膽汁淤積性肝病患兒腸道菌群的特征分析,兒科論文

膽汁淤積性肝病患兒腸道菌群的特征分析,兒科論文摘要：目的:觀察并分析嬰兒膽汁淤積性肝病(ICH)腸道菌群特征。方式方法:收集武漢兒童醫(yī)院符合ICH標(biāo)準(zhǔn)的患兒及健康兒童糞便標(biāo)本20例。所有標(biāo)本均進(jìn)行16SrRNA高通量測(cè)序后,通過多樣性、LEfSe進(jìn)行差異分析,比擬ICH組和健康對(duì)照組兒童腸道菌群的構(gòu)成、糞菌豐度和差異性等特征差異。結(jié)果:ICH組患兒糞菌豐度(Chao1指數(shù))較健康對(duì)照組顯著降低(P0.05),多樣性(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。LEfSe軟件分析提示,在糞菌門水平方面,ICH組患兒糞菌放線菌門(Actinobacteria)豐度較健康對(duì)照組患兒顯著降低(LDA4,P0.05)。糞菌屬水平方面,ICH組患兒糞菌中腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)豐度均較健康對(duì)照組患兒顯著增加(LDA4,P0.05),而雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)豐度較健康對(duì)照組顯著降低(LDA4,P0.05)。結(jié)論:ICH患兒發(fā)生了腸道菌群紊亂,表現(xiàn)為腸道菌群豐度下降,有益共生菌(雙歧桿菌屬)減少,而時(shí)機(jī)致病菌(腸球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬)增加。本文關(guān)鍵詞語：嬰兒膽汁淤積性肝病;腸道菌群;高通量測(cè)序;Abstract：Objective:Toobserveandanalyzethecharacteristicsofgutmicrobiotainchildrenwithinfantilecholestatichepatopathy(ICH).Methods:Fecalspecimensof20childrenwhometICHstandardandhealthychildrenwerecollectedinWuhanChildrensHospital.After16SrRNAhigh-throughputsequencingofallspecimens,thecomposition,abundanceanddifferenceofgutmicrobiotabetweenthetwogroupswerecomparedbyalphapersity,LDAeffectsizeanalysis.Results:TheabundanceofthegutmicrobiotawaslowersignificantlyinICHgroup(Chao1index,P0.05).Buttherewasnosignificantdifferenceinpersity.Inparticular,Actinobacteria(LDA4,P0.05),Bifidobacterium(LDA4,P0.05)weresignificantlydecreasedinICH,whileEnterococcus(LDA4,P0.05),Streptococcus(LDA4,P0.05),andEnterobacter(LDA4,P0.05)weresignificantlyincreased.Conclusion:Dysbiosisofgutmicrobiotaoccurredinchildrenwithinfantilecholestatichepatopathy,andshowedthatbeneficalsymbioticbacteriadecreased,pathogenicbacteriaincreased.Keyword：infantilecholestatichepatopathies;gutmicrobiota;high-throughputsequencing;嬰兒膽汁淤積性肝病(ICH)是嬰兒肝病中就診和入院治療的首要原因[1],也是中國(guó)兒童終末期肝病肝移植的主要適應(yīng)癥[2],是嬰兒期致死或致殘的重要原因。肝臟與腸道,在胚胎階段均起源前腸,通過門靜脈互相關(guān)聯(lián),是解剖上的遠(yuǎn)親,功能上的近鄰。腸道菌群是調(diào)節(jié)肝臟生理、病理功能的重要介入者[3]。本研究擬通過細(xì)菌16SrRNA高通量測(cè)序,初步探尋求索ICH患兒腸道菌群特征,現(xiàn)報(bào)道如下。1、資料與方式方法1.1、一般資料選取2021年7月至2022年7月武漢兒童醫(yī)院收治的10例ICH患兒為研究對(duì)象,并選取健康嬰兒10例作為對(duì)照。兩組兒童間的性別和年齡(88.339.85)vs(72.727.11)d均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn),家長(zhǎng)知情并簽署知情同意書。1.2、納入排除標(biāo)準(zhǔn)ICH的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4,5]:①1歲以內(nèi)發(fā)病;②直接膽紅素(DBil)17mol/L(1mg/dl);血丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和(或)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)增高;③臨床伴有黃疸、糞便顏色變淺或白陶土樣便、尿色加深、肝臟質(zhì)地變硬或腫大(肋下可觸及2.0cm)。ICH組患兒納入標(biāo)準(zhǔn):①符合ICH的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4,5];②近1個(gè)月內(nèi)未接受微生態(tài)制劑或抗生素治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①不符合納入標(biāo)準(zhǔn);②其母孕期及哺乳期有長(zhǎng)期用藥及益生菌制劑應(yīng)用史。