細菌內(nèi)毒素檢測試驗注意事項與誤差分析

細菌內(nèi)毒素檢測試驗注意事項與誤差分析董光宴工程師一、實驗注意事項二、影響試驗結(jié)果的因素分析湛江博康海洋生物有限公司2/1/20231博康一、試驗操作注意事項

——2010年版《中國藥品檢驗標準操作規(guī)程》P310細菌內(nèi)毒素檢查法

實驗前，須用肥皂洗手，用75％酒精棉球消毒。在使用洗耳球、移液管取樣時，應注意不要將洗耳球中的氣體吹入溶液中，以防止氣體中的內(nèi)毒素進入供試液。復溶0.5ml鱟試劑時，在旋渦混合器上點擊1～3秒，促進鱟試劑的溶解。2/1/20232博康由于凝集反應是不可逆的，所以在反應過程中及觀察結(jié)果時應注意不要使試管受到振動，以免使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性結(jié)果。進行干擾實驗時，標準對照系列和含內(nèi)毒素的供試品溶液系列應同時進行，并使用同一支細菌內(nèi)毒素標準品。2/1/20233博康在進行鱟試劑靈敏度復核、干擾實驗和供試品細菌內(nèi)毒素檢查時，各個實驗中要求的對照應同時進行，并在實驗有效的情況才能進行計算和判斷。在進行鱟試劑靈敏度復核、干擾實驗和供試品細菌內(nèi)毒素檢查時，各個實驗中要求的對照應同時進行，并在實驗有效的情況才能進行計算和判斷。2/1/20234博康二、影響試驗結(jié)果的因素分析鱟試劑細菌內(nèi)毒素工作標準品細菌內(nèi)毒素檢查用水環(huán)境實驗器皿實驗人員樣品試驗2/1/20235博康1鱟試劑質(zhì)量標準：WS1-363（B-123）-91

性狀、鑒別、檢查、靈敏度測定、用途、規(guī)格、貯藏應用標準：干擾能力、穩(wěn)定性國外標準：無菌2/1/20236博康1鱟試劑靈敏度：在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示?！?010版《中國藥典》國外鱟試劑：靈敏度由FDA統(tǒng)一標定2/1/20237博康1鱟試劑鱟試劑靈敏度復核的目的不僅是考察鱟試劑的靈敏度是否準確，也是考查檢驗人員操作方法是否正確及實驗條件是否符合規(guī)定。因此要求每個實驗室在使用一批新的鱟試劑進行供試品干擾實驗或供試品細菌內(nèi)毒素檢查前必須進行鱟試劑靈敏度復核實驗?！?010版《中國藥品檢驗標準操作規(guī)程》2/1/20238博康1鱟試劑外觀：本品為白色或類白色凍干塊或粉末，在水和生理鹽水中易溶。干擾能力：指在藥品、生物制品和血液制品中鱟試劑能準確測出被測物質(zhì)內(nèi)毒素的能力，既不能造成樣品內(nèi)毒素的漏檢，也不能將其它物質(zhì)錯判為內(nèi)毒素。鱟試劑參考品：150603-201003，2.2ml/0.06EU

2/1/20239博康2細菌內(nèi)毒素標準品引起的誤差細菌內(nèi)毒素標準品種類細菌內(nèi)毒素標準品效價誤差細菌內(nèi)毒素標準品操作誤差細菌內(nèi)毒素標準品的錯誤使用

2/1/202310博康1）細菌內(nèi)毒素標準品種類細菌內(nèi)毒素國際標準品（IS2，94/580）細菌內(nèi)毒素國家標準品（200707）細菌內(nèi)毒素工作標準品（200758-201174）國外內(nèi)毒素標準品：國標、工作品

2/1/202311博康2）細菌內(nèi)毒素標準品用途細菌內(nèi)毒素國家標準品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內(nèi)毒素工作標準品的效價。

細菌內(nèi)毒素工作標準品系以細菌內(nèi)毒素國家標準品為基準標定其效價，用于試驗中鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗及各種陽性對照?！?010年版《中國藥典》2/1/202312博康3）細菌內(nèi)毒素標準品效價誤差細菌內(nèi)毒素國家標準品與細菌內(nèi)毒素工作標準品之間或細菌內(nèi)毒素工作標準品與細菌內(nèi)毒素工作標準品之間的生物效價存在一定的誤差，用不同細菌內(nèi)毒素標準品復核同一批鱟試劑靈敏度時可能存在一定的誤差。中國藥典要求“當λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度?！痹囼灲Y(jié)果只要在這合格范圍內(nèi)表示鱟試劑標示靈敏度準確。2/1/202313博康4）內(nèi)毒素標準品操作誤差

