藥品檢驗操作規(guī)程

非無菌產(chǎn)品檢驗操作規(guī)程一、微生物計數(shù)法1.供試液制備（1）水溶性樣品取供試品10g（ml），用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或TSB溶解或者稀釋制成1:10供試液。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。（2）水不溶非油脂類供試品取供試品10g（ml），用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或TSB制備成1:10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。（3）油脂類供試品取供試品10g（ml），加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的表面活性劑充分你混勻。必要時，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進一步10倍系列稀釋。2.計數(shù)方法（1）平皿法a：傾注法取制備的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過45℃熔化的TSA或SDA,混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應相應增加。b：涂布法取15～20ml溫度不超過45℃的TSA或SDA，注入直徑90mm的無菌平皿，凝固，制成平板，采用的適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也相應增加。每一平板表面接種的供試液不少于0.1ml。（2）薄膜過濾法取供試液適量（一般取相當于1g、1ml、10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過濾，用適量的沖洗液沖洗濾膜。若測定需氧菌總數(shù)，轉移濾膜菌面朝上貼于TSA平板上；若測定霉菌和酵母菌總數(shù)，轉移濾膜菌面朝上貼于SDA平板上。3．抗菌活性的去除或滅活（1）增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。（2）加入適宜的中活劑或滅活劑。（3）采用薄膜過濾法。（4）上述幾種方法的聯(lián)合使用。二、控制菌檢查法陽性對照試驗陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加量應不大于100cfu。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。陰性對照實驗以稀釋劑代替供試液照相應控制菌檢查，陰性對照試驗應無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。耐膽鹽革蘭陰性菌供試液制備和預培養(yǎng)取供試品，用TSB作為稀釋劑照“微生物計數(shù)法（通則1105）”制成1:10供試液，混勻，在20～25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間應使供試品中的細菌充分恢復但不增值（約2小時）。a：定性試驗除另有規(guī)定外，取相當于1g或1ml供試品的上述預培養(yǎng)物接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）腸道增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48小時。如果平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。b：定量試驗選擇和分離培養(yǎng)取相當于0.1g、0.01g、0.001g（或0.1ml、0.01ml、0.001ml）供試品的預培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）腸道增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48小時。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。結果判斷若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，則對應培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結果，從表1查1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能數(shù)。表1耐膽鹽革蘭陰性菌的可能數(shù)（N）各供試品量的檢查結果每1g（或1ml）供試品中可能的菌數(shù)cfu0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml+++N＞103++-102＜N＜103+--10＜N＜102---N＜10注：（1）+代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長；-代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上無菌落生長。（2）若供試品量減少10倍（0.01g或0.01ml、0.001g或0.001ml、0.0001g或0.0001ml），則每1g（或1ml）供試品中可能的菌落數(shù)（N）應相應增加10倍。EE（左：白草香解郁安神膠囊+大腸埃希菌，中：+大腸埃希菌，右：空白）VRBG平板(+大腸埃希菌)2.大腸埃希菌供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品，照“微生物計數(shù)法（通則1105）”制成1:10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的TSB中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。結果判斷若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上無菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。陽性（MacB）3.沙門菌供試液制備和增菌培養(yǎng)取10g或10ml供試品直接或處理后接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的TSB中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～48小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于TSI高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18～48小時，或采用其他適宜方法進一步鑒定。結果判斷若木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且TSI的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或TSI的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。4.銅綠假單胞菌供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品，照“微生物計數(shù)法（通則1105）”制成1:10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的TSB中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。取上述平板上生長的菌落進行氧化酶試驗，或采用其他適宜方法進一步鑒定。氧化酶試驗將潔凈濾紙片置于平皿內，用無菌玻棒取上述平板上生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸N,N-二甲基對苯二胺試液，在30秒內若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。結果判斷若溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上有菌落生長，且氧化酶試驗陽性，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為銅綠假單胞菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長在但鑒定結果為陰性，或氧化酶試驗陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。5.金黃色葡萄球菌供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品，照“微生物計數(shù)法（通則1105）”制成1:10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的TSB中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物劃線接種