第一節(jié)概述生化分析

第一節(jié)

概述（generalization）

在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。第六章電泳分離技術(shù)

1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；第一次的自由溶液電泳；第一臺(tái)電泳儀；帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度中泳動(dòng)的速度稱遷移率或泳動(dòng)度(mobility)，可用下式表示：μ=νE=d/tV/L式中μ：泳動(dòng)度cm2／(V·s)；ν：顆粒泳動(dòng)速度(cm／s)；E：電場(chǎng)強(qiáng)度(V／cm)；d：顆粒泳動(dòng)的距離(cm)；t：通電時(shí)間(s或min);V：實(shí)際電壓(V)；L：支持物的有效長(zhǎng)度(cm)。一、泳動(dòng)度（遷移率）基本原理二、影響泳動(dòng)度的因素1.顆粒性質(zhì)顆粒的直徑、形狀及所帶靜電荷量對(duì)泳動(dòng)速度有較大影響。一般來(lái)說(shuō)顆粒帶凈電荷量越多，顆粒越小，或其形狀越接近球形，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度就越快。反之則越慢。

2.電場(chǎng)強(qiáng)度（電位梯度或電勢(shì)梯度）單位長(zhǎng)度（每一厘米）支持物體上的電位降。電場(chǎng)強(qiáng)度越高，帶電顆粒泳動(dòng)越快。根據(jù)電場(chǎng)強(qiáng)度的不同，電泳可分為兩種。(1)常壓電泳(100---500V)：其電場(chǎng)強(qiáng)度為2~10V/cm。分離時(shí)間較長(zhǎng)，從數(shù)小時(shí)到數(shù)十小時(shí)，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。(2)高壓電泳(500---10000V)：其電場(chǎng)強(qiáng)度為70~200V/cm，電泳時(shí)間很短，有時(shí)只需幾分鐘。多用于分離氨基酸、多肽、核苷酸、糖類等小分子物質(zhì)。需冷卻裝置。3.溶液的性質(zhì)主要是指電極溶液（緩沖溶液）和蛋白質(zhì)樣品溶液的pH值、離子強(qiáng)度和粘度等。（1）pH值：溶液pH值決定帶電顆粒的解離程度，也決定了其帶凈電荷的量。對(duì)蛋白質(zhì)、氨基酸而言，當(dāng)pH值等于其pI時(shí)，凈電荷為0，μ也為0。溶液的pH值離其等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，則其帶凈電荷量就越多，從而泳動(dòng)速度就越快。反之，則越慢。因此電泳時(shí)應(yīng)選擇適宜的pH值，并需采用緩沖溶液，使溶液的pH值恒定。（2）離子強(qiáng)度：溶液的離子強(qiáng)度一般在0.02－0.2之間時(shí)，電泳較合適。若離子強(qiáng)度過(guò)高，則會(huì)降低顆粒的泳動(dòng)速度。其原因是，帶電顆粒能把溶液中與其電荷相反的離子吸引在自己周?chē)纬呻x子擴(kuò)散層。若離子強(qiáng)度過(guò)低，則緩沖能力差，往往會(huì)因溶液pH值變化而影響泳動(dòng)的速率。在保持足夠緩沖能力前提下，離子強(qiáng)度要最小。（3）溶液粘度：泳動(dòng)度與溶液粘度是成反比關(guān)系。因此，粘度過(guò)大或過(guò)小，必然影響泳動(dòng)度。4.電滲當(dāng)支持物不是絕對(duì)惰性物質(zhì)時(shí)，常常會(huì)有一些離子基團(tuán)如羧基、磺酸基、羥基等吸附溶液中的正離子，使靠近支持物的溶液相對(duì)帶電。在電場(chǎng)作用下，此溶液層會(huì)向負(fù)極移動(dòng)。反之，若支持物的離子基團(tuán)吸附溶液中的負(fù)離子，則溶液層會(huì)向正極移動(dòng)。這種溶液層的泳動(dòng)現(xiàn)象稱為電滲。因此，當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與電滲方向一致時(shí)，則加快顆粒的泳動(dòng)速度；當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與電滲方向相反時(shí)，則降低顆粒的泳動(dòng)速度。5.焦耳熱在電泳過(guò)程中，電流強(qiáng)度與釋放出熱量（Q）之間的關(guān)系可列成如下公式：

Q＝I2Rt

式中R為電阻；t為電泳時(shí)間；I為電流強(qiáng)度。公式表明，電泳過(guò)程中釋放出的熱量與電流強(qiáng)度的平方成正比。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度或電極緩沖液中離子強(qiáng)度增高時(shí)，電流強(qiáng)度會(huì)隨著增大。這不僅降低分辨率，而且在嚴(yán)重時(shí)會(huì)燒斷濾紙或熔化瓊脂糖凝膠支持物。