健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):①足月健康兒;②年齡1歲以內(nèi);③體格檢查及生化指標(biāo)均正常;④最近無感染性腹瀉、腸炎等病史;⑤近4周無抗生素及益生菌制劑等應(yīng)用史。健康對(duì)照組的排除標(biāo)準(zhǔn)與ICH組一致。1.3、研究方式方法將糞便標(biāo)本送至天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行高通量16SrRNA基因測(cè)序技術(shù)分析,其分析技術(shù)方式方法如下:①無菌器皿收集ICH患兒和健康兒童的新鮮糞便,分裝至滅菌凍存管后儲(chǔ)存到-80℃冰箱備用。②用QIAampDNAStoolMiniKit試劑盒提取糞便樣本DNA。③PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化:標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌16SrRNA基因V4區(qū)的PCR擴(kuò)增。引物信息:520F(5-AYTGGGYDTAAAGNG-3)802R(5-TACNVGGGTATCTAATCC-3)。④文庫(kù)制備與庫(kù)檢:采用標(biāo)準(zhǔn)的IlluminaMiseqPE250文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序流程。⑤測(cè)序及分析:Miseq上機(jī)測(cè)序,將所有分離的高質(zhì)量樣本序列做聚類分析,選取同源性97%的序列作為一個(gè)操作分類單位(OTU)。然后,以單個(gè)樣本中獲取的最低序列數(shù)作為OTU豐度的參照標(biāo)準(zhǔn),通過QIIME2分析多樣性。LEfSe差異分析(LEfSe)采用PythonLEfSe包進(jìn)行()。1.4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方式方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用x?s表示,正態(tài)分布且方差相等的連續(xù)變量采用t檢驗(yàn),否則使用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料選用2檢驗(yàn)。P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、結(jié)果2.1、兩組患兒糞菌Alpha多樣性分析ICH組患兒糞菌豐度顯著低于對(duì)照組,兩組間糞菌多樣性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。表1兩組兒童糞菌Alpha多樣性比擬2.2、兩組患兒糞菌物種構(gòu)成及豐度差異情況2.2.1、兩組患兒糞菌門水平構(gòu)造差異在門水平上共檢測(cè)到23個(gè)菌門,所測(cè)到的菌門中99.95%以上由變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)構(gòu)成。華而不實(shí)放線菌門、變形菌門和厚壁菌門是健康對(duì)照組糞群的三大主要菌門,三者共占糞菌的99.77%。變形菌門和厚壁菌門是ICH組中最具優(yōu)勢(shì)的兩大門類,其所占比例達(dá)81.48%(見圖1)。圖1兩組兒童糞菌間門水平構(gòu)造差異2.2.2、兩組患兒糞菌屬水平構(gòu)造差異在屬水平上共測(cè)得284個(gè)屬,前10位的菌屬為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、巨球型菌屬(Megasphaera)、梭狀桿菌屬(Clostridium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、埃希氏菌屬(Escherichia)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)。與健康對(duì)照組兒童比擬,ICH組患兒糞菌中雙歧桿菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬存在差異(見圖2)。圖2兩組兒童糞菌間屬水平構(gòu)造差異2.3、兩組患兒糞菌間LEfSe差異性分析在糞菌門水平上,與健康對(duì)照組比擬,ICH組患兒糞菌中放線菌門豐度較低,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(LDA4,P0.05),見表2。在糞菌屬水平上,與健康對(duì)照組比擬,ICH組患兒糞菌中雙歧桿菌屬豐度較低,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(LDA4,P0.05)。而腸球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬豐度均較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均LDA4,P0.05),見表3。表2兩組患兒糞菌間相對(duì)豐度較高菌門的比擬(%)表3兩組患兒糞菌間豐度存在顯著改變的菌屬比擬(%)3、討論肝臟與腸道之間通過門脈循環(huán)構(gòu)成嚴(yán)密的解剖、功能雙向聯(lián)通網(wǎng)絡(luò)。在ICH的發(fā)生和發(fā)展經(jīng)過中,腸道菌群通過調(diào)節(jié)新陳代謝、免疫反響、膽汁酸代謝發(fā)揮著重要的作用[6]。有研究表示清楚[7],腸道菌群能夠直接介入到ICH的發(fā)病機(jī)制中,因而研究腸道菌群具有重要價(jià)值。本研究采用16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析兩組患兒腸道糞菌分布情況,能彌補(bǔ)傳統(tǒng)的微生物體外培養(yǎng)導(dǎo)致的敏感性差、準(zhǔn)確率低等缺乏,可較全面地研究ICH患兒腸道菌群的變化。