發(fā)酵工程菌種的來(lái)源

發(fā)酵工程菌種的來(lái)源第一頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

教學(xué)目的：了解工業(yè)化菌種的要求以及一些工業(yè)化生產(chǎn)菌介紹；了解菌種分離的一般過(guò)程；掌握土樣采集應(yīng)注意的問(wèn)題，菌種的分離方法；掌握優(yōu)良菌種應(yīng)具備的基本特性和菌種的選育、種子擴(kuò)大培養(yǎng)。

教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：土樣采集應(yīng)注意不同的土壤特點(diǎn)、地理和氣候條件，土樣的采集方法；生化反應(yīng)分離法；種子擴(kuò)大培養(yǎng)。

第二章菌種的來(lái)源(4學(xué)時(shí))第二頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

內(nèi)容速覽2誘變育種2.2目的微生物的分離2.1工業(yè)化菌種的要求及介紹2.3菌種選育1自然選育菌種的來(lái)源2.4種子擴(kuò)大培養(yǎng)第三頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日一、工業(yè)化菌種的要求

§1工業(yè)化菌種的要求及已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌介紹能在廉價(jià)原料制成的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且大量高效地合成產(chǎn)物；

遺傳性能要相對(duì)穩(wěn)定；

菌種改造的可操作性要強(qiáng)；

抗噬菌體及雜菌污染能力強(qiáng)；

產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無(wú)關(guān)）；

發(fā)酵條件如溫度、pH、溶解氧、泡沫等易控制。第四頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日放線菌（鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢菌素等）一些產(chǎn)芽孢的細(xì)菌（多黏菌素、丁胺菌素等）植物或動(dòng)物來(lái)源（蒜素、番茄素、魚(yú)素等）1、抗生素生產(chǎn)有關(guān)的微生物抗生素是次級(jí)代謝產(chǎn)物，需要生物體進(jìn)行復(fù)雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來(lái)源如下：二、已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌介紹第五頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日初級(jí)代謝和次級(jí)代謝異同？1概念不同2產(chǎn)物不同3存在范圍不同4對(duì)微生物的作用不同5同微生物生長(zhǎng)過(guò)程的關(guān)系6對(duì)環(huán)境條件的敏感性或遺傳穩(wěn)定性上明顯不同7相關(guān)酶的專一性不同8兩者既有區(qū)別性又有連續(xù)性第六頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日概念不同

在微生物的新陳代謝中，一般將微生物從外界吸收各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過(guò)分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動(dòng)的物質(zhì)和能量的過(guò)程，稱為初級(jí)代謝而次級(jí)代謝是相對(duì)于初級(jí)代謝而提出的一個(gè)概念。一般認(rèn)為，次級(jí)代謝是指微生物在一定的生長(zhǎng)時(shí)期，以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體，合成一些對(duì)微生物的生命活動(dòng)無(wú)明確功能的物質(zhì)的過(guò)程第七頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日產(chǎn)物不同

初級(jí)代謝的產(chǎn)物，即為初級(jí)代謝產(chǎn)物。如單糖或單糖衍生物、核苷酸、維生素、氨基酸、脂肪酸等單體以及由它們組成的各種大分子聚合物，如蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂質(zhì)等生命必需物質(zhì)。<通過(guò)次級(jí)代謝合成的產(chǎn)物稱為次級(jí)代謝產(chǎn)物，大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的化合物。根據(jù)其作用，可將其分為抗生素、激素、生物堿、毒素等類型第八頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日存在范圍不同

初級(jí)代謝的代謝系統(tǒng)、代謝途徑和代謝產(chǎn)物在各類生物中都基本相同，它是一類普遍存在于各類微生物中的一種基本代謝類型。<次級(jí)代謝只存在于某些微生物中，并且代謝途徑和代謝產(chǎn)物因生物不同而不同，就是同種生物也會(huì)由于培養(yǎng)條件不同而產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

