動(dòng)物細(xì)胞工程

動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程基本概念應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)原理和方法（細(xì)胞融合或基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等），通過某種工程學(xué)手段（遺傳操作等），在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平上，按照人們的意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品（特定的蛋白制品）的一門綜合科學(xué)技術(shù)。單克隆抗體細(xì)胞融合細(xì)胞培養(yǎng)胚胎移植(提高產(chǎn)仔率)核移植(克隆牛、羊等)動(dòng)物細(xì)胞工程一、動(dòng)物細(xì)胞作為生物反應(yīng)器

動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的醫(yī)藥產(chǎn)品動(dòng)物細(xì)胞作為生物反應(yīng)器已得到迅速發(fā)展。利用動(dòng)物細(xì)胞可以準(zhǔn)確、有效地生產(chǎn)醫(yī)藥生物技術(shù)制品，如活性肽、單抗、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等。世界生物醫(yī)藥發(fā)展概況4000多個(gè)生物技術(shù)研發(fā)公司,提供40萬個(gè)就業(yè)機(jī)會(huì)96年世界藥品銷售額2840億美元，年增長(zhǎng)率為20%世界上一半的生物技術(shù)公司和專利屬于美國(guó)美國(guó)生物技術(shù)產(chǎn)品年銷售241億美元，年增長(zhǎng)率12%生物技術(shù)藥物年銷售76億美元，年增長(zhǎng)率12.6%全球生物技術(shù)藥物增長(zhǎng)迅猛（30%），高于全醫(yī)藥行業(yè)的增長(zhǎng)速度（<10%）2001年生物技術(shù)藥物銷售額>300億美元2006年生物技術(shù)產(chǎn)品銷售額將達(dá)到620億美元,其中生物技術(shù)藥物400~450億已批準(zhǔn)的由培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的部分藥品————————————————————————

產(chǎn)品臨床用途產(chǎn)生細(xì)胞

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干擾素 癌癥、病毒感染 Namalwa

干擾素 癌癥、病毒感染 CHOEPO 貧血 CHO

tPA

溶血栓 CHOVIII因子 血友病 CHO

乙肝表面抗原 疫苗 CHO

人生長(zhǎng)激素 侏儒癥 CHOGCSF 化療解救 CHO

單抗OKT3 腎移植 雜交瘤————————————————————————據(jù)報(bào)道，生物技術(shù)產(chǎn)品97年全球銷售額5000萬美元以上的共有15個(gè)，它們是Epogen(EPO,紅細(xì)胞生成素)，Humulin(胰島素)，Intron-A(α-IFN,α-干優(yōu)素)，Engreix-B(乙肝疫苗)，Cerezyme(葡萄腦苷脂酶)，Activase(t-PA,組織纖維蛋白溶酶原激活劑)，Humatrope(somatropin,hGH,生長(zhǎng)激素)，Reoprro(Gpllb/IIIa抗體)，Avonex(IFNβ-la,β-la干擾素)，Protropin/Nutropi(somatrem/somatropin)，Pulmozyme(α-鏈球菌DNA酶Dornase)，Proleukin(IL-2，白介素-2)和Leukine(GM-CSF,粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)，其中增加紅/白血球的1個(gè)藥銷售額32.7億美元,占15個(gè)藥銷售額的45.8%。十大基因工程藥物的前三位已經(jīng)排入世界前一百位處方的行列。經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)可用于臨床治療的抗體藥物———————————————————————————————————————————————————————

