第5章 體細胞胚胎發(fā)生 副本

第5章體細胞胚胎發(fā)生1.體細胞胚胎發(fā)生的概念1.1胚狀體（embryoid，非合子胚）在離體培養(yǎng)條件下，植物離體培養(yǎng)的細胞、組織、器官也可以產生類似胚的結構，其形成也經歷一個類似胚胎的發(fā)生和發(fā)育過程，這種類似胚的結構稱為胚狀體（圖4－1）。

圖4－1胚狀體1.2體細胞胚胎發(fā)生

（somaticembryogenesis）由單細胞（體細胞）或一群細胞被誘導不斷再生非合子胚，并萌發(fā)形成完整植株的發(fā)育過程稱為體細胞胚胎發(fā)生。發(fā)生過程見圖4－2（p61)。圖4－2體細胞胚胎發(fā)生的各個時期單個細胞經過反復的細胞分裂形成一個小細胞團，它經歷球形期、心形期和魚雷形期的發(fā)育過程之后，最終由體細胞胚長成一個小植株。（Dodds和Roberts，1995）Kohlenbach關于胚的分類:(1)合子胚：由受精卵或合子形成的胚。(2)非合子胚：由合子之外的細胞形成的胚。體細胞胚—由孢子體細胞（除合子外）離體培養(yǎng)形成的胚。非體細胞胚—即指芽、短枝、愈傷組織、花粉胚、塊莖、球莖等繁殖體。孤雌生殖胚—由未受精卵形成的胚。孤雄生殖胚—由雄配子體（小孢子花粉粒）形成的胚。2.

體細胞胚胎發(fā)生的途徑直接途徑：指從培養(yǎng)中的器官、組織、細胞或原生質體某些部位的胚性細胞直接誘導分化出體細胞胚胎，中間不經過愈傷組織階段(圖4－3A，圖4－3B)。這種“胚性細胞”是在胚胎發(fā)生之前就已“決定”了的。間接途徑：指外植體先脫分化形成愈傷組織，再從愈傷組織的某些細胞，即重新“決定”為胚性細胞的細胞分化出體細胞胚胎(圖4－3C)。圖4－3植物體細胞胚胎發(fā)生方式示意圖A．由外植體外層細胞直接產生體細胞胚；B．由外植體組織內的細胞產生體細胞胚；C．愈傷組織表層細胞分化為體細胞胚(引自王亞馥等，2000)多數(shù)體細胞胚胎的形成是通過間接途徑產生的。它通常分兩個階段完成：①胚胎發(fā)生叢（embryogenicclump，EC）的形成。②胚狀體的發(fā)育。EC在轉入降低或去除生長素、降低還原氮的培養(yǎng)基后，才能完成胚狀體發(fā)育。關于體細胞胚胎的起源：體細胞胚胎究竟起源于單細胞還是多細胞，目前仍然有爭論。但研究結果發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)體細胞胚起源于單細胞（例子？）。但也有人認為它們起源于一個以上的細胞（證據？）體細胞胚發(fā)生的實質是細胞分化，即細胞在離體培養(yǎng)條件下，誘導部分基因開放，實現(xiàn)遺傳信息的表達。3.影響體細胞胚胎發(fā)生的因子對于體細胞胚胎發(fā)生特別重要的是培養(yǎng)基中的兩種成分，即生長素和氮源。

3.1生長素例子1：胡蘿卜體細胞胚的發(fā)育（p65～66）

結論：在增殖培養(yǎng)基中生長素的存在，對于胚性細胞團后來在成胚培養(yǎng)基上發(fā)育為胚是必不可少的。因此，可把增殖培養(yǎng)基看成是體細胞胚胎發(fā)生的“誘導培養(yǎng)基”。

