菌種選育培養(yǎng)及保藏

微生物的選育培養(yǎng)和保藏第二章生產(chǎn)菌種的選育及發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)2.5發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)2.4菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)及保藏2.3生物菌種的選育方法2.2微生物代謝控制育種的措施2.1

微生物的代謝及調(diào)控2.6生產(chǎn)實(shí)例-谷氨酸菌種培養(yǎng)第二章生產(chǎn)菌種的選育及發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)2.5發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)2.4菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)及保藏2.3生物菌種的選育方法2.2微生物代謝控制育種的措施2.1

微生物的代謝及調(diào)控2.6生產(chǎn)實(shí)例-谷氨酸菌種培養(yǎng)核心、重點(diǎn)掌握一、菌種的選育優(yōu)良的菌種是發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵所在，是發(fā)酵工業(yè)的“靈魂”。菌種選育目的：改良菌種的生理特性和生產(chǎn)性能，獲得優(yōu)良的菌種，并使其適合發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的需要。一、菌種的選育發(fā)酵工業(yè)常用微生物新菌種的一般分離篩選菌種改良及工程菌構(gòu)建工業(yè)常見(jiàn)微生物種類(lèi)工業(yè)菌種獲取方式工業(yè)生產(chǎn)對(duì)菌種的基本要求菌種改良概念、意義菌種改良的理論基礎(chǔ)菌種改良的方式一、菌種的選育發(fā)酵工業(yè)常用微生物新菌種的分離篩選方法菌種改良及工程菌構(gòu)建工業(yè)常見(jiàn)微生物種類(lèi)工業(yè)菌種獲取方式工業(yè)生產(chǎn)對(duì)菌種的基本要求菌種改良概念、意義菌種改良的理論基礎(chǔ)菌種改良的方式放線(xiàn)菌擔(dān)子菌藻類(lèi)細(xì)菌酵母菌霉菌工業(yè)常見(jiàn)微生物種類(lèi)細(xì)菌大腸桿菌在發(fā)酵工業(yè)中常用于生產(chǎn)氨基酸、工業(yè)燃料…乳酸菌在發(fā)酵工業(yè)中常用于生產(chǎn)陳醋、酸奶、乳酸鈣…枯草芽孢桿菌在發(fā)酵工業(yè)中常用于可用于生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、某些氨基酸、葉酸、肌苷、鳥(niǎo)苷、維生素B2…大腸桿菌乳酸菌枯草芽孢桿菌酵母菌茶酵母、釀酒酵母、面包酵母…釀酒酵母是與人類(lèi)關(guān)系最密切的一種酵母。霉菌毛霉產(chǎn)生蛋白酶、有分解大豆蛋白的能力。腐乳、蛋白的生產(chǎn)。曲霉各類(lèi)酶制劑、有機(jī)酸、醬油的制造、釀酒根霉米酒、黃酒的生產(chǎn)放線(xiàn)菌

抗生素的生產(chǎn)鏈霉菌、小單孢菌、諾卡菌…擔(dān)子菌通常所說(shuō)的菇類(lèi)(mushroom)微生物。多糖、橡膠物質(zhì)和抗癌藥物的開(kāi)發(fā)猴頭菌蜜環(huán)菌藻類(lèi)藻類(lèi)是自然界分布極廣的一類(lèi)自養(yǎng)微生物資源藻類(lèi)培養(yǎng)后可加工成汽油、煤油和其他產(chǎn)品螺旋藻工業(yè)化菌種的要求核心要求安全便利經(jīng)濟(jì)菌種自我保護(hù)，不易被它種微生物或噬菌體侵染菌種非病原菌，保證產(chǎn)品非毒性菌種要純粹，即遺傳穩(wěn)定，不易退化。發(fā)酵工藝溫和易控制生長(zhǎng)速度和反應(yīng)速度快，發(fā)酵周期短菌種單產(chǎn)量高能夠利用廉價(jià)原料、產(chǎn)品產(chǎn)量產(chǎn)率高且易回收菌種保存機(jī)構(gòu)索要或購(gòu)買(mǎi)菌種自然界或現(xiàn)有菌種中分離篩選菌種對(duì)篩選出的菌種進(jìn)行改良獲得新種常用菌種的獲取方式1、中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)-國(guó)內(nèi)常用http://2、國(guó)際菌種保藏聯(lián)合會(huì)(WFCC)-權(quán)威機(jī)構(gòu)、服務(wù)廣泛http:///3、美國(guó)典型微生物菌種保藏中心(ATCC)-非盈利、門(mén)類(lèi)齊全/4、中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)(CTCC-CAS)-側(cè)重科學(xué)研究http:///常用的菌種保藏機(jī)構(gòu)菌種的選育發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種的分離篩選方法菌種改良及工程菌構(gòu)建工業(yè)常見(jiàn)微生物種類(lèi)工業(yè)菌種獲取方式工業(yè)生產(chǎn)對(duì)菌種的基本要求菌種改良概念、意義菌種改良的理論基礎(chǔ)菌種改良的方式菌種的分離篩選方法一般菌種分離純化和篩選步驟定方案→樣品采集→樣品的預(yù)處理→菌種富集培養(yǎng)→初篩→復(fù)篩→發(fā)酵性能鑒定→獲得目的菌。