商品名用途特點(diǎn)年份

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Orthoclone

移植排斥 鼠源單抗 1986

ReoPro

心絞痛 嵌合抗體 1994

Rituxan

非何杰金淋巴瘤嵌合抗體 1997

Zenapax

移植排斥 人源化抗體 1997

Simulect

移植排斥 嵌合抗體 1998

Synagis

幼兒呼吸道病毒人源化抗體 1998

Remicade

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎嵌合抗體 1998

Herceptin

乳腺癌 人源化抗體 1998

Mylotarg

急性髓性白血病Cal-抗體 2000Campath-1H白血病 人源化抗體 2001

Zevalin

非何杰金淋巴瘤放射性抗體 2002

Humira

銀屑病、關(guān)節(jié)炎全人抗體 2002———————————————————————————————————————————————————————Baxxar(Tositumaomab,放射性抗體,Coulter公司,2003),Avastin(Bevacizumab,Genentech公司,2004).Erbitux(cetuximab,Imclone公司,2004).在美國(guó)，2006年將有25支生物新藥獲準(zhǔn)上市。其中包括安進(jìn)公司腸癌藥Panitumumab，Idenix公司的肝炎藥Telbivudine，Neurocrine科學(xué)技術(shù)公司的失眠藥Indiplon，和基因泰克公司的Lucentis。Genzyme公司的龐倍氏癥（Pompe，又稱2型糖原累積癥）藥物Myozyme分別向歐洲和美國(guó)的藥物監(jiān)管部門提出申請(qǐng)，有望在未來幾個(gè)月內(nèi)獲準(zhǔn)上市。舊有產(chǎn)品重新獲得市場(chǎng)發(fā)展機(jī)遇的典型是Biogen公司和Elan公司的多發(fā)性硬化癥藥物Tysabri。美國(guó)FDA已經(jīng)同意對(duì)Tysabri進(jìn)行補(bǔ)充性臨床試驗(yàn)。動(dòng)物細(xì)胞作為生物反應(yīng)器的必要性

1．細(xì)菌和酵母系統(tǒng)產(chǎn)生哺乳動(dòng)物蛋白并不能完成另人滿意，主要原因是該系統(tǒng)不一定能產(chǎn)生完成正確的哺乳動(dòng)物蛋白。

2．動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)往往經(jīng)過一系列的翻譯后修飾，才能成為成熟蛋白，而微生物系統(tǒng)不一定能實(shí)現(xiàn)翻譯后修飾。

3．翻譯后修飾因不同的蛋白而有差異，其中以糖基化最為常見，尤其對(duì)于分泌的蛋白更是如此，其他的修飾也可發(fā)生。

4．翻譯后修飾對(duì)某些蛋白的活性是不可缺少的。這些修飾也將影響蛋白在體內(nèi)的穩(wěn)定性、清除率以及組織分布等。蛋白翻譯后修飾的原因蛋白活性調(diào)節(jié)的需要蛋白相互作用的需要亞細(xì)胞水平定位的需要等哺乳動(dòng)物蛋白常見的翻譯后修飾—————————————————————————————————————————————————————糖基化(glycosylation)谷氨酸的g-羧化(g-carboxylation)門冬氨酸的b-羥化(b-hydroxylation)磷酸化與硫酸化(phosphorylation&sulphatation)蛋白水解加工(proteolyticprocessing)酰胺化(amidation)—————————————————————————————————————————————————————還有：甲基化、乙酰化、甲酰化、十四烷基化、異戊二烯基化、氨基化–去氨基化、二硫鍵形成、硝化等共兩百多種類型。蛋白質(zhì)翻譯后修飾的主要內(nèi)容泛素化糖基化磷酸化乙?；谆核鼗谏^程中的作用泛素化：泛素與其他蛋白共價(jià)結(jié)合，降解蛋白的過程。對(duì)于細(xì)胞分化、細(xì)胞器的合成、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、新蛋白的合成、調(diào)控細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬磉^程都起到很重要的作用。蛋白糖基化的作用糖基化在生物過程中起著重要作用，如免疫保護(hù)、病毒復(fù)制、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞之間黏附、炎癥的產(chǎn)生等。糖基化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中形成在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成的大部分蛋白是糖蛋白蛋白磷酸化的作用可逆的磷酸化過程幾乎涉及所有的生理及病理過程，如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤的發(fā)生、新陳代謝、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮以及細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化等。蛋白的乙?；饔媒M蛋白去乙酰化酶HDAC6能逆轉(zhuǎn)微管蛋白乙?；姆g后修飾癌腫瘤抑制蛋白的乙?；c細(xì)胞分化等相關(guān)組蛋白的乙?；阴；鰪?qiáng)轉(zhuǎn)錄去乙?；种妻D(zhuǎn)錄活性蛋白甲基化的作用組蛋白上的甲基化，不僅在真核細(xì)胞染色質(zhì)的遺傳外修飾中占有中心地位，對(duì)細(xì)胞分化、發(fā)育、基因表達(dá)、基因組穩(wěn)定性及癌癥研究均有深遠(yuǎn)的影響。其他類型的甲基化的異?；蚣谆傅耐蛔兂?huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的基本特征

1．需要用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞融合等方法建立必要的生產(chǎn)細(xì)胞系；

2．需要大量、高密度培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液與培養(yǎng)設(shè)備；

3．需要控制細(xì)胞的生長(zhǎng)與蛋白的表達(dá)；

4．在產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中出現(xiàn)一些可能影響安全性的副產(chǎn)品，包括細(xì)胞碎片蛋白、DNA、病毒等，需要在產(chǎn)品的純化過程中加以清除；