第九頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日對(duì)微生物的作用不同

通過(guò)初級(jí)代謝，能使?fàn)I養(yǎng)物轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)物質(zhì)、具生理活性物質(zhì)或?yàn)樯L(zhǎng)提供能量，因此初級(jí)代謝產(chǎn)物，通常都是機(jī)體生存必不可少的物質(zhì)，只要在這些物質(zhì)的合成過(guò)程的某個(gè)環(huán)節(jié)上發(fā)生障礙，輕則引起生長(zhǎng)停止，重則導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生突變或死亡，是一種基本代謝類型。次級(jí)代謝產(chǎn)物一般對(duì)菌體自身的生命活動(dòng)無(wú)明確功能，不參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成，也不是酶活性必需的，不是機(jī)體生長(zhǎng)與繁殖所必需的物質(zhì)，即使在次級(jí)代謝的某個(gè)環(huán)節(jié)上發(fā)生障礙，也不會(huì)導(dǎo)致機(jī)體生長(zhǎng)的停止或死亡，至多只是影響機(jī)體合成某種次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力。但許多次級(jí)代謝產(chǎn)物通常對(duì)人類和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展有重大影響第十頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日2、氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物

用人工誘變的方法，有意識(shí)地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產(chǎn)物，這種發(fā)酵形象地稱為代謝控制發(fā)酵，最早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應(yīng)用。

50、60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展歷史上的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。代謝控制發(fā)酵第十一頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日可以大量積累人工誘變的菌株不能合成反饋抑制不能合成人工誘變控制黃色短桿菌的代謝過(guò)程生產(chǎn)賴氨酸P459高絲氨酸脫氫酶第十二頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日氨基酸生產(chǎn)菌的要求：代謝途徑比較清楚；代謝途徑比較簡(jiǎn)單。谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它氨基酸生產(chǎn)菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細(xì)菌。常規(guī)菌種一般是以谷氨酸生產(chǎn)菌選育而成；大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，工程菌。第十三頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日3、酶制劑生產(chǎn)有關(guān)的微生物

利用微生物來(lái)進(jìn)行酶制劑生產(chǎn)是19世紀(jì)日本人用曲霉通過(guò)固體培養(yǎng)生產(chǎn)他卡淀粉酶，而大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)則始于20世紀(jì)40年代末日本用深層發(fā)酵法生產(chǎn)α—淀粉酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等；β-淀粉酶：米曲霉、巨大芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌等；纖維素酶：木霉、青霉；蛋白酶：黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌、灰色鏈霉菌等。

返回第十四頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

一、菌種分離的一般過(guò)程

二、微生物材料的標(biāo)本采集

A、不同的土壤特點(diǎn)

B、地理和氣候條件

C、微生物的生理特性

D、極端環(huán)境條件下采樣分離

三、標(biāo)本的預(yù)處理

四、目的微生物富集的一些基本方法

五、菌種分離§2自然界中目的微生物的分離第十五頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日2023/1/2315一、菌種分離的一般過(guò)程P14標(biāo)本采集→預(yù)處理→富集培養(yǎng)→菌種分離（初篩、復(fù)篩）→發(fā)酵性能鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大？如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實(shí)現(xiàn)？目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問(wèn)題：→菌種保藏

返回第十六頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日遵循原則：材料來(lái)源越廣泛，越有可能獲得新的菌種一般通過(guò)以下途徑獲得菌種：①向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取有關(guān)菌株；②由自然界采集樣品，如土壤、水、動(dòng)植物體等；③從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株，如從醬油中分離蛋白酶產(chǎn)生菌，從酒醪中分離淀粉酶或糖化酶的產(chǎn)生菌。二、微生物材料的標(biāo)本采集第十七頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日國(guó)內(nèi)菌種保藏機(jī)構(gòu)27ACCC中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心ISF中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所SH上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所CACC抗菌素菌種保藏管理中心IA中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗菌素研究所SIA四川抗菌素工業(yè)研究所CGMCC普通微生物菌種保藏管理中心AS中國(guó)科學(xué)院微生物研究所AS-IV中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所CFCC林業(yè)微生物菌種保藏管理中心CAF中國(guó)林業(yè)科學(xué)院菌種保藏管理中心CICC工業(yè)微生物菌種保藏管理中心IFFI輕工業(yè)部食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所CMCC醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心ID中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所NICPB衛(wèi)生部藥品生物制品監(jiān)察所IV中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所CVCC獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心CIVBP中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所YM云南省微生物研究所GIMCC廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心CCTCC中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCDM華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種保藏中心CMBGCAS海洋微生物中心HKUCC香港大學(xué)保藏中心CUHK香港中文大學(xué)保藏中心BCRC臺(tái)灣生物資源保藏研究中心，臺(tái)灣新竹第十八頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日國(guó)外菌種保藏機(jī)構(gòu)ATCC(AmericanTypeCultureCollection）美國(guó)典型菌種保藏中心NBRC(NITEBiologicalResourceCenter)日本技術(shù)評(píng)價(jià)研究所生物資源中心NRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心CBS(CentraalbureauvoorSchimmelcultures)荷蘭微生物菌種保藏中心UKNCC(TheUnitedKingdomNationalCultureCollection)英國(guó)國(guó)家菌種保藏中心第十九頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