設(shè)計(jì)篩選方案特別注意的是采用方法的選擇性和靈敏度；簡(jiǎn)潔而有效的篩選方法是育種工作的關(guān)鍵。生物菌種的選育方法發(fā)酵工業(yè)常用微生物新菌種的分離篩選方法菌種改良及工程菌構(gòu)建工業(yè)常見(jiàn)微生物種類(lèi)工業(yè)菌種獲取方式工業(yè)生產(chǎn)對(duì)菌種的基本要求菌種改良概念、意義菌種改良的理論基礎(chǔ)菌種改良的方式菌種的改良概念、意義及理論基礎(chǔ)菌種改良：采用各種手段（物理、化學(xué)、工程學(xué)、生物學(xué)方法以及它們的各自組合）處理目的微生物菌種，使其遺傳基因發(fā)生變化，使生物合成朝人們希望的方向加以引導(dǎo)，某些代謝產(chǎn)物過(guò)量積累，從而獲得生產(chǎn)上所需要的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和低耗的變異菌種。菌種改良的意義：通過(guò)菌種改良，可以提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量和純度，減少副產(chǎn)物的生成；通過(guò)菌種改良還可以改變菌種生物合成途徑，從而獲得新的產(chǎn)品。菌種改良的理論基礎(chǔ)是基因突變自然狀態(tài)下，微生物本身的自發(fā)突變頻率極低10-8～10-5人為誘變處理，可以大幅度提高微生物的突變頻率至10-6～10-3目前菌種改良已成為獲得優(yōu)質(zhì)菌種的主要獲得途徑。2.3生物菌種的選育方法菌種改良的方法自然選育誘變選育雜交選育原生質(zhì)體融合育種基因工程育種菌種改良的方法自然選育：在生產(chǎn)過(guò)程中，不經(jīng)過(guò)人工處理，利用菌種的自發(fā)突變，從而選育出優(yōu)良菌種的過(guò)程。（正向突變-性能提高；負(fù)向突變性能降低）---效率較低誘變選育：誘變育種是指用物理和化學(xué)誘變劑的方法處理均勻分散的細(xì)胞群，使它們發(fā)生突變，從中篩選出符合要求的高產(chǎn)菌株。（選擇出發(fā)菌→誘變處理→篩選變異菌）---廣泛使用的育種方法（紫外線(xiàn)、X-射線(xiàn)、γ-射線(xiàn)、5-氟尿嘧啶、烷化劑、亞硝基胍）雜交選育：兩個(gè)基因型不同的菌株經(jīng)接合后使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離篩選出具有新性狀菌株的一種育種技術(shù)。---較誘變育種具有更強(qiáng)的方向性和目的性，且能改善長(zhǎng)期誘變菌種產(chǎn)量提升過(guò)慢的現(xiàn)象（接合的概念是指性狀不同兩種微生物之間接觸，通過(guò)遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移、交換、重組形成新個(gè)體。）原生質(zhì)體融合育種：用水解酶除去細(xì)胞壁，制成由原生質(zhì)膜包被的裸細(xì)胞，然后用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，誘導(dǎo)遺傳特性不同的兩個(gè)親本原生質(zhì)體融合，經(jīng)過(guò)染色體交換、重組而達(dá)到雜交的目的?；蚬こ逃N：采用基因工程技術(shù)將多種微生物的基因從細(xì)胞中取出，然后有選擇的拼接組裝到一個(gè)細(xì)胞中，使這個(gè)菌株具有多功能、高效和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)的新型微生物。---新興的育種方法，還不能完全取代誘變育種基因工程育種經(jīng)典案例2.3生物菌種的選育方法首例基因遺傳改造大腸桿菌生產(chǎn)抗瘧疾藥物青蒿酸VincentJJMartinetal.VOLUME21NUMBER7JULY2003NaturebiotechnologyKeasling課題組基因遺傳改造大腸桿菌生產(chǎn)抗瘧疾藥物青蒿素前體物青蒿酸，產(chǎn)量從無(wú)到有大幅度提高，并可用于工業(yè)化生產(chǎn)二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和保藏菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種的衰退與復(fù)壯菌種的保藏二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和保藏菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種的衰退與復(fù)壯菌種的保藏菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)概念：將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化，再經(jīng)過(guò)搖瓶及種子罐逐級(jí)放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱(chēng)為種子。擴(kuò)大培養(yǎng)的重要性：在擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中,種子的質(zhì)量?jī)?yōu)劣對(duì)發(fā)酵起著至關(guān)重要的作用。