取細菌內(nèi)毒素工作標準一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)?！?010年版《中國藥品檢驗標準操作規(guī)程》正確（易折點）錯誤2/1/202314博康注意：①只能在安瓿的易折點上部開啟內(nèi)毒素，不能沿易折點開啟，防止振蕩過程中內(nèi)毒素粘在封口膜上。②只能取1ml的細菌內(nèi)毒素檢查用水復溶細菌內(nèi)毒素工作標準品。③若使用的為細菌內(nèi)毒素國家標準品，可按其使用說明書中的方法將其稀釋至規(guī)定濃度后分裝保存。若為細菌內(nèi)毒素工作標準品，為一次性使用。2/1/202315博康5）錯誤使用使用內(nèi)毒素工作標準品標定鱟試劑靈敏度使用廠家的內(nèi)毒素復核鱟試劑靈敏度廠家內(nèi)毒素交叉復核鱟試劑靈敏度使用廠家的內(nèi)毒素做干擾實驗廠家的內(nèi)毒素做于定量實驗2/1/202316博康3細菌內(nèi)毒素檢查用水細菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測定法）且對內(nèi)毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水。滅菌注射用水內(nèi)毒素含量PH值無干擾作用2/1/202317博康4環(huán)境為保證實驗結(jié)果的準確性，防止污染，內(nèi)毒素檢查實驗應在密閉的潔凈室中或密閉實驗室的超凈工作臺下進行?！?010年版藥品GMP實施指南密閉的潔凈室中密閉實驗室的超凈工作臺實驗室溫度：≤26℃實驗室濕度：45%～75%2/1/202318博康1）溫度將細菌內(nèi)毒素工作標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2λ，進行鱟試驗，然后分別放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49℃水浴保溫。實驗中觀察到凝膠形成的速度隨著溫度的升高而加快，但到達49℃保溫90min也未出現(xiàn)凝膠。從實驗可以看出，溫度對鱟試劑的靈敏度影響很大，保溫溫度在25～41℃之間，隨著溫度的升高，反應速度也升高，41℃尚未達到反應速度峰值，25℃時反應速度已相當快；在41～46℃之間，溫度對鱟試劑的靈敏度無明顯影響；達到49℃或更高溫度時，隨溫度升高而使酶蛋白逐漸變性，則鱟試劑被破壞，反應速度反而降低。2/1/202319博康2）濕度吸潮靈敏度增高揮發(fā)2/1/202320博康5實驗器皿器皿的計量管理（校正）器皿的選擇標準器皿的正確處理2/1/202321博康1）器皿的選擇標準鱟試驗對器皿的要求：刻度準確；內(nèi)表面光滑；易于清理。細菌內(nèi)毒素檢查實驗不宜選用注射器，最好使用經(jīng)過校正的玻璃刻度移液管或精密移液器。注射器刻度不精確，內(nèi)壁磨沙面吸附內(nèi)毒素，而且要特別注意注射器針頭引入的鐵離子對試驗結(jié)果的干擾，故不宜選用注射器。2/1/202322博康

如果用量不大，使用頻率不高，建議大家選用本公司提供的一次性耗材。無熱原耗材是一種在此行業(yè)中被鑒定為無內(nèi)毒素和β-葡聚糖污染的產(chǎn)品，其中包括,無熱原試管、無熱原移液器吸頭。這些產(chǎn)品可以給您的工作帶來很大方便,另外，當實驗出現(xiàn)誤差時可首先排除器皿方面的因素,很快分析判斷出誤差原因。2/1/202323博康2）器皿的正確處理2010年版《中國藥品檢驗標準操作規(guī)范》310頁——細菌內(nèi)毒素檢查法“3實驗準備”規(guī)定：3.1.1玻璃器皿的洗滌將玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡，然后取出將洗液空干，用自來水將殘留洗液徹底洗凈，再用蒸餾水反復沖洗三遍以上，空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放置入烤箱。2/1/202324博康

3.1.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素玻璃器皿置烤箱后，將烤箱調(diào)至250℃，待烤箱溫度升至設定的溫度后開始計時，干烤30分鐘以上。達到規(guī)定時間后，關(guān)斷電源，待烤箱溫度自然降至室溫。在不打開金屬容器的情況下，可在兩天內(nèi)使用；如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用，否則須再次干烤除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。2/1/202325博康蒸餾水有效期應該特別注意，該規(guī)程明確規(guī)定最后沖洗玻璃器皿必須“用蒸餾水沖洗，禁用純化水沖洗?！庇械目蛻羰褂梅礉B透制備的純化水沖洗試驗用玻璃器皿，結(jié)果試驗中所有的陽性對照都為陰性，復核鱟試劑靈敏度時試驗結(jié)果誤差較大，這主要是由于純化水和蒸餾水的質(zhì)量不同所造成的。2/1/202326博康6