自然界中微生物極其豐富，土壤是微生物最集中的地方，所以土壤樣品往往是采集的首選目標(biāo)。土樣采集應(yīng)注意以下問(wèn)題：

A、不同的土壤特點(diǎn)

B、地理和氣候條件

C、微生物的生理特性

D、極端環(huán)境條件下采樣分離二、微生物材料的標(biāo)本采集第二十頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日A、不同的土壤特點(diǎn)P15

因土壤組成、有機(jī)物濃度、pH等條件的不同，微生物的種群分布會(huì)非常不同。如菜園和農(nóng)田常以細(xì)菌和放線菌較多（偏堿）；果園樹(shù)根土壤中酵母菌含量較高（偏酸）；動(dòng)植物殘骸及腐殖土中霉菌較多；根瘤菌多在豆科植物根系土壤中分離；分解石油的微生物常在油田和石油煉油廠附近的土層中分布最多。

自然環(huán)境中的天然菌群，可因人類的生產(chǎn)或生活而改變。如在土壤中加去莠津（2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5-三嗪），會(huì)導(dǎo)致放線菌群的增加；在殺真菌劑存在下，諾卡氏菌屬的菌更容易分離到。第二十一頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日B、地理和氣候條件

南方和北方，一年四季。許多工業(yè)微生物菌種，如抗生素產(chǎn)生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多從南方。原因是南方溫度高、溫暖季節(jié)長(zhǎng)、雨水多、相對(duì)濕度高、植被覆蓋面廣、土壤有機(jī)質(zhì)豐富。冬季溫度低氣候干燥；春季溫度開(kāi)始回升但雨水較多；夏季天氣炎熱溫度高；秋季采土樣最為理想。

采土樣的方法：南方，用取樣鏟，將表層5cm（陽(yáng)光直射，蒸發(fā)量大水分少，而且受紫外線照射）左右的浮土除去，取5～25cm處的土樣10～25g，裝入事先準(zhǔn)備好的塑料袋內(nèi)扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm處取樣。給塑料袋編號(hào)并記錄地點(diǎn)、土壤質(zhì)地、植被名稱、時(shí)間及其他環(huán)境條件。一般樣品取回后應(yīng)馬上分離，以免微生物死亡。

第二十二頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日C、微生物的生理特性

篩選高溫酶產(chǎn)生菌時(shí)，通常到溫度較高的南方，或溫泉、火山爆發(fā)處及北方的堆肥中采集樣品；

低溫酶產(chǎn)生菌時(shí)，南北極地區(qū)、冰窯、深海；分離耐壓菌則從深海底部采樣，如Micrococcusaquivivus水活微球菌,耐600個(gè)大氣壓；分離耐高滲透壓酵母菌時(shí)，通常到甜果、蜜餞或甘蔗渣堆積處采樣。花蜜中分離到一株能耐30%高糖的耐高滲透壓的酵母菌。第二十三頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日Ｄ、極端環(huán)境條件下采樣分離

極端微生物的采集。高熱、高壓、低溫、強(qiáng)堿、強(qiáng)酸及高滲透壓等

返回第二十四頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日三、標(biāo)本的預(yù)處理

提高菌種分離的效率●物理方法：加熱(55℃,6min；100℃,1h；40℃2-6h)、膜過(guò)濾法、離心法、空氣攪拌法●化學(xué)方法：含1%幾丁質(zhì)培養(yǎng)基、用CaCO3提高pH值進(jìn)行培養(yǎng)（鏈霉菌屬）●誘餌法：用涂石蠟的棒置于碳源培養(yǎng)基中（諾卡氏菌）、花粉（游動(dòng)放線菌）、蛇皮（小瓶菌屬）、人頭發(fā)（角質(zhì)菌屬）第二十五頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日小瓶菌屬

