多位點序列分型

多位點序列分型

MultilocusSequencingTyping

MLST

Contents兩種分型方法的比較

MLST的步驟MLST的方案設(shè)計MLST的由來實例分析多位點酶電泳（Multilocusenzymeelectrophoresis,MLEE）根據(jù)酶的電泳遷移率的不同來描述變異

選定管家酶

淀粉膠檢測

不同電泳遷移速率

電泳譜等位基因的變異性揭示微生物基因多樣性MLEE的缺點不能推斷特殊位點的堿基序列不同實驗室間的分型結(jié)果不能進行比較MLST的首次使用MLST是由多位點酶電泳(MLEE)衍生出來的一種分型方法在1998年,Maiden等首次將MLST應用于腦膜炎奈瑟菌分型多位點序列分型（MLST）一種基于核酸序列測定的細菌分型方法通過PCR擴增多個管家基因內(nèi)部片段測定其序列，分析菌株的變異MLST的原理MLST方法一般測定6~10個管家基因內(nèi)部400~600bp的核苷酸序列，每個位點的序列根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的時間順序賦予一個等位基因編號，每一株菌的等位基因編號按照指定的順序排列就是它的等位基因譜，也即是這株菌的序列型（sequencetype,ST）。這樣得到的每個ST均代表一組單獨的核苷酸序列信息。序列型（ST）序列型（Sequence-typying,STs）等同于MLEE得出的電泳型(Electrophoretictype,ET）通過比較ST可以發(fā)現(xiàn)菌株的相關(guān)性,即密切相關(guān)菌株具有相同的ST或僅有極個別基因位點不同的ST,而不相關(guān)菌株的ST至少有3個或3個以上基因位點不同MLST分析方法MLST技術(shù)針對看家基因設(shè)計引物對其進行PCR擴增和測序,得出每個菌株各個位點的等位基因數(shù)值,然后進行等位基因圖譜(allelicprofile)或序列類型(sequencetypes,STs)鑒定，再根據(jù)等位基因圖譜使用配對差異矩陣(matrixpair-wisedifferences)等方法構(gòu)建系統(tǒng)樹圖進行聚類分析。MLST方案的設(shè)計三要素：選擇經(jīng)過初步篩選的菌株選擇具有獨特特征的基因位點設(shè)計用于基因擴增和序列測定的引物1.菌株的選擇根據(jù)已有的分型方法和流行病學資料，選擇100株左右具有代表性的菌株作為分析對象。理論上，這些選定的菌株要代表所研究細菌的群體，而不是僅僅包含那些對人致病的克隆。收集的菌株最好具有代表性，不僅僅由一個亞型組成。2.管家基因的確定全基因組序列的測定大大方便MLST位點的選擇一般選擇10到20株菌評價10至15個備選位點。最終采用7個位點進行后續(xù)實驗和分析。如果需要提高分辨力，可以加入個別非保守的基因，例如表面抗原基因或者毒力基因，這樣比增加管家基因的個數(shù)將更有效3.引物的設(shè)計目的片段長度：400~600bp所有引物調(diào)整為同一退火溫度，以適用于大范圍流行病學監(jiān)測和群體研究為了發(fā)現(xiàn)引物結(jié)合位點可能存在的變異，每個位點都應該設(shè)計一對以上引物/實際運用中，對于已有的成熟MLST方案的細菌，可直接從MLST數(shù)據(jù)庫中獲取方案。/MLST的步驟（二）

——核酸序列信息的獲取收集病原微生物標本基因組DNA的獲取PCR擴增目的基因片段目的片段的核酸序列測定整合核酸序列信息MLST的步驟（三）——結(jié)果分析結(jié)果分析根據(jù)分析的細菌群體組成1.以等位基因編號和ST編號為基本分析單位

提交到MLST分析網(wǎng)絡服務器（）

START和eBURST2.直接分析核苷酸序列

上傳到GenBank比對服務器進行BLAST比對驗證數(shù)據(jù)分析得到等位基因圖譜新的STs則找出對應的clonalcomplex在數(shù)據(jù)庫中找出相應的STs群體進化研究分子流行病學研究菌群結(jié)構(gòu)調(diào)查菌群遺傳學分析疾病的全球性監(jiān)控鑒定暴發(fā)性疾病的病原體MLST結(jié)果分析流程圖ST和克隆型遺傳學上具有相關(guān)性但并不相同的細菌的集合,被稱為是同源復合體(Theclonalcomplex),也叫克隆型。以其核心的基因型來命名。

MLST和PFGE的比較

——兩種不同的分子分型技術(shù)不同分子分型方法比較分型方法分型力可分辨率可重復性結(jié)果易解釋性易操作性費用RAPD較好較高一般一般簡便低PCR-RFLP好一般一般一般簡便低AFLP較好高一般好簡便中MLST較好較高好好簡便較高PFGE好高好好復雜較高MLVA很好高好好簡便高MLST和PFGE的比較

——兩種不同的分子分型技術(shù)脈沖場凝膠電泳（PFGE）比較所確定的高度變異片段高分辨力不適于進行全面的流行病學調(diào)查及生物進化分析不同實驗間重復性較差標準化技術(shù)數(shù)據(jù)庫多位點序列分型（MLST）比較進化較慢的位點標準化技術(shù)數(shù)據(jù)庫不同實驗室間重復性好不適用于同血清型菌株間比較MLST實例分析

1.MLST方案（同MLSTDatabase）

2.核酸序列信息的獲取2.1樣本來源54株結(jié)腸彎曲菌(C.coli)分離于2002年零售禽肉中，均為不重復菌株2.2PCR