實驗人員

負責質(zhì)量檢驗的人員應受過適當教育，并經(jīng)專業(yè)技術(shù)培訓，具有基礎理論知識和實際操作技能。質(zhì)量控制實驗室所有人員的職責應當書面規(guī)定。內(nèi)毒素檢測人員應經(jīng)過嚴格的培訓，并應配備相應的防護設施（如穿防護服、戴口罩、頭套等）。——2010年版藥品GMP實施指南2/1/202327博康7

樣品β-葡聚糖樣物質(zhì)的影響PH值的影響金屬離子和弱酸陰離子的影響藥物濃度的影響

2/1/202328博康1）β-葡聚糖樣物質(zhì)的影響常見現(xiàn)象：假陽性。鱟試劑的特異性系指在藥品、生物制品和血液制品中鱟試劑能準確測出被測物質(zhì)內(nèi)毒素的能力，既不能造成樣品內(nèi)毒素的漏檢，也不能將其它物質(zhì)錯判為內(nèi)毒素。2/1/202329博康目前我公司研究證明，已知能與鱟試劑發(fā)生反應的物質(zhì)有細菌內(nèi)毒素和β-葡聚糖，而內(nèi)毒素反應曲線為S型特征曲線，β-葡聚糖反應曲線為經(jīng)過0點的斜線。鱟試劑的特異性差的另一種表現(xiàn)，是將其它物質(zhì)（如β-葡聚糖）判定為內(nèi)毒素，錯誤將合格藥品判為不合格，造成制藥廠直接經(jīng)濟損失。2/1/202330博康鱟試劑反應機理圖2/1/202331博康判斷假陽性的方法：1、特異性鱟試劑法；2、定量反應曲線分析法；3、家兔模擬試驗法。2/1/202332博康2）PH值對反應速度的影響常見現(xiàn)象：樣品陽性不成立。鱟試劑與內(nèi)毒素反應的最適宜pH在6.5-8.0；pH≤3或≥10時，酶活性受到抑制。相對活力PH7.02/1/202333博康PH對反應速度的影響:影響酶原的激活；影響酶分子的構(gòu)象，過高過低的PH會改變酶的活性中心的構(gòu)象，或甚至改變整個酶分子的機構(gòu)使其變性失活。2/1/202334博康故鱟試驗時，供試品pH最好應預調(diào)和6.5-8.0為好，必要時可用無內(nèi)毒素的HCl

或NaOH

稀溶液調(diào)節(jié)pH值。美國、日本藥局方以及中國藥典故2005版規(guī)定檢品必須調(diào)節(jié)PH值6.0-8.0。2/1/202335博康3）金屬離子和弱酸陰離子

離子對細菌內(nèi)毒素測定結(jié)果影響較大，一方面陽離子如Fe3+、Al3+強度較大會引起內(nèi)毒素的聚集造成內(nèi)毒素局部濃度過高，同時還必須注意高價陽離子（如Fe3+）的氧化性對鱟試劑酶反應具有強抑制作用；重金屬離子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白質(zhì)變性而使酶失活；另一方面鱟試劑必須在二價陽離子Ca2+、Mg2+的參與下才能被激活形成凝膠反應。許多藥物因PH值≥10時，其中的陰離子會吸收鱟試劑中的Ca2+、Mg2+離子，使實驗呈假陰性。2/1/202336博康4）藥物濃度1、10%葡萄糖注射液2、白蛋白、小牛血清3、醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉4、中藥類注射液

2/1/202337博康7試驗操作規(guī)程操作時間操作順序操作細節(jié)2/1/202338博康

1）操作時間

將細菌內(nèi)毒素工作標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2λ，進行鱟試驗，37℃保溫，分別在10、20、30、40、50、70min時觀察，發(fā)現(xiàn)凝膠的形成狀態(tài)隨著時間的延長而堅固。因此夏天室溫較高，如果試驗操作時間太長，細菌內(nèi)毒素與鱟試劑混合液不等進入反應儀器反應已開始，實際反應時間超過1小時。由于室溫不同，冬夏季節(jié)、南北地區(qū)之間的操作誤差將會很大。即使在25℃準室溫下操作，操作時間拖得過長，細菌內(nèi)毒素含量較高時，測定誤差也不會小。2/1/202339博康2）操作順序操作時嚴格按操作規(guī)程進行，安瓿開啟前應先用酒精棉球擦拭曲頸部，用將頸部折斷，防止碎玻屑掉入安瓿內(nèi)。在鱟試劑的溶解、樣品