色譜分析原理及應(yīng)用

III篇章

色譜分析法第19章色譜法分離原理一、色譜法概述二、有關(guān)術(shù)語(yǔ)三、色譜法基本理論四、分離度五、定性定量分析

2023/2/1第一節(jié)色譜法概述一、色譜法的特點(diǎn)、分類(lèi)和作用

1.概述

2.分類(lèi)

3.特點(diǎn)2023/2/1一、色譜法的特點(diǎn)、分類(lèi)和作用

1.概述俄國(guó)植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。

色譜法是一種分離技術(shù)，試樣混合物的分離過(guò)程也就是試樣中各組分在稱(chēng)之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分配過(guò)程。其中的一相固定不動(dòng)，稱(chēng)為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過(guò)此固定相的流體（氣體或液體），稱(chēng)為流動(dòng)相。（動(dòng)畫(huà)）2023/2/1色譜法

當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測(cè)。

兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)2023/2/12.色譜法分類(lèi)

氣相色譜：流動(dòng)相為氣體（稱(chēng)為載氣）。按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜2023/2/1液相色譜液相色譜：流動(dòng)相為液體（也稱(chēng)為淋洗液）。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜，鍵合相色譜離子色譜：液相色譜的一種，以特制的離子交換樹(shù)脂為固定相，不同pH值的水溶液為流動(dòng)相。2023/2/1其他色譜方法薄層色譜和紙色譜：比較簡(jiǎn)單的色譜方法凝膠色譜法:超臨界色譜:高效毛細(xì)管電泳:九十年代快速發(fā)展、特別適合生物試樣分析分離的高效分析儀器。2023/2/1迎頭色譜，頂替色譜和洗脫色譜2023/2/1第二節(jié)有關(guān)術(shù)語(yǔ)分配系數(shù)K

組分在固定相和流動(dòng)相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過(guò)程叫做分配過(guò)程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度（單位：g/mL）比，稱(chēng)為分配系數(shù)，用K表示，即：2023/2/1分配系數(shù)K的討論

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時(shí)，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K=0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。2023/2/1分配系數(shù)K與濃度無(wú)關(guān)，即分配等溫線是線形的。2023/2/1一、色譜流出曲線1.基線

無(wú)試樣通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)即為基線。2.保留值

（1）時(shí)間表示的保留值

保留時(shí)間（tR）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間

死時(shí)間（tM）：不與固定相作用的組分（如空氣）的保留時(shí)間。

調(diào)整保留時(shí)間（tR

＇）：tR＇=

tR－tM

（動(dòng)畫(huà)）2023/2/1（2）用體積表示的保留值

保留體積（VR）：VR=tR×F0（F0為色譜柱出口處的流動(dòng)相流量，單位：mL/min。）

死體積（VM）：VM=

tM×F0

調(diào)整保留體積（VR＇）：

V

R＇=VR－VM

2023/2/13.相對(duì)保留值r21

組分2與組分1調(diào)整保留值之比：

r21=t’R2

/t’R1=V’R2/V’

R1

相對(duì)保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無(wú)關(guān)，它表示了固定相對(duì)這兩種組分的選擇性。2023/2/14.區(qū)域?qū)挾扔脕?lái)衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差()：

即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2)：

色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354（3）峰底寬(Wb)：

Wb=42023/2/1二、容量因子與分配系數(shù)

分配系數(shù)K：組分在兩相間的濃度比；容量因子k：平衡時(shí)，組分在各相中總的質(zhì)量比；

k=MS/MmMS為組分在固定相中的質(zhì)量，Mm為組分在流動(dòng)相中的質(zhì)量。容量因子k與分配系數(shù)K的關(guān)系為：

式中β為相比。填充柱相比：6～35；毛細(xì)管柱的相比：50～1500容量因子越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。可由保留時(shí)間計(jì)算出容量因子，兩者有以下關(guān)系：2023/2/1第三節(jié)色譜法基本理論2023/2/1一、塔板理論-柱分離效能指標(biāo)色譜柱長(zhǎng)：L，虛擬的塔板間距離：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為：

n=L/H理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：2023/2/1有效塔板數(shù)和有效塔板高度

單位柱長(zhǎng)的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質(zhì)計(jì)算可得到不同的理論塔板數(shù)。組分在tM時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：2023/2/1塔板理論的特點(diǎn)和不足：(1)當(dāng)色譜柱長(zhǎng)度一定時(shí)，塔板數(shù)n

越大(塔板高度H越小)，被測(cè)組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)。(3)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K

相同時(shí)，無(wú)論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無(wú)法分離。(4)塔板理論無(wú)法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也無(wú)法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。2023/2/1二、速率理論-影響柱效的因素速率方程（也稱(chēng)范.弟姆特方程式）:

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，u：載氣的線速度(cm/s)

減小A、B、C三項(xiàng)可提高柱效；存在著最佳流速；

A、B、C三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？2023/2/11.渦流擴(kuò)散項(xiàng)－A

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子

固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。2023/2/12.