5．在細(xì)胞培養(yǎng)中可出現(xiàn)對(duì)細(xì)胞有害的副產(chǎn)品，如氨離子、乳酸等，應(yīng)在培養(yǎng)液的組成以及培育條件等方面考慮限制這些毒性產(chǎn)物的釋放。動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的問題1．產(chǎn)量低

與微生物系統(tǒng)比較，動(dòng)物細(xì)胞重組蛋白的產(chǎn)量較低。2．生產(chǎn)設(shè)備與技術(shù)復(fù)雜

細(xì)胞生長(zhǎng)慢，工藝條件要求高，易染菌。3．控制生產(chǎn)過程較困難

細(xì)胞生長(zhǎng)速度與產(chǎn)物表達(dá)量的控制要求高。4．細(xì)胞在培養(yǎng)過程中易受損傷

動(dòng)物細(xì)胞比微生物脆弱，培養(yǎng)條件要求苛刻。5．產(chǎn)品純化困難

培養(yǎng)液中含有大量外源性蛋白，原材料的質(zhì)量不好控制，如血請(qǐng)等。6．成本較高

所用儀器設(shè)備、培養(yǎng)基等材料價(jià)格貴。生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器在生物過程中起中心作用，是實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵設(shè)備，是連接原料和產(chǎn)物的橋梁。細(xì)胞或酶等生物催化劑（游離或固定化）生物反應(yīng)器空氣CO2等冷卻水原材料培養(yǎng)基滅菌底物產(chǎn)物廢物除菌檢測(cè)和控制產(chǎn)物預(yù)處理產(chǎn)品提取或液化副產(chǎn)物生物反應(yīng)器中復(fù)雜的相互關(guān)系細(xì)胞調(diào)節(jié)

過程操作

細(xì)胞環(huán)境

細(xì)胞形態(tài)反應(yīng)器特性生物反應(yīng)器1．?dāng)嚢枋?/p>

經(jīng)典的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器；2．氣升式

有氧傳遞速度大、傳熱效果及混合性能好；3．中空纖維管

細(xì)胞密度大、血清用量小、細(xì)胞不易受損；4．流化床式

比表面積大、適合培養(yǎng)各種細(xì)胞。5．堆積床式1．?dāng)嚢枋皆?/p>

（籠式攪拌器）2．氣升式

（氣腔式反應(yīng)器）

懸浮培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)用中空纖維反應(yīng)器：左右兩箭頭為無菌空氣進(jìn)出口。細(xì)胞生長(zhǎng)在由半透性的多孔膜制成的中空纖維中外表面。3．中空纖維管

中空纖維貼壁反應(yīng)器培養(yǎng)基出口細(xì)胞培養(yǎng)基入口4．流化床式

流化床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器的基本原理就是使支持細(xì)胞生長(zhǎng)的微粒呈流態(tài)化。圖所示為由膠原制成的微粒，具有像海綿一樣的多孔性，用非毒性物質(zhì)增加其比重，使之達(dá)到1.6或更高，以便它在高速向上流動(dòng)的培養(yǎng)波中里流態(tài)化。細(xì)胞就接種于這種微粒之中，通過反應(yīng)器垂直向上循環(huán)流動(dòng)的培養(yǎng)液使之成為流化床，并不斷提供給細(xì)胞必要的營(yíng)養(yǎng)成分，細(xì)胞得以在微粒中生長(zhǎng)。同時(shí)，新鮮培養(yǎng)液不斷地被加入，而培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物又不斷地被排除。流化床、攪拌式、微載休培養(yǎng)細(xì)胞密度的對(duì)比培養(yǎng)類型 細(xì)胞類型 細(xì)胞密度(cell/mL)流化床 雜交瘤 0.3×108流化床

貼壁依賴性 1.3×108恒化床

雜交瘤 2×106微載體攪拌釜 貼壁依賴性 0.2-2×107二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)：

10代以內(nèi)的組織培養(yǎng)細(xì)胞；

正常細(xì)胞：

10－50代未經(jīng)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)細(xì)胞；轉(zhuǎn)化細(xì)胞：重組DNA進(jìn)入受體的過程叫“轉(zhuǎn)化”,得到重組DNA的細(xì)胞叫“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”；細(xì)胞系:

BHK-21,CHO-K1,MDCK,MRC-5,Namalwa,Vero,WI-38。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官細(xì)胞懸浮液胰蛋白酶10代細(xì)胞原代培養(yǎng)50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞株無限傳代細(xì)胞系單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)已改變動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成有一定彈性和韌性的組織和器官。除單細(xì)胞原生動(dòng)物外，細(xì)胞培養(yǎng)過程具有以下特性；①細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需用抗生素；②動(dòng)物細(xì)胞較微生物大得多．無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；③培養(yǎng)過程需氧量少，且不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌形成的較大流體剪切力：④在培養(yǎng)中，細(xì)胞相互粘連以集群形式存在，培養(yǎng)過程具有群體效應(yīng)、錨地依賴性、接觸抑制性及功能全能性：⑤培養(yǎng)過程產(chǎn)物分布于細(xì)胞內(nèi)外，反應(yīng)過程成本較高，但產(chǎn)品價(jià)格昂貴；⑥大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，不可照用微生物反應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)；⑦原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)特性用于細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞系————————————————————————————————————————————————————————

細(xì)胞 來源 用途————————————————————————————————————————————————————————BHK-21 倉(cāng)鼠腎細(xì)胞 生產(chǎn)畜用疫苗

CHO-K1 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 表達(dá)重組蛋白

MDCK 狗腎細(xì)胞 生產(chǎn)畜用疫苗

MRC-5 人胚肺組織細(xì)胞 產(chǎn)生人用疫苗

Namalwa

淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞 生產(chǎn)a干擾素

Vero 猴腎臟成纖維細(xì)胞 生產(chǎn)人用制品

WI-38 胚肺組織細(xì)胞 生產(chǎn)人用疫苗————————————————————————————————————————————————————————細(xì)胞培養(yǎng)過程的放大1．篩選細(xì)胞系2．確定培養(yǎng)條件3．產(chǎn)物表達(dá)的優(yōu)化4．中試放大5．放大生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境1．培養(yǎng)用品的無菌處理

器材、培養(yǎng)基、試劑等；2．培養(yǎng)條件

水質(zhì)、pH、滲透壓、溫度、空氣、攪拌速度。細(xì)胞培養(yǎng)基1．天然培養(yǎng)基：血漿凝塊、血清淋巴液、胚胎浸液及羊水、腹水等。2．合成培養(yǎng)基：