放線菌目、游動(dòng)放線菌科的一屬。已記述約10個(gè)種。代表種為規(guī)則小瓶菌。形態(tài)特征：一般無(wú)氣生菌絲，基內(nèi)菌絲上層?xùn)艡跔罹z或孢囊柄頂端著生瓶狀、簡(jiǎn)形、鈴狀或略不規(guī)則的孢囊，其中有大量呈平行直線排列的桿狀孢囊孢子；孢囊孢子大部具極生鞭毛，能游動(dòng)；細(xì)胞壁化學(xué)組分Ⅱ型，即以內(nèi)消旋二氨基庚二酸和甘氨酸為特征組分

；DNA中的G+C克分子含量為72.3％。

返回第二十六頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日富集的基本方法：

1、控制營(yíng)養(yǎng)：如以唯一碳源或氮源作底物；

2、控制培養(yǎng)條件：如pH、溫度、通氣量等；

3、抑制不需要的種類。四、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢(shì)，使篩選變得可能。

富集培養(yǎng)是在目的微生物含量較少時(shí)，根據(jù)微生物的生理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種選擇性培養(yǎng)基或創(chuàng)造有利生長(zhǎng)條件，使目的微生物數(shù)量增加，由原來(lái)自然條件下的劣勢(shì)種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)種，以利于分離得到所需要的菌株。第二十七頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日富集培養(yǎng)方法：

1、分批式富集培養(yǎng)：指將富集培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到新的同一種培養(yǎng)基中，重新建立選擇性壓力，如此重復(fù)幾次后，再取此富集培養(yǎng)物接種至固體培養(yǎng)基上，以獲得單菌落。轉(zhuǎn)種是關(guān)鍵。

2、恒化式富集培養(yǎng)：通過(guò)改變限制性基質(zhì)濃度，來(lái)控制兩類不同菌株的比生長(zhǎng)速率。四、目的微生物富集的一些基本方法

返回第二十八頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日五、菌種分離

從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時(shí)以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計(jì)培養(yǎng)基；利用簡(jiǎn)單、快速的鑒定方法，如抗生素。

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個(gè)重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長(zhǎng)，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識(shí)別。第二十九頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日1、常規(guī)分離法：平板劃線法、稀釋分離法和涂布法2、生化反應(yīng)分離法：透明圈法、變色圈法、抑菌圈法、生長(zhǎng)圈法。

透明圈法：在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁，這樣能分解該底物的微生物便會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生透明圈。

圈的大小可初步反映該菌株利用底物的能力，完全可以作為菌種初篩的判斷標(biāo)準(zhǔn)。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及核酸酶產(chǎn)生菌的分離，產(chǎn)有機(jī)酸菌的初篩。第三十頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日第三十一頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日A分區(qū)劃線法B連續(xù)劃線法

返回第三十二頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

將樣品分散到最低濃度

倒平板，培養(yǎng)，挑取單菌落

后面3個(gè)稀釋度各取0.1ml涂布

返回第三十三頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日33

返回第三十四頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日例1：分離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時(shí)，在培養(yǎng)基中添加碳酸鈣。例2：分離淀粉酶產(chǎn)生菌時(shí)，培養(yǎng)基以淀粉為唯一碳源，待樣品涂布到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)形成單個(gè)菌落后，再用碘液浸涂，根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明的水解圈來(lái)區(qū)別產(chǎn)酶菌株。第三十五頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

例1：分離果膠酶產(chǎn)生菌，用含0.2%果膠為唯一碳源，菌落長(zhǎng)成后加入0.2%的剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會(huì)出現(xiàn)降紅色的變色圈。例2：分離內(nèi)肽酶產(chǎn)生菌，除了用酪蛋白作底物平板產(chǎn)生透明圈進(jìn)行鑒別外，還可用吲羥乙酸酯為底物加到分離培養(yǎng)基內(nèi)，產(chǎn)生蛋白酶的菌落由于水解吲羥乙酸酯為3-羥基吲哚，后者能氧化生成藍(lán)色產(chǎn)物，根據(jù)變色圈便可選出平板上產(chǎn)蛋白酶菌株。