6.篩孔支持物瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等的篩孔，在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒泳動(dòng)速度快。反之，則泳動(dòng)速度慢。三、電泳的分類1.顯微電泳用顯微鏡直接觀察細(xì)胞等大顆粒物質(zhì)電泳行為的過(guò)程。目前已用于研究膜結(jié)構(gòu)及癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異性等方面。2.自由界面電泳又稱移動(dòng)界面電泳，是指在沒(méi)有支持介質(zhì)的自由溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能完全地分離混合物的各個(gè)組成等一些不可克服的缺點(diǎn)，已逐漸為區(qū)帶電泳所代替。目前電泳的類型很多，最常見(jiàn)的是區(qū)帶電泳，由于在支持物上電泳時(shí)各組分因遷移速度不同被分離成若干區(qū)帶而得名。3.區(qū)帶電泳按支持物種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤(pán)球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒(méi)有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。淀粉凝膠電泳：天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，且批間質(zhì)量相差很大，結(jié)果重現(xiàn)性差，電泳時(shí)間長(zhǎng)，操作麻煩，分辨率低，很少使用。瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。分辨率較高。根據(jù)支持介質(zhì)性狀不同，區(qū)帶電泳可分為：薄層電泳、板電泳、柱電泳。根據(jù)用途不同，區(qū)帶電泳可分為：分析電泳、制備電泳、定量免疫電泳。紙電泳是以濾紙為支持體的電泳技術(shù)。根據(jù)電場(chǎng)強(qiáng)度的不同，可分為常壓紙電泳和高壓紙電泳兩類。高壓電泳速度快，適用于小分子物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多肽、糖類等的分離；但由于其電壓高，發(fā)熱量大，需附有冷卻裝置。常壓電泳設(shè)備簡(jiǎn)單，適用于大分子物質(zhì)的分離，但電泳速度較慢，區(qū)帶易擴(kuò)散。

紙電泳一、緩沖液的選擇1.首要條件：保證分離組分在此系統(tǒng)的溶解性能、穩(wěn)定性能及生物活性

2.有較高的電泳速度3.有較高的分辨率4.對(duì)顯色劑和紫外光吸收等觀察電泳區(qū)帶的方法沒(méi)有影響。二、濾紙的選擇與剪裁1.一般采用層析濾紙。2.電泳分離所用的濾紙應(yīng)選用紙質(zhì)均勻和吸附力小的。3.雙向電泳用正方形濾紙。三、電泳操作要點(diǎn)1．點(diǎn)樣對(duì)于未知樣品，初次試驗(yàn)時(shí)應(yīng)將樣品點(diǎn)在紙中央，以觀察樣品電泳時(shí)的移動(dòng)方向；對(duì)于已知樣品，原點(diǎn)位置應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行選擇，但必須距離緩沖液液面5cm以上，濾紙兩端應(yīng)標(biāo)明電極的極性“+”或“－”。原點(diǎn)形狀一般呈圓形或長(zhǎng)條形，但長(zhǎng)條形分離效果較好。但樣品量少時(shí)，則呈圓點(diǎn)，便于顯色和定性。

點(diǎn)樣方法濕點(diǎn)法：將裁好的濾紙全部浸入緩沖液中，濕潤(rùn)后，取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，置電泳槽架上，將濾紙兩端浸入緩沖液中，然后用微量注射器精密點(diǎn)加供試品溶液。樣品液要求較濃，不宜多次點(diǎn)樣。干點(diǎn)法：將供試品溶液點(diǎn)于濾紙上，吹干、再點(diǎn)，反復(fù)數(shù)次，直至點(diǎn)完規(guī)定量的供試品溶液，然后用噴霧器將濾紙噴濕，點(diǎn)樣處最后噴濕，本法適用于稀的供試品溶液。

2.電泳電泳時(shí)，電泳槽應(yīng)放平，兩個(gè)槽的液面應(yīng)保持同一水平，電泳槽應(yīng)蓋上斜頂蓋子，以防緩沖液蒸發(fā)并避免冷凝水滴落在電泳紙上。電泳時(shí)，應(yīng)調(diào)節(jié)好電壓并使之穩(wěn)定，并要注意電泳時(shí)間。電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，取出電泳紙烘干或吹干。3.顯色不同物質(zhì)采用不同的顯色方法。核酸類物質(zhì)可在紫外光下觀察，但大多數(shù)物質(zhì)需用顯色劑顯色。(1)蛋白質(zhì)的顯色①溴酚藍(lán)顯色法：蛋白質(zhì)處呈藍(lán)色②氨黑10B顯色法：蛋白質(zhì)處呈藍(lán)黑色③偶氮胭脂紅B顯色法：蛋白質(zhì)處呈櫻紅色(2)氨基酸顯色法

①茚三酮顯色法：一般為紫色②靛紅(吲哚醌)顯色法：各種氨基酸呈不同顏色醋酸纖維素薄膜電泳的優(yōu)點(diǎn)①分離效果好。對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無(wú)“拖尾”現(xiàn)象，染色后背景能完全脫色。

