。國內外大型臨床試驗研究（如IPASS、SLCG等）均已證明，吉非替尼或厄洛替尼用于晚期肺癌EGFR突變型患者，可明顯使其病灶縮小，生存期延長，還可用于一線治療降低死亡風險率。結直腸癌患者使用靶向藥物（愛比妥）等必須做KRAS基因檢測！

2008年6月,在美國臨床腫瘤學會(ASCO)年會上CRYSTAL、OPUS等研究表明KRAS基因狀態(tài)與表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑療效之間的關系逐漸明朗；10月,KRAS基因檢測被寫入最新版(2008年第3版)《美國國立癌癥綜合網絡(NCCN)結直腸癌臨床實踐指南》。

新指南傳遞給廣大醫(yī)師和患者這樣兩條重要的信息,一是所有轉移性結直腸癌患者都應檢測KRAS基因狀態(tài),二是只有KRAS野生型患者才建議接受EGFR抑制劑如西妥昔單抗和帕尼單抗(包括單藥或與化療聯(lián)合)治療。

KRAS基因是野生型還是突變型,使傳統(tǒng)意義上的一種疾病被分成兩種獨立的疾病。KRAS突變型結直腸癌患者約占40%,這類患者不能從抗EGFR治療中獲益,反而徒增不良反應危險和治療費用。而其余60%左右的KRAS野生型患者就很有可能從這類藥物治療中獲益。

在美國胃腸病學會（AGA）2008年1月份舉行的會議上，有研究評估發(fā)現(xiàn)，進行常規(guī)KRAS基因檢測，可為美國醫(yī)療保障體系節(jié)省6.04億美元。KRAS突變突變檢測已知和未知位點點突變多重突變插入/缺失SNP分析二，三和四等位基因SNPs多重SNPs

等位基因定量

SNP發(fā)生率二，三和四等位基因突變基因檢測

PyroMark–多種基因分析的技術平臺基因檢測

KRAS突變狀況的重要性抑制細胞增殖和生存EGFR成為癌癥治療的一個重要靶體:抗-EGFR抗體用于結直腸癌治療(CRC):Erbitux?

(Imclone),Vectibix?

(Amgen)成功的抗EGFR治療阻止細胞增殖和生存

EGFRKRAS細胞生長因子細胞膜單克隆抗體

Cetuximab

(Erbitux)西妥昔單抗Panitumumab(Vectibix)帕尼單抗YEGFRKRAS生長因子

細胞膜單克隆抗體Cetuximab(Erbitux)西妥昔單抗Panitumumab(Vectibix)帕尼單抗Y抑制細胞增殖和生存KRAS基因突變致使細胞內KRAS蛋白持續(xù)活躍從而導致對抗-EGFR抗體產生耐藥KRAS基因突變是復雜且多位置的突變最常見的KRAS活動性突變發(fā)生在12,13和61密碼子腫瘤細胞KRAS基因的狀況可以作為預后的指針和預測特定藥物的臨床應答基因檢測

KRAS突變狀況的重要性抑制細胞增殖和生存EGFR成為癌癥治療的一個重要靶體:抗-EGFR抗體用于結直腸癌治療(CRC):Erbitux?

(Imclone),Vectibix?

(Amgen)成功的抗EGFR治療阻止細胞增殖和生存

EGFRKRAS生長因子細胞膜單克隆抗體

Cetuximab

(Erbitux)西妥昔單抗Panitumumab(Vectibix)帕尼單抗YCodon61FPFPBSeqRPBRPSeqGGTGGCGTAGGTCCAGTTCTCCodon12&13ReverseassaydesignForwardassaydesign靈活的設計使我們可以在一個反應中方便的分析連續(xù)多個突變位點FPorFPB=forwardPCRprimerRPorRPB=reversePCRprimerB=biotinylatedSeq=sequencingprimerPyroMarkKRASAssayDesign密碼子GGTGGCTGTAGCCGTCGCAGTTGCGTTGACGCTGTCGAT1213CAAAAAGAACGACCACTACACCAT61野生型

