韓麗晶-微生物的實驗室培養(yǎng)

一、微生物的利用1．進行微生物的分離與培養(yǎng)

技能性獨立操作水平（ⅡA）實驗：大腸桿菌的實驗室培養(yǎng)（可行）鎖定：（1）培養(yǎng)基的配比與制作（2）無菌技術（3）接種之平板劃線操作（4）菌落觀察專題2微生物的培養(yǎng)與應用課題1微生物的實驗室培養(yǎng)專題重點：

①無菌技術的操作。②對土樣的選取和選擇培養(yǎng)基的配制。③從土壤中分離分解纖維素的微生物。

專題難點：

①無菌技術的操作。②對分解尿素的細菌的計數(shù)。③從土壤中分離分解纖維素的微生物。微生物的實驗室培養(yǎng)條件：（1）合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件（2）確保其他微生物無法混入1.何為培養(yǎng)基？3.不同的培養(yǎng)基有不同的配方，但是其基本成分都相同，都包括哪些營養(yǎng)元素？有何作用？請舉例說明。閱讀教材P14~15相關內(nèi)容，回答以下問題：2.按照不同的培養(yǎng)基劃分標準，培養(yǎng)基有哪些種類、配制特點及其應用？一、培養(yǎng)基：為人工培養(yǎng)微生物而制備的、提供適合微生物生長、繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。（1）按物理狀態(tài)來分：液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。（2）按成分來分：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基。（3）按用途來分：選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基。二、培養(yǎng)基的類型液體培養(yǎng)基表面生長均勻混濁生長沉淀生長（1）按物理狀態(tài)來分：固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：

主要用于工業(yè)生產(chǎn)；固體培養(yǎng)基：

主要用于微生物分離、鑒定、計數(shù)等；半固體培養(yǎng)基：

主要用于觀察、保藏菌種?！顬槭裁丛诠I(yè)生產(chǎn)中常用液體培養(yǎng)基？液體培養(yǎng)基特點：營養(yǎng)物質(zhì)分布均勻，與菌體表面接觸充分，因此適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中。（2）按成分來分：天然培養(yǎng)基化學成分不明確，主要用于工業(yè)生產(chǎn)；合成培養(yǎng)基化學成分明確，主要用于分類、鑒定。優(yōu)點：取材便利、營養(yǎng)豐富、配制簡便；缺點：營養(yǎng)成分難以控制、實驗結果的重復性較差。優(yōu)點：化學成分及其含量明確、實驗的可重復性好；缺點：配制繁瑣、成本較高。合成培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基如培養(yǎng)細菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。（3）按功能來分：選擇培養(yǎng)基加某種化學物質(zhì)，從眾多微生物中分離所需的微生物。鑒別培養(yǎng)基加某種試劑或化學物質(zhì)，鑒別不同種類的微生物。（如伊紅—美藍培養(yǎng)基可鑒別大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物有機酸與伊紅—美藍結合，使菌落呈現(xiàn)深紫色略帶金屬光澤）☆選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基：

分離酵母菌、霉菌等真菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基：

分離自養(yǎng)型微生物固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿的來歷

分離培養(yǎng)微生物，離不開固體培養(yǎng)基。在微生物實驗室里，固體培養(yǎng)基的使用是如此地頻繁和常規(guī)，以至于這一方法看起來也理所當然。然而，回溯至1881年固體培養(yǎng)基出現(xiàn)以前，微生物的培養(yǎng)還只能在液體培養(yǎng)基中進行。為了能直接觀察培養(yǎng)物的形態(tài)及生長情況，科學家希望能將微生物培養(yǎng)在固體表面上，就像微生物生長在橘子皮或土豆上一樣。德國醫(yī)生羅伯特·科赫（Robert·Koch，1843—1910）曾用煮沸消毒的土豆來培養(yǎng)細菌。此后，他試著用明膠作培養(yǎng)基的凝固劑。他將明膠加入液體培養(yǎng)基中進行融化，然后將混合均勻的液體緩慢地倒在一塊玻璃板的表面。當明膠冷卻凝固后，就在玻璃板表面形成一層固體培養(yǎng)基。為了防止空氣中雜菌的污染，科赫還用玻璃罩將玻璃板與周圍環(huán)境隔離開來。但是，人們很快發(fā)現(xiàn)，明膠在20℃以上就變軟了，很難進行分離微生物的劃線操作。在溫度高于25℃時，明膠就液化了，而大多數(shù)細菌的培養(yǎng)溫度都不低于25℃?？坪盏耐耊alterHesse也為同樣的問題苦惱著。一次，Hesse的妻子Fannie建議丈夫試一試用瓊脂做凝固劑，因為Fannie用瓊脂做果凍做得不錯。Hesse采納了妻子的建議，發(fā)現(xiàn)瓊脂比明膠更適合做培養(yǎng)基的凝固劑。這個改進的方法很快就被大家采納。

1887年，RichardPetri發(fā)表了一篇短文，對Koch平板技術作了又一次的改進。Petri設計了一種圓形并帶有圍邊的雙盤，一個大，一個小。制作固體培養(yǎng)基時，將融化的培養(yǎng)基倒入小盤內(nèi)，然后再用大盤蓋在小盤上就可以了。這就是我們今天所使用的培養(yǎng)皿。

回顧歷史，我們可以看出，Koch的固體培養(yǎng)基的方法以及他對微生物學中純培養(yǎng)技術的重視，遠遠超過了其所在的醫(yī)學細菌學領域。他的發(fā)現(xiàn)為細菌分類學、遺傳學和其他相關學科的發(fā)展提供了極為重要的工具。三、培養(yǎng)基配制原則：