根據(jù)菌種生理特性，選擇合適培養(yǎng)條件獲得的代謝旺盛、數(shù)量足夠的種子，能夠使發(fā)酵生產(chǎn)周期縮短，提高設(shè)備利用率。菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)投入發(fā)酵生產(chǎn)前的擴(kuò)大培養(yǎng)兩階段：實(shí)驗(yàn)室種子制備、車(chē)間種子罐制備實(shí)驗(yàn)室種子制備階段：孢子制備、搖瓶種子制備生產(chǎn)車(chē)間種子罐制備階段：按照發(fā)酵罐大小，種子罐設(shè)置n級(jí)放大；注意兩參數(shù)種齡（對(duì)數(shù)中后期）和接種量（細(xì)菌1%；霉菌10%）二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和保藏菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種的衰退與復(fù)壯菌種的保藏菌種的衰退和復(fù)壯菌種的衰退概念：又叫做菌種的退化，是指生產(chǎn)菌種或者篩選出來(lái)的優(yōu)良菌株，由于進(jìn)行接種傳代或保藏之后，群體某些形態(tài)特征及生理特征逐漸減退或者完全喪失的現(xiàn)象，這是一種群體概念。菌種退化過(guò)程是一個(gè)從量變到質(zhì)變的過(guò)程。純菌種自發(fā)突變突變個(gè)體傳代增殖原始個(gè)體菌種為何會(huì)退化？菌種的衰退和復(fù)壯菌種衰退原因基因負(fù)向突變、細(xì)胞內(nèi)功能質(zhì)粒丟失—衰退的根本原因變異菌株性狀分離—多核細(xì)胞最常見(jiàn)，或DNA單鏈上含突變連續(xù)傳代—單個(gè)退化細(xì)胞連續(xù)傳代富集使變異性狀明顯其他因素如溫度、pH、培養(yǎng)基成分及條件引起菌種基因突變例如營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株發(fā)生回復(fù)突變使產(chǎn)量下降：黏質(zhì)賽氏桿菌H-2892原產(chǎn)18g/lHis，經(jīng)5次傳代因回復(fù)突變型增多，產(chǎn)量下降至4g/l；如攜帶游離質(zhì)?？莶菅挎邨U菌生產(chǎn)2,3-丁二醇，經(jīng)無(wú)抗條件下連續(xù)傳代，產(chǎn)2,3-丁二醇能力下降。菌種的衰退和復(fù)壯菌種的提純和復(fù)壯概念：從已衰退的菌種中，通過(guò)分離純化，將尚未退化的個(gè)體分離出來(lái)，以恢復(fù)和建立具有原來(lái)生產(chǎn)性狀的群體，繼續(xù)供生產(chǎn)和科研使用。狹義的復(fù)壯：僅是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下通過(guò)純化分離和測(cè)定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，達(dá)到恢復(fù)原菌株固有特性的相應(yīng)措施。廣義的復(fù)壯：是一項(xiàng)積極地措施，是指在菌種的典型特性或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識(shí)的采取純種分離和生產(chǎn)性狀的測(cè)定工作。以期從中篩選到自發(fā)的正突變個(gè)體。菌種主要復(fù)壯方式菌種提純（梯度濃度稀釋涂布、劃線(xiàn)法、單胞分離法等）通過(guò)寄生體復(fù)壯（反復(fù)感染法）淘汰已衰退的個(gè)體（物理、化學(xué)方法處理）二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和保藏菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種的衰退與復(fù)壯菌種的保藏斜面低溫保藏法液體石蠟油保藏法液氮超低溫保藏法砂土管保藏法真空冷凍干燥法（5種經(jīng)典方法）菌種的保藏斜面低溫保藏法方法：接種適宜斜面培養(yǎng)基→培養(yǎng)→4℃保藏適用：各大類(lèi)菌種保藏期：1-3個(gè)月優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單易于推廣缺點(diǎn)：不宜長(zhǎng)時(shí)間保存，菌種易退化、污染液體石蠟油保藏法方法：斜面或半固體接種→培養(yǎng)→加無(wú)菌液蠟高出培養(yǎng)基1cm→4~15℃保藏適用于酵母、霉菌和好氧性細(xì)菌的保藏保藏期限一般為2-3年優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求不高缺點(diǎn)：不適用于利用石蠟或?qū)κ灻舾械奈⑸锉２鼐N的保藏菌種的保藏液氮超低溫保藏法方法：菌種培養(yǎng)→保護(hù)劑懸浮→加入保藏管中→置液氮瓶中適用于各類(lèi)微生物的保藏保藏期限4-15年優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求不高砂土管保藏法方法：孢子或芽孢懸液→加入無(wú)菌砂土管中→干燥封口→保藏適用于保藏干燥的菌種，尤其產(chǎn)芽孢微生物保藏時(shí)間因菌種而異優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，缺點(diǎn)：工作量大、費(fèi)人力菌種的保藏真空冷凍干燥法方法：菌種培養(yǎng)→用保