變色圈法：對(duì)于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來(lái)。第三十六頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

抑菌圈法：若被檢菌能分泌某些抑制工具菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，如抗生素等，便會(huì)在該菌落的周圍形成工具菌不能生長(zhǎng)的抑菌圈，被鑒別出來(lái)。抑菌圈自動(dòng)測(cè)量分析儀

第三十七頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離。工具菌的選擇是關(guān)鍵，工具菌采用抗生素的敏感菌。傳統(tǒng)上常用金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌作為工具菌檢驗(yàn)抗生素的抗性，現(xiàn)采用聯(lián)合工具菌如枯草芽孢桿菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌或巴氏梭狀芽孢桿菌，可分離出抗菌活性低，對(duì)其它試驗(yàn)菌活性高的新抗生素，如黃色霉素族的抗生素，而這些抗生素在單獨(dú)使用枯草芽孢桿菌作工具菌時(shí)無(wú)法檢出。第三十八頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

如，嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品進(jìn)行保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長(zhǎng)圈的菌落即為

。嘌呤產(chǎn)生菌

生長(zhǎng)圈法：常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素等產(chǎn)生菌。其工具菌是一些相對(duì)應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，由于得到所需的營(yíng)養(yǎng)，凡是目的微生物周圍便會(huì)出現(xiàn)一個(gè)混濁生長(zhǎng)圈。

返回第三十九頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日§3菌種選育目的：

防止菌種退化

解決生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題提高生產(chǎn)能力

提高產(chǎn)品質(zhì)量開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品第四十頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

（1）菌種細(xì)胞的生長(zhǎng)活力強(qiáng)；（2）生理性狀穩(wěn)定；（3）純、具有抗噬菌體感染的能力；

（4）穩(wěn)定高產(chǎn)，與目標(biāo)產(chǎn)品性質(zhì)相近的副產(chǎn)物及其他產(chǎn)物少；

（5）能采用價(jià)格便宜，來(lái)源廣泛的原料，并且轉(zhuǎn)化效率高。方法：自然選育、誘變育種、細(xì)胞工程育種（雜交育種、原生質(zhì)體融合育種）、基因工程育種等。優(yōu)良的生產(chǎn)菌種應(yīng)具備的基本特性

返回第四十一頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日自然狀態(tài)下，堿基對(duì)發(fā)生自然突變的機(jī)率為10-8～10-9自然突變有兩種情況：

一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對(duì)生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。為了保證生產(chǎn)水平的穩(wěn)定和提高，應(yīng)經(jīng)常地進(jìn)行生產(chǎn)菌種自然選育，以淘汰退化的，選出優(yōu)良的菌種。一、自然選育定義：不經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過(guò)程稱為自然選育。第四十二頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日自然突變引起的原因多因素低劑量的誘變效應(yīng)：指在自然環(huán)境中存在著低劑量的宇宙射線、各種短波輻射、低劑量的誘變物質(zhì)和微生物自身代謝產(chǎn)生的誘變物質(zhì)的作用引起的突變?；プ儺悩?gòu)效應(yīng)：指四種堿基第六位上的酮基或氨基的瞬間變構(gòu)，會(huì)引起堿基的錯(cuò)配。T、G：酮式或烯醇式

C、A:氨基式或亞氨基式。

平衡：傾向于酮式或氨基式第四十三頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日自然選育在工業(yè)生產(chǎn)上的意義

意義：自然選育是一種簡(jiǎn)單易行的方法，可達(dá)到純化菌種、防止菌種退化、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量的目的。雖然其突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施?；貜?fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過(guò)程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，這種情況我們稱為回復(fù)突變。問(wèn)題：高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負(fù)突變高？第四十四頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日自然選育操作步驟：一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細(xì)胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗(yàn)第四十五頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日自然選育方法通過(guò)表現(xiàn)形態(tài)來(lái)淘汰不良菌株；（初篩）