（1）目的要明確：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類，因為不同的微生物對培養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。（2）營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。（3）pH要適宜：各種微生物適宜生長的pH范圍不同。細菌pH為：6.5-7.5；放線菌pH為：7.5-8.5；

真菌pH為：5.0-6.0。成分：思考：各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都包括哪些成分？水、無機鹽、碳源、氮源、（生長因子）滿足微生物對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣的要求☆微生物正常代謝過程中pH會不會改變？

如何維持培養(yǎng)基中pH的相對恒定？

微生物在生長代謝過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的形成，往往會改變環(huán)境中的pH?？稍谂囵B(yǎng)基中加入緩沖劑，最常用的緩沖劑是K2HPO4/KH2PO4菌落：單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結構的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落C二.無菌技術思考：1.什么是無菌技術？包括哪些方面？2.無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？（P15旁欄思考）3.消毒和滅菌有何不同？4.常用的消毒和滅菌方法有哪些？無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)消毒的方法：4.常用的消毒與滅菌的方法1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)滅菌的方法：

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設計的。

判斷下列各項是否需要消毒或滅菌。如需要，選擇合適方法。（1）豆?jié){（2）游泳池（3）超凈工作臺（4）玻棒、試管、吸管、錐形瓶（5）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)皿（6）無菌水（7）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（8）接種環(huán)、接種針（9）實驗操作者的雙手接種環(huán)接種針涂布器二實驗操作（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基稱量溶化滅菌倒平板①溶化時為什么要將牛肉膏連同稱量紙一起加熱?可保證粘附在稱量紙上的牛肉膏也能溶于水中，減少誤差。計算二實驗操作（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基稱量溶化滅菌倒平板②加瓊脂的目的是什么?作為凝固劑計算二實驗操作（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基稱量溶化滅菌倒平板③在滅菌前,用牛皮紙、舊報紙包緊盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的目的是什么？在滅菌時能避免水蒸汽凝結時浸濕棉塞，在取出培養(yǎng)基錐形瓶時也起到隔絕空氣中雜菌污染的作用。計算二實驗操作（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基稱量溶化滅菌倒平板④培養(yǎng)皿能否用高壓蒸汽滅菌？不能，因為培養(yǎng)皿要保持干燥，應該用干熱滅菌。計算倒平板討論1、21、用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2、通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。討論3、4、3、平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。4、空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。二實驗操作（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基稱量溶化滅菌倒平板接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法計算（二）純化大腸桿菌1.平板劃線法操作的第一步灼燒接種環(huán)：

每次劃線前灼燒接種環(huán)：劃線結束后灼燒接種環(huán)：

避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；

殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。討論1討論2、32.以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。2.稀釋涂布法（1）系列稀釋操作：（2）涂布平板操作討論提示：應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基稱量溶化滅菌倒平板接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法計算（二）純化大腸桿菌（三）將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h和24h后，觀察并記錄

1、臨時保藏法：對象：溫度：缺點：

2、甘油管藏法：對象：溫度：頻繁使用的菌種4℃（冰箱）容易被污染或產(chǎn)生變異長期保存的菌種-20℃（冷凍箱）菌種的保藏三課題延伸四、課題成果評價

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。（三）是否進行了及時細致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學生良好的科學態(tài)度與習慣。本課題知識小結:練習1.獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是（）A將用于微生物培養(yǎng)的器皿，接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌B接種純種細菌C適宜環(huán)境條件下培養(yǎng)D防止外來雜菌的入侵D練習2.下列操作與無菌技術無關的是()A接種前用肥皂洗雙手,再用酒精擦拭雙手B接種前用火焰燒灼接種針C培養(yǎng)在50℃左右時擱置斜面D在酒精燈的火焰旁完成C練習3.外科手術器械和罐頭食品的處理，要以能夠殺死什么為標準（）A球菌

B桿菌

C螺旋菌

D芽孢D4、下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是A.防止雜菌污染B.消滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前答案：B

解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為與發(fā)酵有關的所有設備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。編號成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml5．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是

。（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費此培養(yǎng)基，可再加入

.自養(yǎng)型微生物

含碳有機物

（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)

。（4）表中營養(yǎng)成分共有

類。（5）不論何種培養(yǎng)基，在各種成分都溶化后分裝前，要進行的是

。（6）右表中各成分重量確定的原則是

。（7）若右表培養(yǎng)基用于菌種鑒定，應該增加的成分是

。固氮微生物

3調(diào)整pH

依微生物的生長需要確定

瓊脂（或凝固劑）

練習6.某學校打算開辟一塊食用菌栽培基地,以豐富學生的勞動技術課內(nèi)容,首先對食用菌實驗室進行清掃和消毒處理,準備食用菌栽培所需的各種原料和用具,然后從菌種站購來各種食用菌菌種.請回答以下問題:練習①對買回來的菌進行擴大培養(yǎng),首先制備試管培養(yǎng)基,寫出制備固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基所需的原料：_________________________________其中提供氮源的主要是_______；提供能源的主要物質(zhì)是_______；瓊脂的作用是_______，它不提供營養(yǎng)。牛肉膏、蛋白胨、水、無機鹽、瓊脂蛋白胨牛肉膏凝固劑練習②微生物在生長過程中對各種成分所需量不同,故制備培養(yǎng)基時各成分要有合適的_____,在燒杯加入瓊脂后要不停地_____,防止_____________________.比例攪拌瓊脂糊底引起燒杯破裂練習③將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加棉塞后包上牛皮紙并用皮筋勒緊放入___________中滅菌，壓力為________，溫度為______，時間__________，滅菌完畢拔掉電源，待鍋內(nèi)壓力____________，將試管取出。高壓滅菌鍋100KPa121℃15~30min自然降至零后練習⑤從一支試管向另一支試管接種時注意，