主要突變發(fā)生在KRAS基因的12,13和61密碼子

野生型KRAS突變型KRAS密碼子12密碼子12突變:GGT>GATPyrosequencing（焦磷酸測序）技術提供序列信息和定量結果用于所有主要KRAS基因突變的敏感檢測密碼子GGTGGCTGTAGCCGTCGCAGTTGCGTTGACGCTGTCGAT1213CAAAAAGAACGACCACTACACCAT61野生型

Sequencetoanalyze:GGTGGCGTAGG主要突變發(fā)生在KRAS基因的12,13和61密碼子

舉例分析：密碼子12上第2個堿基PyroMarkKRAS試劑

定量結果和序列信息A:44%C:0%G:56%T:0%A:1%G:99%EESSTTAACCGGAACCTTCCAAGGAATTGGCCGGTTAAGG0100200Codon12mutation:GGTGATA:0%C:0%G:100%T:0%A:40%G:60%EESSTTAACCGGAACCTTCCAAGGAATTGGCCGGTTAAGG0100200300Codon13mutation:GGCGACA:0%C:0%G:100%T:0%A:0%G:100%EESSTTAACCGGAACCTTCCAAGGAATTGGCCGGTTAAGG050100150wtK-RasPatientno.4Patientno.5Patientno.6Sequencetoanalyze:GGTGGCGTAGGDataprovidedbyDrMagnusSundstrom,UppsalaUniversityHospital,Sweden密碼子12/13發(fā)生變異的病人結果13密碼子1％突變（GGCGAC)Pyrosequencing（焦磷酸測序）

三種焦磷酸測序的應用

基因檢測表觀遺傳學微生物表觀遺傳學

DNA甲基化DNA甲基化

CpG二核苷酸的胞嘧啶被添加了一個甲基基團過程可逆CpG島富含CpG二核苷酸:每10個核苷就有1個CpGCpG島主要位于基因的啟動子區(qū)域CpG島存在于的60％人類基因啟動子中功能DNA甲基化可引起基因的失活人類70-80%的CpGs被甲基化大多數(shù)沒有被甲基化的CpGs位于基因的調控區(qū)癌癥相關高度甲基化和腫瘤抑制基因的失活低甲基化和至癌基因的激活(e.g.K-ras,C-myc)Pyrosequencing對于DNA甲基化的分析

對于CpG位點有始終如一的精確Pyrosequencing能測定鄰近CpG區(qū)域的單個甲基化水平，甚至包括測序的引物區(qū)域Pos.1Pos.2Pos.3

Pos.4Pos.5

Pos.6

Pos.7

Pos.8Pos.9Pos.10MGMTgenePyrosequencing（焦磷酸測序）

三種焦磷酸測序的應用

基因檢測表觀遺傳學微生物Pyrosequencing對于微生物的鑒定

應用微生物鑒定細菌/病毒/真菌鑒定微生物分型（乙肝分型、丙肝分型）

舉例：廣譜類:16S細菌,普通的真菌Panel-based:腦膜炎,念珠菌,革蘭氏陽性菌,分支桿菌不同種屬:e.g.幽門螺桿菌（H.Pylori）,副百日咳菌/百日咳桿菌（Bordetellaparapertussis/pertussis;）單核增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）不同亞型:e.g.炭疽芽胞桿菌,結核分支桿菌,淋球菌耐藥檢測舉例H3N2耐藥突變監(jiān)測H1N1耐藥利福平耐藥腸球菌的利奈唑酮耐藥乙肝耐藥突變（如YMDD突變)Pyrosequencing對于微生物鑒定

16S細菌16S基因內序列特異性區(qū)域正向PCR引物反向PCR引物測序引物舉例：1個常用的靶基因－－

16S

基因所有引物都設計在保守區(qū)域測序引物設計在保守區(qū)，在可變區(qū)的上游Pyrosequencing對于微生物的鑒定

應用微生物鑒定細菌/病毒/真菌鑒定微生物分型

舉例：廣譜類:16S細菌,普通的真菌Panel-based