通過(guò)目的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的考察；（復(fù)篩）進(jìn)行遺傳基因型純度試驗(yàn)；傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)。第四十六頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日自然選育方法通過(guò)表現(xiàn)形態(tài)來(lái)淘汰不良菌株；（初篩）

菌落大小、生長(zhǎng)速度、顏色、孢子的形成。用于特征明顯的微生物如絲狀真菌、放線菌及部分細(xì)菌。第四十七頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日例：抗生素菌種選育一般低產(chǎn)菌的菌落不產(chǎn)生菌絲，菌落多光禿型；生長(zhǎng)緩慢，菌落過(guò)小，產(chǎn)孢子少；孢子生長(zhǎng)及孢子顏色不均勻，產(chǎn)生白斑、禿斑或角變；或生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，菌落大，孢子過(guò)于豐富等。判斷高產(chǎn)菌落則根據(jù)：孢子生長(zhǎng)有減弱的趨勢(shì)，菌落中等大小，菌落偏小但孢子生長(zhǎng)豐富，孢子顏色有變淺的趨勢(shì)，菌落表面溝紋整齊，多、密且較直；分泌色素或逐漸變淺。第四十八頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日自然選育方法通過(guò)目的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的考察；（復(fù)篩）高產(chǎn)菌落搖瓶復(fù)篩，考察菌種生產(chǎn)能力的穩(wěn)定性和傳代的穩(wěn)定性。復(fù)篩條件已較接近發(fā)酵生產(chǎn)工藝。復(fù)篩的菌種應(yīng)及時(shí)進(jìn)行保藏。厭氧微生物厭氧培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)。第四十九頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日自然選育方法進(jìn)行遺傳基因型純度試驗(yàn)；分離、表觀形態(tài)進(jìn)行考察，相似的主要菌落占90%以上。傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)。斜面?zhèn)鞔?~5次（代）的連續(xù)傳代，產(chǎn)量保持穩(wěn)定的菌種用于生產(chǎn)。條件一致。

返回第五十頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日二、誘變育種P55

人工利用各種誘變劑誘發(fā)基因突變，再通過(guò)適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需要的優(yōu)良菌種的育種方法，稱為誘變育種。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑

表2-1物理的：紫外線、快中子、x射線等化學(xué)的：硫酸二乙酯、亞硝基胍、Y啶類物質(zhì)等{生物的：噬菌體、轉(zhuǎn)座子誘變育種的理論基礎(chǔ)是：基因突變？

●紫外線使用時(shí)間較久，輻射光源便宜，危險(xiǎn)性小，誘變效果好應(yīng)用最廣泛，研究最多。波長(zhǎng)260nm左右(253~265)誘變效果最好。

●激光和微波作為誘變劑，尚處于摸索階段。基因重組？第五十一頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日化學(xué)誘變劑烷化劑：芥子氣（SM）氮芥(NM)，環(huán)氧乙烷(EO)，二環(huán)氧丁烷（DEB），硫酸二乙酯（DES），甲基磺酸乙酯（EMS），乙基磺酸乙酯(EES)、乙烯亞胺(EL)，三亞乙基三聚氰胺(TEM)，-丙酸內(nèi)酯，重氮甲烷,N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、二乙基亞硝基胺(DEN)嵌合劑（移碼誘變劑）：吖啶橙、吖啶黃堿基類似物：5-FU，5-BU脫氨基誘變劑：亞硝酸第五十二頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日（一）誘變劑處理過(guò)程中幾個(gè)有關(guān)的問(wèn)題