結(jié)果顯示,與健康對(duì)照組相比,ICH組患兒腸道糞菌多樣性無明顯變化,但門屬水平糞菌豐度存在不同程度改變。在門水平上,ICH組患兒糞菌中放線菌門豐度顯著降低。變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門豐度增高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在屬水平上,ICH組患兒糞菌中雙歧桿菌屬豐度顯著降低,腸球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬豐度顯著增高。該結(jié)果表示清楚ICH患兒腸腔正常優(yōu)勢(shì)菌屬(雙歧桿菌屬)受抑制,而條件致病菌屬(腸球菌屬、鏈球菌屬及腸桿菌屬)過度生長(zhǎng)。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)定植于腸道黏膜上皮細(xì)胞外表的雙歧桿菌屬,不僅能在定植區(qū)構(gòu)成物理性菌膜屏障,而且能上調(diào)上皮細(xì)胞間嚴(yán)密連接蛋白的表示出,發(fā)揮腸道屏障功能,進(jìn)而抑制潛在致病菌過度增長(zhǎng)。ICH患兒腸道糞菌雙歧桿菌屬豐度減少伴多種條件致病菌屬增長(zhǎng),存在腸道菌群失衡,這一結(jié)論與江鈴等[9]采用一代測(cè)序技術(shù)研究結(jié)論基本一致,但本研究分析了腸道菌群在門、屬不同水平的異同,所得結(jié)果相對(duì)全面準(zhǔn)確。在成人常見的膽汁淤積型肝病原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)患者中也發(fā)現(xiàn)存在腸道菌群失衡。Rossen等[10]發(fā)現(xiàn)PSC患者腸道梭菌目豐度降低,可能通過影響膽汁酸代謝及腸道微環(huán)境介入PSC發(fā)病。Sabino等[11]發(fā)現(xiàn)PSC患者糞便腸球菌、梭菌屬及乳桿菌豐度明顯增加。Torres等[12]發(fā)現(xiàn)PSC患者Blautia及Barnesiellaceae明顯增加,主要是梭菌目發(fā)生改變。盡管與成人膽汁淤積型肝病患者腸道菌群種和屬層面上的研究結(jié)果存在著不同,但不可否認(rèn)ICH嬰幼兒期患兒腸道菌群也發(fā)生了紊亂。研究證實(shí)腸道微生態(tài)紊亂能導(dǎo)致腸道致病菌釋放大量?jī)?nèi)毒素等各種毒素,嚴(yán)重?fù)p傷腸道屏障構(gòu)造和功能,誘導(dǎo)大量促炎細(xì)胞因子釋放,促進(jìn)慢性肝病的發(fā)生發(fā)展[13],因而調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡可能成為輔助治療ICH的新靶點(diǎn)。綜上所述,本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)明確了ICH存在腸道菌群紊亂,表現(xiàn)為腸道菌群物種的豐度降低,有益菌大量減少,條件致病菌增加,為后期ICH微生態(tài)學(xué)研究提供了部分根據(jù)。至于其腸道菌群中能否存在標(biāo)志性差異菌種,以及調(diào)控其菌群失衡對(duì)改善臨床療效方面作用怎樣,有待后期進(jìn)一步大樣本研究。以下為參考文獻(xiàn)[1]劉艷，黃志華．嬰兒膽汁淤積性肝病的診斷與治療[J]．臨床肝膽病雜志，2021,31(8):1218-1220．[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)器官移植學(xué)分會(huì)，中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)器官移植醫(yī)師分會(huì)．中國(guó)兒童肝移植臨床診療指南(2021版)[J]．臨床肝膽病雜志，2021,32(7):1235-1244．[3]王芳昭，崔茜如，曾雨濃，等．腸道菌群-肝臟疾病的重要介入者[J]．南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020,40(4):595-600．[4]MoyerV,FreeseDK,WhitingtonPF,etal.Guidelinefortheevaluationofcholestaticjaundiceininfants:recommendationsofthenorthAmericansocietyforpediatricgastroenterology,hepatologyandnutrit-ion[J].PediatrGastroenterolNutr,2004,39(2):115-128．[5]董永綏．嬰兒膽汁淤積性肝病研究進(jìn)展及瞻望[J]．中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2020,28(4):241-245．[6]朱琳，邢卉春．腸道菌群與膽汁淤積性肝病[J]．中華肝病雜志，2022,27(5):325-329．[7]TabibianJH,HaraSP,TrussoniCE,etal.Absenceoftheintestinalmicrobiotaexacerbateshepatobiliarydiseaseinamurinemodelofprimarysclerosingcholangitis[J].Hepatology,2021,63(1):185-196．[8]WangH,GongJ,WangW,etal.Arethereanydifferenteffectsofbifidobacterium,lactobacillusandstreptococcusonintestinalsensation,barrierfunctionandintestinalimmunityinPI-IBSmousemodel[J].PLoSOne,2020,9(3):e90153．[9]江玲，單慶文，王琳琳，等．嬰兒腸道菌群與分娩方式、喂養(yǎng)方式及膽汁淤積性肝病的關(guān)系[J]．實(shí)用兒科臨床雜志，2020,27(7):498-501．[10]RossenN