膿汁和糞便標本中病原菌的檢測-4

斜面培養(yǎng)物4支，營養(yǎng)肉湯4支，生理鹽水2支，鏡油瓶、拭鏡紙1套，吸水紙1本，載玻片4張。器材準備染色瓶6組，染色架8個。醫(yī)學微生物學實驗

綜合性實驗一膿汁和糞便標本中病原菌的檢測（四）斜面培養(yǎng)物的觀察革蘭染色法肉湯接種法顯微鏡油鏡的使用斜面培養(yǎng)物的觀察從普通平板上挑取的金黃色或白色菌落接種的斜面，菌苔的顏色，還是原來菌落的顏色，金黃色或白色。從伊紅美藍平板上挑取的紫黑色或粉紅色菌落接種的斜面，菌苔已經(jīng)沒有原來菌落的顏色。菌苔灰白色、表面濕潤、光滑、不透明或半透明。為了講解方便，以后的實驗，仍然沿用初次分離得到菌落的顏色—紫黑或粉紅。從斜面上取菌時，一般只取半個小菌落大小的菌量；接種環(huán)或接種針在菌苔上輕刮一下即可。

膿汁和糞便標本中病原菌的檢測

實驗流程(6次課12學時）①培養(yǎng)基的制備②細菌的分離培養(yǎng)③細菌的純培養(yǎng)④細菌的形態(tài)學檢查⑤細菌的生化試驗等⑥細菌的血清學試驗、結(jié)果分析→實驗論文撰寫細菌染色法單染色法：只用一種染料染色，能清楚觀察菌體大小、形態(tài)與排列，不能鑒別細菌。復染色法（鑒別染色）：采用兩種以上的不同染料進行先后染色，可將細菌染成不同的顏色，以便鑒別細菌。抗酸染色:用于檢查結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌等抗酸性細菌(※一些一旦用某些方法染色后，能夠抵抗酸性酒精脫色的細菌)，陽性者為紅色。特殊染色：莢膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，極體染色（用于白喉桿菌異染顆粒染色）。結(jié)核分枝桿菌抗酸染色麻風分枝桿菌抗酸染色產(chǎn)氣莢膜梭菌莢膜Hiss染色破傷風梭菌芽胞芽胞染色變形桿菌鞭毛Leifson染色

白喉棒狀桿菌異染顆粒Albert染色革蘭染色法GramStaining

革蘭染色法是丹麥內(nèi)科醫(yī)生ChristainGram于1884年創(chuàng)立的一種細菌染色方法，已有120多年的歷史，仍在廣泛使用，是細菌學中最為經(jīng)典的染色法。革蘭染色法原理的三種學說通透性學說：G+菌細胞壁結(jié)構(gòu)比較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，酒精不易透入，反而可使細胞壁脫水而形成一道屏障，阻止染料向細胞外滲。G-菌細胞壁比較疏松，肽聚糖層很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被酒精溶解，致使細胞壁通透性增高，細胞內(nèi)的結(jié)晶紫—碘復合物容易被酒精脫出。等電學說：G+菌等電點(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般染色時染液的酸堿度在pH7.0左右，電離后陽性菌帶的負電荷比陰性菌多，因此與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合牢固，不易脫色?；瘜W學說：G+菌細胞內(nèi)含有某種特殊化學成分，一般認為是核糖核酸鎂鹽與多糖的復合物，它與染料—媒染劑復合物結(jié)合，使已著色的細菌不易脫色。革蘭染色的意義鑒別細菌：把細菌分成G+和G-兩大類。選擇抗菌藥物：例如G+球菌對青霉素敏感,G-桿菌耐藥。了解細菌的致病機理：G+菌大多產(chǎn)生外毒素,G-菌產(chǎn)生內(nèi)毒素。革蘭染色的步驟涂片→干燥→固定→染色涂片的制備Preparea

Smear

甲→金黃，紫黑。乙→白色，粉紅。丙→金黃，紫黑。丁→白色，粉紅。↑細菌合適

↑細菌較多①接種環(huán)取鹽水3ul×2滴,水滴間距小于2cm。②取菌苔少許（1mm小菌落半個）與鹽水混勻，涂成大于1cm2均勻涂膜。③涂畢→環(huán)移至涂膜中央側(cè)立，待環(huán)內(nèi)菌膜破裂，接種環(huán)燒灼滅菌。固定Fixation手持載玻片一端，涂膜朝上，兩個涂膜快速通過火焰外層3次，時間2～3秒鐘。促使菌體蛋白質(zhì)凝固，固定在載玻片上，以免染色水洗的時候，細菌被水洗掉。