1、化學(xué)誘變劑使用過(guò)程的安全性2、出發(fā)菌株的選擇3、誘變劑的選擇4、誘變劑量的選擇第五十三頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日化學(xué)誘變劑都具毒性，其中90%以上是致癌物質(zhì)或極毒藥品，使用時(shí)要格外小心，不能直接用口吸，避免與皮膚直接接觸，不僅要注意自身安全，也要防上污染環(huán)境，造成公害。1、化學(xué)誘變劑使用過(guò)程的安全性第五十四頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日NTG(亞硝基胍）是一種強(qiáng)烈致癌物質(zhì)，操作時(shí)要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。凡接觸過(guò)NTG的器皿必須及時(shí)、單獨(dú)處理，例用自來(lái)水大量沖洗或用1-2N的NaOH浸泡過(guò)夜，洗凈。EMS（甲基硫酸乙酯）是劇毒的誘變劑，在整個(gè)誘變過(guò)程，包括配制藥品、操作處理、保存等都要嚴(yán)守安全，不能接觸皮膚，所有接觸過(guò)EMS的器皿，單獨(dú)用大量水沖洗洗滌，或用10％NaS2O3溶液浸泡過(guò)夜，再用清水沖洗干凈。1、化學(xué)誘變劑使用過(guò)程的安全性第五十五頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日

定義：出發(fā)菌株指用于誘變育種的最初菌株或每代誘變的試驗(yàn)菌株。★對(duì)菌株產(chǎn)量，形態(tài)、生理等情況了解；★生長(zhǎng)繁殖快，營(yíng)養(yǎng)要求低，產(chǎn)孢子多且早；★對(duì)誘變劑敏感；★菌株要有一定的生產(chǎn)能力；★多出發(fā)菌株：一般采用3~4個(gè)出發(fā)菌株，在逐代處理后，將產(chǎn)量高、特性好的菌株留作繼續(xù)誘變的出發(fā)菌株。選擇出發(fā)菌株的要求：2、出發(fā)菌株的選擇第五十六頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日出發(fā)菌株及生理狀態(tài)：真菌、酵母106個(gè)/ml，放線菌孢子106~107個(gè)/ml,細(xì)菌108個(gè)/ml，細(xì)菌選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，真菌和放線菌使用幼年孢子，芽孢細(xì)菌也可以用芽孢進(jìn)行誘變處理。力求90%以上為單孢子，制菌懸液用生理鹽水或緩沖溶液。2、出發(fā)菌株的選擇第五十七頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日3、誘變劑的選擇●考慮誘變劑的作用機(jī)理，根據(jù)實(shí)際操作方便或成功的經(jīng)驗(yàn)；●實(shí)踐證明并非所有誘變劑對(duì)某個(gè)出發(fā)菌株都是有效的；●誘變劑的誘變作用，還取決于出發(fā)菌株的特性及其誘變史。誘變劑作用細(xì)胞后，對(duì)DNA作用引起突變，但不一定都能形成突變體，原因是菌體為了生存，具有一套自我修復(fù)系統(tǒng)。第五十八頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日4、誘變劑量的選擇

劑量的大小常以致死率和誘變率來(lái)確定。最適劑量是指能夠提高正突變株變異頻率幅度的誘變劑量。處理劑量大，致死率高，誘變率也會(huì)提高，但達(dá)到一定程度后，再提高劑量反而會(huì)下降；但誘變劑量也不宜過(guò)低，否則很難獲得所需的正突變株。致死率90%~99.9%（過(guò)去）70%~80%（現(xiàn)在）。

第五十九頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日（二）誘變劑處理的方式（1）直接處理：將菌懸液用誘變劑直接處理，然后分離。（2）生長(zhǎng)過(guò)程處理：適用于誘變作用強(qiáng)而致死率低的誘變劑，或只在分裂過(guò)程中對(duì)DNA起作用的誘變劑，如秋水仙素。這些誘變劑一般都直接加入到培養(yǎng)基中，混勻，倒入平皿制成平板后培養(yǎng)，在生長(zhǎng)過(guò)程中誘發(fā)菌體突變。（3）振蕩培養(yǎng)處理：即在搖瓶培養(yǎng)基中加入一定量的誘變劑。菌體隨著振蕩培養(yǎng)，不斷地和誘變劑接觸，它們之間的作用遠(yuǎn)比平板生長(zhǎng)過(guò)程處理充分得多，所以誘變劑濃度不宜過(guò)高。第六十頁(yè)，共六十七頁(yè)，2022年，8月28日（三）誘變篩選流程

(致死率、突變率、正變率、高產(chǎn)率、投產(chǎn)率)出發(fā)菌種斜面

或搖瓶培養(yǎng)24h細(xì)菌懸液

稀釋涂平板單孢子懸液

誘變處理挑取單菌落200個(gè)

搖