分子擴(kuò)散項(xiàng)—B

B=2νDg

ν

：彎曲因子，填充柱色譜，ν<1。

Dg：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2·s-1）。由于柱中存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散：

a.擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差。

b.分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速↓，滯留時(shí)間↑，擴(kuò)散↑

c.擴(kuò)散系數(shù)：Dg∝（M載氣）-1/2；M載氣↑，B值↓2023/2/13.傳質(zhì)阻力項(xiàng)—C

組分在氣相和液相兩相間進(jìn)行反復(fù)分配時(shí)，遇到阻力。傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL

，液相傳質(zhì)阻力大于氣相傳質(zhì)阻力。即：

C=（Cg+CL）2023/2/1流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力：發(fā)生在氣相和氣液界面與dp2/Dg成正比采取小顆粒，質(zhì)量小的氣體固定相傳質(zhì)阻力：發(fā)生在氣液界面和固定相之間與df2/Dl成正比Df

為液膜厚度；Dl為組分在液相中的擴(kuò)散系數(shù)2023/2/14.載氣流速與柱效-最佳流速

載氣流速高時(shí)：

傳質(zhì)阻力項(xiàng)是影響柱效的主要因素，流速，柱效,右圖曲線的右邊。

載氣流速低時(shí)：

H-u曲線與最佳流速：

由于流速對(duì)這兩項(xiàng)完全相反的作用，流速對(duì)柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對(duì)流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對(duì)應(yīng)載氣流速u(mài)作圖，曲線最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。

分子擴(kuò)散項(xiàng)成為影響柱效的主要因素，流速，柱效，右圖曲線的坐邊。2023/2/15.速率理論的要點(diǎn)(1)組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展柱效下降的主要原因。(2)通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類(lèi)、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。(4)各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。2023/2/1第四節(jié)分離度

塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對(duì)的實(shí)際分離程度。即柱效為多大時(shí)，相鄰兩組份能夠被完全分離。難分離物質(zhì)對(duì)的分離度大小受色譜過(guò)程中兩種因素的綜合影響：保留值之差──色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素；區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因素。

色譜分離中的四種情況如圖所示：①柱效較高，△K(分配系數(shù))較大,完全分離；②△K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，，△K較大,但分離的不好；④△K小，柱效低，分離效果更差。2023/2/1分離度的表達(dá)式：R=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)89%；R=1.0：分離程度98%；R=1.5：達(dá)99.7%（相鄰兩峰完全分離的標(biāo)準(zhǔn)）。2023/2/1令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相鄰兩峰的峰底寬近似相等），引入相對(duì)保留值和塔板數(shù)，可導(dǎo)出下式：Rs=1/4*(α-1)/α*n1/2*K2/(1+k2)(（1+k2

）

/k2)2/U*(1+k2)3/k222023/2/1分離度與柱效（動(dòng)力學(xué)因素），選擇因子（熱力學(xué)因素），和容量因子（容量因素）有關(guān)α＝1,分不開(kāi)改變流動(dòng)相的組成；溫度；固定相組成；特殊反應(yīng)．n,改變流動(dòng)相的流速，黏度；液膜厚度，柱長(zhǎng)k,1-52023/2/1例題1：

在一定條件下，兩個(gè)組分的調(diào)整保留時(shí)間分別為85秒和100秒，要達(dá)到完全分離，即R=1.5。計(jì)算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1cm，柱長(zhǎng)是多少？解：r21=100/85=1.18

n有效=16R2[r21/(r21—1)]2

=16×1.52×(1.18/0.18)2

=1547（塊）L有效=n有效·H有效

=1547×0.1=155cm

即柱長(zhǎng)為1.55米時(shí)，兩組分可以得到完全分離。2023/2/1例題2：

在一定條件下，兩個(gè)組分的保留時(shí)間分別為12.2s和12.8s，計(jì)算分離度。要達(dá)到完全分離，即R=1.5，所需要的柱長(zhǎng)。n=3600解：分離度：塔板數(shù)增加一倍，分離度增加多少？2023/2/1第五節(jié)定性和定量分析

2023/2/1一、色譜定性鑒定方法1.利用純物質(zhì)定性的方法

利用保留值定性：通過(guò)對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來(lái)確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對(duì)比。

利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對(duì)變化。2.利用文獻(xiàn)保留值定性

相對(duì)保留值r21：相對(duì)保留值r21僅與柱溫和固定液性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊(cè)中都列有各種物質(zhì)在不同固定液上的保留數(shù)據(jù)，可以用來(lái)進(jìn)行定性鑒定。2023/2/13.保留指數(shù)p380

又稱(chēng)Kovats指數(shù)（Ⅰ），是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)。測(cè)定方法：將正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定其保留指數(shù)為分子中碳原子個(gè)數(shù)乘以100（如正己烷的保留指數(shù)為600）。其它物質(zhì)的保留指數(shù)（IX）是通過(guò)選定兩個(gè)相鄰的正構(gòu)烷烴，其分別具有Z和Z＋1個(gè)碳原子。被測(cè)物質(zhì)X的調(diào)整保留時(shí)間應(yīng)在相鄰兩個(gè)正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留值之間如圖所示：2023/2/1保留指數(shù)計(jì)算方法2023/2/13.與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法小型化的臺(tái)式色質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS；LC-MS）色譜-紅外光譜儀聯(lián)用儀；組分的結(jié)構(gòu)鑒定SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD2023/2/1二、色譜定量分析方法1.峰面積的測(cè)量

（1）峰高（h）乘半峰寬（Y1/2）法：近似將色譜峰當(dāng)作等腰三角形。此法算出的面積是實(shí)際峰面積的0.94倍：

A=1.064h·Y1/2

（2）峰高乘平均峰寬法：當(dāng)峰形不對(duì)稱(chēng)時(shí)，可在峰高0.15和0.85處分別測(cè)定峰寬，由下式計(jì)算峰面積：

A=h·（Y

0.15+Y

0.85）/2

（3）峰高乘保留時(shí)間法：在一定操作條件下，同系物的半峰寬與保留時(shí)間成正比，對(duì)于難于測(cè)量半峰寬的窄峰、重疊峰（未完全重疊），可用此法測(cè)定峰面積：

A=h·b·tR

（4）自動(dòng)積分和微機(jī)處理法2023/2/12.定量校正因子

試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比，即：

mi=

fi·Ai

絕對(duì)校正因子：比例系數(shù)f

i

，單位面積對(duì)應(yīng)的物質(zhì)量：