DMEM、RPMI1640、Ham’sF12、IMDM等。包含氨基酸、糖、鹽類、維生素、激素、生長(zhǎng)因子等；10%血清。常用培養(yǎng)方法1．懸浮培養(yǎng)2．貼壁培養(yǎng)3．微載體培養(yǎng)（葡聚糖）4．包埋和微囊培養(yǎng)（瓊脂糖、海藻酸鈣凝膠）1.貼壁培養(yǎng)分散的細(xì)胞懸浮液在培養(yǎng)器中往往要貼附在壁上，這叫細(xì)胞貼壁。原來是圓形的細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展呈多種形態(tài)。此后細(xì)胞就開始有絲分裂并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般在數(shù)天后就鋪滿生長(zhǎng)表面，形成致密的細(xì)胞單層，叫做單層細(xì)胞.這種培養(yǎng)的方法又叫單層細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)中有一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象是細(xì)胞的接觸抑制。當(dāng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，就停止分裂增殖，長(zhǎng)成單層的細(xì)胞經(jīng)過一段時(shí)間，一定須在重新分散后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，使其繼續(xù)分裂增殖，這叫傳代。2.懸浮培養(yǎng)是指細(xì)胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長(zhǎng)的過程，主要用于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等。動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。由于動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)，如沒有細(xì)胞壁保護(hù)，不能耐受劇烈的攪拌和通氣，因此在許多方面又與經(jīng)典的發(fā)酵有所不同。對(duì)于小規(guī)程培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶和滾瓶培養(yǎng)，大規(guī)模培養(yǎng)多采用發(fā)酵罐式的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器。懸浮培養(yǎng)，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，有成熟的理論計(jì)算，可以借鑒微生物發(fā)酵的部分經(jīng)驗(yàn)，放大效應(yīng)小。但是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度較低，轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮培養(yǎng)有潛在致癌危險(xiǎn)，培養(yǎng)病毒易失去病毒標(biāo)記而降低免疫強(qiáng)度。此外，有許多動(dòng)物細(xì)胞屬于貼壁依賴性的，不能懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵是要選擇適當(dāng)?shù)臄嚢韬屯庋b置。3.微載體培養(yǎng)系統(tǒng)微載體是直徑為60~250μm的微珠。采用微裁體系統(tǒng)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，細(xì)胞貽壁于微載體上，微載體(和細(xì)胞)懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞在微載體表面逐漸生長(zhǎng)成單層。這種模式把單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)融匯在一起，具有兩種培養(yǎng)方法的優(yōu)點(diǎn)。1)表面積/體積比大；2)由于微裁體懸浮于培養(yǎng)基中，是均勻懸浮培養(yǎng)，簡(jiǎn)化了細(xì)胞生長(zhǎng)各種環(huán)境因素的監(jiān)測(cè)和控制，細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境亦均勻；3)培養(yǎng)基利用率高；4)采樣重演性好；5）收獲過程不復(fù)雜；6)放大較容易；7)勞動(dòng)強(qiáng)度小，占用空間小。4.包埋培養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)和對(duì)貼壁依賴生長(zhǎng)的細(xì)胞都適用，細(xì)胞生長(zhǎng)的密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)。對(duì)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞用海藻酸鈣包埋，對(duì)貼壁依賴生長(zhǎng)細(xì)胞用膠原包埋。由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)慢而費(fèi)用高，且對(duì)剪切力敏感，經(jīng)包埋后可有效的保護(hù)細(xì)胞。5.微囊化培養(yǎng)在動(dòng)物細(xì)胞微囊化制備中，主要是應(yīng)用海藻酸—聚氨基酸的方法，簡(jiǎn)單過程是動(dòng)物細(xì)胞與海藻酸溶液混合攪拌，經(jīng)過微囊發(fā)生器將微球滴入氯化鈣溶液中，形成凝膠，然后再用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，最后用檸檬酸處理去除微球內(nèi)的鈣離子，以便球內(nèi)的海藻酸成液態(tài)，動(dòng)物細(xì)胞得以懸浮在其中。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是關(guān)鍵材料。微囊化方法能使細(xì)胞處于相對(duì)穩(wěn)定、受剪切力小的環(huán)境中，而養(yǎng)分和氧又可以從微囊外的培養(yǎng)液擴(kuò)散進(jìn)入。1000L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式1．分批式操作2．半連續(xù)式操作（反復(fù)分批式或換液培養(yǎng)）3．流加式操作（半連續(xù)培養(yǎng)：分批培養(yǎng)過程中間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基）4．連續(xù)罐流式操作分批、連續(xù)、流加操作方式的比較大規(guī)模生產(chǎn)的操作1．培養(yǎng)基的配制2．種子細(xì)胞的制備3．雜交瘤細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)4．產(chǎn)品的分離純化5．產(chǎn)品的冷凍干燥單批細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)時(shí)間3.125ml62.5ml1.25L10kL500L25Lday16~20day21~25day11~15day28~32day1~5day8~12day6~10day13~17day18~22day15~19day20~24day23~27day25~29day21~25day30~34day26~30儲(chǔ)槽10kLday32day25后續(xù)純化分分離過程day26day33母細(xì)胞庫(kù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用

1．獲得細(xì)胞產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)生物制品，包括病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等；

2．制備燒傷病人植皮所需的皮膚細(xì)胞；

3．獲得檢測(cè)用細(xì)胞，檢測(cè)有毒物質(zhì)的毒性。三、動(dòng)物細(xì)胞的基因工程基因工程基本概念在生物體外，通過對(duì)DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。

動(dòng)物細(xì)胞的核酸轉(zhuǎn)移方法1．磷酸鈣沉淀法；2．DEAE－右旋糖酐法；3．脂質(zhì)體包被法；4．微量注射法；5．電脈沖法；6．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。1、化學(xué)法磷酸鈣沉淀法：目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并整合到受體細(xì)胞基因組中，在適當(dāng)條件下得以表達(dá)。方法簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率低。Ca2(PO4)2+DNA→混合微細(xì)顆粒（Ca離子濃度125mmol，DNA離子濃度5～0ug/ml，

PH7.0）↓沉淀反應(yīng)20~30min↓細(xì)胞在沉淀物中暴露5~24h2、物理方法電穿孔法（electroporotion）將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過電壓使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)。瞬間細(xì)胞細(xì)胞膜核摸通透性增加高壓脈沖

DNA滲入細(xì)胞顯微注射法（microinjection）

利用顯微操作把目的基因直接注入靶細(xì)胞或細(xì)胞核中clonesheepDolly體細(xì)胞提取核

重組細(xì)胞

回植Dolly卵細(xì)胞去核細(xì)胞外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)1．降解2．游離狀態(tài)3．整合到宿主細(xì)胞的染色體病毒表達(dá)載體Adenovirus,SV40,Polyoma,Her