例子2：咖啡體細胞胚的發(fā)育（p66）

例子3：對甜橙馴化愈傷組織的詳細研究，也證實了生長素對胚胎發(fā)生的重要作用（p66～67）

。最終結論：對于離體條件下體細胞胚胎發(fā)生來說，一個最低限度的內源或外源生長素是必不可少的。

成功誘導體細胞胚胎發(fā)生的步驟：第一步，在生長素濃度高(2,4-D0.5～1mg／L)的培養(yǎng)基（增殖培養(yǎng)基）上誘導和增殖愈傷組織，高濃度生長素誘導愈傷組織局部細胞形成的分生組織細胞，稱為胚性細胞團(EC)。第二步，將EC轉移到極低水平生長素(0.01～0.1mg／L)或完全無生長素的培養(yǎng)基（胚發(fā)育培養(yǎng)基）上，EC發(fā)育為成熟胚胎。其它激素的作用：細胞分裂素：BAP可促進胡蘿卜愈傷組織的細胞分裂，但抑制它的成胚潛力；ZT促進；咖啡葉片愈傷組織要求激動素與生長素比例高。赤霉素：能抑制體細胞胚胎發(fā)生3.2氮源除生長素外，培養(yǎng)基中氮源的形態(tài)也會顯著影響離體條件下的胚胎發(fā)生。體細胞胚誘導和成熟需要大量氮素，通常為還原態(tài)氮如銨鹽。例子1：野生胡蘿卜體細胞胚誘導例子2：栽培胡蘿卜體細胞胚誘導培養(yǎng)基中還原態(tài)氮和硝酸鹽(NH4Cl＋NO3－)組合似乎更有利于許多培養(yǎng)體系的體細胞胚胎誘導。欲使胡蘿卜培養(yǎng)細胞形成體細胞胚，必須有一個最低數(shù)量的內源NH4＋存在(每千克鮮重的組織約5mmol)。如果內源NH4＋達不到這個臨界值，細胞就不能進行胚胎分化。而要使細胞內NH4＋達到這個水平，不但需要有很少量的外源NH4＋存在(2.5mmol／L)，還需要供應相對濃度很高的NO3－(60mmol／L)。雖然對于胚胎發(fā)生來說，其他形式的還原態(tài)氮都不如NH4＋有效，但水解酪蛋白、谷氨酰胺和丙氨酸等也可用做可靠的代替品。3.3其他因子鉀的濃度：在野生胡蘿卜中，高濃度的鉀（20mmol／L）是胚胎發(fā)生所必需的。

溶解氧的含量：培養(yǎng)基中溶解氧的含量應低于一個臨界值（1.5mg／L）。活性炭：培養(yǎng)基中加入活性炭也能提高胡蘿卜細胞胚胎發(fā)生的頻率。某些揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質：抑制愈傷組織中的體細胞胚胎發(fā)生。

4.體細胞胚胎發(fā)生的解剖學和細胞學在胡蘿卜懸浮培養(yǎng)中，對愈傷組織形成和生長的解剖學和組織學的研究表明，在培養(yǎng)中存在著兩種類型的細胞：①自由分散在培養(yǎng)基中的大而高度液泡化的細胞，一般不具胚胎發(fā)生潛力。②成簇成團存在的體積小而細胞質致密的細胞，具成胚潛力。5.體細胞胚成熟和植株發(fā)育用脫落酸處理，體細胞胚可以發(fā)育成熟。高水平生長素能抑制莖尖分生組織發(fā)育，當胚性細胞懸浮液轉入缺乏生長素的培養(yǎng)基時，胚胎常能發(fā)育成熟。與ABA結合，加入低水平的細胞分裂素（玉米素0.1μmol／L）可能有利于低密度細胞培養(yǎng)的胚胎發(fā)生。體細胞胚胎發(fā)生可能重復發(fā)生，從成熟體細胞胚上又形成一些胚胎發(fā)生的新中心。體細胞胚的萌發(fā)階段受到體細胞胚高度不同步發(fā)育的不利影響。各種物理因素也可能影響體細胞胚成熟，如溫度、蔗糖濃度、光照等。體細胞胚在無植物生長調節(jié)劑的瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)。單胚萌發(fā)的培養(yǎng)基最好添加低水平的玉米素(0.lmmol／L)。小植株形成大量葉片以后，應將其移栽到營養(yǎng)缽或蛭石中繼續(xù)生長和發(fā)育。6.體細胞胚與合子胚的比較自學內容（p71~72）7.胚性培養(yǎng)物形態(tài)發(fā)生潛能的喪失7.1遺傳假說培養(yǎng)細胞中細胞核物質變化，如多倍性、非整倍性和染色體結構突變，可能與長期培養(yǎng)物器官發(fā)生或胚胎發(fā)生潛能喪失有關。這種由遺傳原因造成的形態(tài)發(fā)生潛力的喪失是不可逆的。7.2生理假說在某些情況下，形態(tài)發(fā)生潛力的下降可能是由于細胞或組織內激素平衡關系的改變造成的，或是由于細胞對外源生長調節(jié)物質敏感性的改變造成的。在這種情況下，細胞雖然停止了器官和胚胎的分化，但不一定就喪失了這種分化能力。因而，在這種情況下，如果改變外部處理條件，有可能夠恢復細胞形態(tài)發(fā)生的潛能（器官和胚胎分化）。7.3競爭假說在復合多細胞外植體中，只有少數(shù)細胞能產生胚性細胞團，其余細胞沒有細胞全能性。按照競爭假說，在有利于非胚性細胞生長的條件下，外植體中的非胚性細胞大量增殖，結果在不斷反復繼代培養(yǎng)的過程中導致胚性細胞逐漸消失。到了一定時期之后，培養(yǎng)物中已不再含有任何胚性細胞，這時若想再恢復它們的胚胎發(fā)生能力就不可能了。7.3競爭假說如果培養(yǎng)物中尚存少量胚性細胞，它們由于非胚性細胞的抑制作用，不能表達自身的細胞全能性，此時可以通過改變培養(yǎng)基成分，選擇性地增殖具有胚發(fā)生全能性的細胞，有可能恢復培養(yǎng)物形態(tài)發(fā)生的潛能。8.體細胞胚胎發(fā)生的實際應用8.1無性繁殖由于胚性細胞生長和隨后的體細胞胚發(fā)育可以在液體培養(yǎng)基中進行，所以將體細胞胚發(fā)生與工程技術結合，可以建立大規(guī)模的機械化或自動化培養(yǎng)體系。這種培養(yǎng)體系能循環(huán)生產大量的繁殖體（體細胞胚胎），且成本低廉。通過重復體細胞胚胎發(fā)生形成體細胞胚無性系。8.2人工（合成）種子的制備植物人工種子（plantartificialseed）概念最早由Murashige（1978）提出，它是指將植物離體培養(yǎng)中產生的體細胞胚或能發(fā)育成完整植株的分生組織（芽、愈傷組織、胚狀體等）包埋在含有營養(yǎng)物質和具有保護功能的外殼內形成的在適宜條件下能夠發(fā)芽出苗的顆粒體（圖4－4，圖4－5）。圖4－4人工種子圖4－5人工種子萌發(fā)形成的幼苗通過用人工種皮包被體細胞胚而制造人工種子（或稱合成種子），用以繁殖遺傳工程植物、減數(shù)分裂不穩(wěn)定的基因型、自交不親合植物、稀有的和珍貴的物種或遠緣雜交種，以及通過人工授粉而得到的雜種等是當前的一個研究熱點之一。8.2.1單胚人工種子的制造過程人工種子由包裹在防護層中的體細胞胚組成（圖4－6），在制造單胚人工種子的時候，主要采用諸如藻酸鈉一類的水凝膠作為體細胞胚的包被物質。當體細胞胚與藻酸鈉混合以后，再滴人到硝酸鈣或氯化鈣溶液（100mmol／L）中，30min內表面即可完全絡合，形成一層持久的種皮（圖4－7，圖4－8）。圖4－6人工種子示意圖（引自Redenbaugh，1990）圖4－7用漏斗分離器生產藻酸鈣包被的人工種子（引自Redenbaugh，1990）圖4－8人工種子的制作表4－1可用于包被體細胞胚的幾種水凝膠水凝膠濃度(％，W／V)絡合劑濃度(mmol／L)藻酸鈉0.5～5.0鈣鹽30～100藻酸鈉及明膠2.05.0鈣鹽30～100角叉藻聚糖及洋槐豆膠0.2～0.80.4～1.0KCl或NH4CI500表4－1列出了可用做種皮材料的各種水凝膠。此外，在種皮基質中還可加入一些對體細胞胚有益的物質，如能促進生長的微生物、營養(yǎng)物質、生長調節(jié)物質、殺蟲劑以及用于旱地播種的親水性化合物等作為人工胚乳。