②快速省時(shí)。由于親水性較濾紙小，電滲作用小，電泳時(shí)大部分電流是由樣品傳導(dǎo)的，所以分離速度快。③靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需2μL血清④應(yīng)用面廣。某些蛋白質(zhì)在紙上電泳不易分離，如胎兒甲種球蛋白、溶菌酶、胰島素、組蛋白等用醋酸纖維素薄膜電泳能較好地分離。⑤易保存，易定量。醋酸纖維素薄膜電泳染色后，經(jīng)冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于掃描定量及長(zhǎng)期保存。薄層電泳是將支持物與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)厚度的薄層而進(jìn)行電泳的技術(shù)。常用的支持物有淀粉、瓊脂、纖維素粉、硅膠等。其中以淀粉最為常用。由于淀粉易成型，對(duì)蛋白質(zhì)吸附少，樣品易洗脫，電滲作用低，分離效果好，所以淀粉板薄層電泳廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽、酶和核酸的分離。

淀粉板薄層電泳1．緩沖液的選擇

淀粉板薄層電泳所用緩沖液可用紙電泳的緩沖液。但由于淀粉顆粒有離子交換作用，因此必須采用離子強(qiáng)度較高的緩沖液(0.05-0.1mol／L)2．支持物的處理

薄層電泳所用的支持物需用精制品。3．薄層板的制作

在玻璃板上鋪上蠟紙，放上尺寸適宜的框架；將精制淀粉與緩沖液混勻后倒進(jìn)框架中，靜置十余小時(shí)。待淀粉沉降后，除去上清液。至淀粉表面稍干，取去框架即成淀粉薄層板。4．加樣在淀粉板中間，用小刀挖出淀粉成一條約寬5mm大小的溝，將樣品與挖出之淀粉混勻后，重新填入原處壓平。淀粉板兩端用幾層紗布與兩極的緩沖液連接，通上電流，電泳一定的時(shí)間。

5．電泳斑紋的觀察可用印染法觀察電泳斑紋位置：即在電泳結(jié)束后，取一張與薄層板大小相同的濾紙，用緩沖液浸濕后平放于薄層板上，輕輕壓平。2～3min后，取下濾紙吹干顯色，即可觀察到斑紋位置；按印染法所確定的位置，將薄層板分段切開(kāi)，可將各組分分別洗脫下來(lái)。一、瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)

天然瓊脂(agar)是一種多聚糖，主要由瓊脂糖(agarose，約占80％)及瓊脂果膠(agaropectin)組成。優(yōu)點(diǎn)：①操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品不須事先處理就可進(jìn)行電泳。②瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大(約占98％～99％)，近似自由電泳，樣品擴(kuò)散度較自由電泳小，對(duì)樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。③瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫外光燈監(jiān)測(cè)及定量測(cè)定。④電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)期保存。二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸的分離作用主要依據(jù)它們的相對(duì)分子質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時(shí)與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。1.核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系(1)DNA分子的大小

在凝膠中，DNA片段遷移距離(遷移率)與堿基對(duì)的對(duì)數(shù)成反比，因此通過(guò)已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離進(jìn)行比較，便可測(cè)出未知片段的大小。應(yīng)用凝膠電泳可以正確的測(cè)定DNA片段的分子大小。使用的方法是在同一膠上加一已知其相對(duì)分子質(zhì)量的樣品。電泳完畢后，經(jīng)溴化乙錠染色，照相，從照片上比較待測(cè)樣品中的DNA片段與標(biāo)準(zhǔn)品中的哪一條帶最接近，即可推算出未知樣品中各片段的大小。目前許多試劑公司都能提供各種不同相對(duì)分子質(zhì)量比的標(biāo)準(zhǔn)樣品。通常以相對(duì)遷移率mR來(lái)表示遷移率，相對(duì)遷移率的計(jì)算方法如下：相對(duì)遷移率mR=樣品遷移距離（cm）染料遷移距離（cm）(2)瓊脂糖的濃度

瓊脂糖濃度/%0.30.60.70.91.21.52.0線狀DNA大小/kb60~520~110~0.87~0.56~0.44~0.23~0.1瓊脂糖濃度與DNA分離范圍2．核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗矁r(jià)閉環(huán)超螺旋DNA>直線DNA>開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA

(2)緩沖液系統(tǒng)

常用的電泳緩沖液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，濃度約為50mmol／L(pH7.5—7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時(shí)稀釋到所需倍數(shù)。3．電泳方法

(1)凝膠類型

用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。(4)樣品配制與加樣

DNA樣品用適量的Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25％溴酚藍(lán)或其他指示染料，含有10％～15％蔗糖或5％～10％甘油，以增加其比重，使樣品集中。(5)電泳

為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不