對流免疫電泳

免疫電泳技術(shù)

免疫電泳技術(shù)是將電泳與免疫擴散相結(jié)合的一種常用的免疫學(xué)實驗方法。沉淀反應(yīng)是可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當條件下發(fā)生特異性結(jié)合所出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。分類液體內(nèi)沉淀試驗絮狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀試驗免疫濁度測定凝膠內(nèi)沉淀試驗免疫擴散免疫電泳單向瓊脂擴散試驗雙向瓊脂擴散試驗火箭免疫電泳對流免疫電泳沉淀反應(yīng)火箭免疫電泳是將單向免疫擴散和電泳相結(jié)合的一種定量檢測技術(shù)。定量的抗原加入到含有一定量的相應(yīng)抗體的瓊脂糖凝膠中，在電場的作用下，引起抗原抗體的遷移和相互反應(yīng)，當抗原與抗體分子達到適當比例時，形成一個形狀如火箭的不溶性免疫復(fù)合物沉淀峰，峰的高度與待撿樣中的抗原濃度呈正相關(guān)。應(yīng)用當瓊脂中抗體濃度固定時，以不同稀釋度標準抗原泳動后形成的沉淀峰為縱坐標，抗原濃度為橫坐標，繪制標準曲線。根據(jù)樣品的沉淀峰長度即可計算出待測抗原的含量；反之，當瓊脂中抗原濃度固定時，便可測定待測抗體的含量(即反向火箭免疫電泳)。對流免疫電泳將雙向免疫擴散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。此法操作簡便，僅需30～60分鐘，靈敏度比雙向擴散高10～15倍；但缺點是特異性不如雙向瓊脂擴散高。實驗原理實質(zhì)上是定向加速的雙向免疫擴散技術(shù)。在pH8.6的緩沖液中，蛋白質(zhì)抗原帶負電荷向正極泳動；而抗體大部分屬于Ig，由于分子量大，暴露的極性基團較少，在離子瓊脂中泳動緩慢，同時受電滲作用的影響向負極泳動，在抗原抗體相遇的最適比例處形成乳白色沉淀線。電滲是指在電場中液體對于一個固定固體的相對移動。瓊脂是一種酸性物質(zhì)，在堿性溶液中帶負電荷，而與它接觸的溶液帶正電荷，因此液體向負極泳動，產(chǎn)生電滲沉淀線形狀、位置與抗原抗體擴散率及濃度的關(guān)系A(chǔ)：Ag、Ab濃度及擴散率近似；B：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag＞Ab；C：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag＜Ab；D：擴散率近似，濃度Ag＞Ab；E：濃度Ag＞Ab，擴散率Ag＞Ab；F：濃度Ag＜Ab，擴散率Ag＜Ab材料和試劑

1、AFP診斷血清：2、肝癌病人血清：（陽性對照）3、待檢血清：人血清4、陰性對照血清：正常人血清5、pH8.6、離子強度0.05M巴比妥緩沖液6、離子瓊脂：用巴比妥緩沖液配制。7、電泳儀8、其他：打孔器、移液器，槍頭操作步驟瓊脂糖凝膠板的制備打孔、加樣電泳結(jié)果觀察影響結(jié)果的因素制板、加樣、打孔用吸管吸取4ml加熱溶化的瓊脂鋪在載玻片上,待凝。打孔:用打孔器在瓊脂板上打孔(孔距4mm),如圖。加樣:將待測抗原樣品約10ul加在陰極側(cè)孔內(nèi),抗血清加在陽極側(cè),加樣時應(yīng)加滿小孔但不能溢出AbAgAb：甲胎蛋白診斷血清Ag：1、肝癌病人血清（陽性對照）2、正常人血清（陰性對照）3、待測血清123電泳將加好樣品的板置于電泳槽上，抗原孔置負極端，抗體孔置正極端。瓊脂板兩端分別用四層紗布與0.05mol/L、PH8.6的緩沖液相連，接通電源。電流以玻片的寬度計算，為4mA/cm；電壓以玻片的長度計算，為6V/cm；通電30-60min后，切斷電源，觀察結(jié)果結(jié)果和討論將玻片對著光，先觀察AFP陽性血清孔與抗體孔之間的白色沉淀線，然后再觀察待檢血清孔與抗體孔之間是否也有沉淀線出現(xiàn)，如有沉淀線，則表示AFP試驗陽性，否則AFP試驗為陰性。如沉淀線不清晰，可把瓊脂板放在濕盒中37℃數(shù)小時或置電泳槽過夜再觀察。

注意事項1.電泳時電流不宜過大，以免蛋白質(zhì)變性。2.抗原、抗體的電極方向不能放反。3.電泳所需時間與孔間距離有關(guān)，距離越大，電泳時間越長。4.抗原抗體濃度的比例：當抗原抗體比例不適合時，均不能出現(xiàn)明顯可見的沉淀線?？乖珴馓r都不易出現(xiàn)沉淀線。所以除了應(yīng)用高效價的血清外，每份待測樣品均可做幾個不同的稀釋度來進行檢查。

甲胎蛋白檢測意義：甲胎蛋白，簡稱AFP，是由胎兒肝細胞合成、在胎兒血清中正常存在的一種特殊蛋白。一般在妊娠后開始上升，至胎齡16～20周時達到最高峰，然后逐漸下降，至胎兒娩出后1-5周完全消失。此外，原發(fā)性肝癌、急、慢性肝炎、肝硬化也可升高。原發(fā)性肝癌患者，血清中AFP陽性率常明顯升高，超過400微克/升（放射免疫定量法），甚至達1000微克/升以上或呈進行性升高。AFP的檢測不