8.2.2工業(yè)化生產人工種子首先，必須建立起適當?shù)慕M織培養(yǎng)技術體系，從中能產生高質量的大小一致和發(fā)育期同步的、功能像合子胚一樣的體細胞胚。

促成體細胞胚同步發(fā)育的途徑：（p75~76）（1）使用DNA合成抑制劑或低溫培養(yǎng)（2）過篩（3）利用滲透壓控制胚胎發(fā)育同步性

其次，還必須建立大規(guī)模自動化的液體培養(yǎng)體系，以便生產數(shù)量足夠的體細胞胚。此外，生產具有適當水分含量的種皮的方法，摻入營養(yǎng)物質和其他附加物質的方法，以及用于包埋體細胞胚的設備等，也都有待改進。8.3分離可再生的原生質體的材料胚性愈傷組織、懸浮培養(yǎng)物和體細胞胚已作為許多植物原生質體分離的材料。這些培養(yǎng)體系中的細胞或組織在培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出再生植株的潛能，為此，其原生質體也有形成完整植株的能力。在禾本科植物、松柏類植物和柑橘植物中，胚性培養(yǎng)物作為可再生的原生質體材料具有特別的價值。8.4遺傳轉化遺傳轉化從培養(yǎng)物分離的單細胞，然后將其培養(yǎng)在選擇培養(yǎng)基上（營養(yǎng)培養(yǎng)基含抗生素、卡那霉素），形成愈傷組織系，最后在除去生長素的培養(yǎng)基上形成體細胞胚。有實驗表明重復體細胞胚起源的表皮或下表皮單細胞，這些細胞很容易受到農桿菌的感染。重復體細胞胚胎發(fā)生同樣適于基因槍介導的遺傳轉化。8.5代謝產物的合成重復體細胞胚胎發(fā)生體系在合成代謝產物如藥物和油脂中有潛在的應用前景。如玻璃苣種子含有高水平的γ－亞麻酸，用作前列腺素前體或治療遺傳性過敏癥。玻璃苣體細胞胚也產生該代謝產物，而且通過重復體細胞胚胎發(fā)生，能連續(xù)形成γ－亞麻酸，否則這種