涂片smear干燥dry革蘭染色方法步驟TheGramStainProcedure涂片→干燥→固定→↓結(jié)晶紫→初染1分鐘→水洗→↓盧戈碘液→媒染1分鐘→水洗→↓95％乙醇→脫色約20秒鐘→水洗→↓稀釋品紅→復染1分鐘→水洗→↓吸干,鏡檢?！锶【m量,涂片均勻,水洗輕緩,脫色適當?！镉绊懜锾m染色的關(guān)鍵步驟是涂片和脫色。革蘭陽性菌Gram-Positive革蘭陰性菌Gram-NegativeG+鏈球菌G-雙球菌G+桿菌G+短桿菌G-弧菌G-螺菌液體培養(yǎng)基接種BrothTransfer—懸浮法SuspendingMethod甲→金黃,乙→白色,丙→紫黑,丁→粉紅。標記：組號，顏色37℃培養(yǎng)4小時4～5×108cfu/ml①接種環(huán)斜面取菌，在靠近培養(yǎng)基液面管壁上，上下研磨接種。②在管壁上，將接種環(huán)內(nèi)的菌膜拍破。退出接種環(huán)，燒灼滅菌。生物安全警告本次實驗操作，可產(chǎn)生幾十至幾百個微生物氣溶膠顆粒。氣溶膠粒徑＞100um沉降很快,＜50um在0.4s內(nèi)擴散開,＜5um通過呼吸道直接到達肺泡。Pike博士對實驗室感染統(tǒng)計分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不明原因的感染高達82%，大多數(shù)是氣溶膠在空氣中擴散引起的。實驗時應(yīng)坐著，在火焰周圍10～20厘米內(nèi)操作，保持安靜、有序，盡量少說話、少走動，以免感染病原菌。顯微鏡油鏡的使用P13將標本放置、移動到光路上，用“黃色圈”的10×物鏡找到、看清楚標本。將聚光器調(diào)到最高處。調(diào)整孔徑光闌,將與物鏡相對應(yīng)倍率調(diào)到正面（10×→100×）。在標本觀察部位上滴加一滴香柏油。將“白色圈”100×物鏡放入光路，浸泡于香柏油中，可看到模糊物象。調(diào)整亮度及微調(diào)旋鈕，直到物象清晰為止→觀察物象，記錄結(jié)果→關(guān)閉電源。油鏡處理：擦鏡紙拭去香柏油→擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（3:7）混合液擦拭→擦鏡紙擦拭油鏡。顯微鏡罩上防塵罩→橫放在實驗柜內(nèi)。※

(順德校區(qū)）實驗臺兩側(cè)的電源插座，只能插入一個插頭，請選擇離你最近的電源插座?！ㄐ１静浚嶒炁_中間，三個位的插座，中間那位插孔沒有電，不能使用，只能用兩側(cè)的插座。100倍浸油物鏡使用方法油鏡放入光路之前，一定要在標本的觀察部位上加一滴浸油。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡進入光路，用微調(diào)旋鈕對好焦距。如果浸油內(nèi)有氣泡，會影響觀察，可稍微旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡來回通過1～2次浸油，排除油內(nèi)氣泡。溫馨提示因染色場地受限，1～5組先涂片染色，后接種肉湯。6～10組先接種肉湯，后涂片染色。待染色和肉湯接種完畢，桌面收拾干凈，才可鏡檢，以免污染。鏡檢過的載玻片不必擦拭，直接投入玻片缸內(nèi)消毒、滅菌。革蘭染色法P15

甲→金黃，紫黑乙→金黃，紫黑丙→白色，粉紅丁→白色，粉紅肉湯接種法P10

甲→金黃乙→白色丙→紫黑丁→粉紅油鏡的使用P13

10×物鏡→看清標本→滴加香柏油→100×油鏡→浸泡油中→模糊物象→細調(diào)節(jié)調(diào)焦，觀察物像→記錄結(jié)果→關(guān)閉電源→擦鏡紙拭去香柏油→擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦鏡紙擦拭油鏡。聚光鏡孔徑光闌環(huán)上的物鏡倍率（10×或100×）轉(zhuǎn)到正面。思考題革蘭染色法的關(guān)鍵步驟是什么?為什么?染色時為什么通常要用新鮮的細菌培養(yǎng)物?如何使用油鏡?實驗小結(jié)用普通平板，從濃汁標本中分離得到金黃、白色兩種菌落，這兩株細菌，顯微鏡油鏡下均為G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。葡萄球菌（電鏡）金黃、白色形態(tài)與染色（油鏡）酸葡萄金黃、白色菌落特征黃色白色葡萄球菌三個種的鑒別試驗金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌血漿凝固酶+--甘露醇發(fā)酵+--新生霉素敏感性SSRA蛋白+--α溶血素+--致病性強弱或無無注：敏感（SensitiveS）,耐藥（ResistantR）。用伊紅美藍平板,從糞便標本分離、獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大腸埃希菌。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。顯微鏡下，均為G-桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能鑒別是什么細菌。桿菌（電鏡）紫黑、粉紅細菌的形態(tài)與染色（油鏡）紫黑