河南華溪蟹MT的mAb的制備及其鑒定,免疫學(xué)論文

河南華溪蟹MT的mAb的制備及其鑒定,免疫學(xué)論文金屬硫蛋白〔metallothionein,MT〕于1957年由哈fo大學(xué)的Margoshes和Vallee在研究馬腎臟蓄積鎘的經(jīng)過中初次發(fā)現(xiàn)并分離，是一類低分子質(zhì)量〔Mr〕、富含半胱氨酸、不含芳香族氨基酸和組氨酸、能被多種金屬誘導(dǎo)并結(jié)合多個(gè)金屬原子的非酶類蛋白質(zhì).MT普遍存在于生物界中，在生物體內(nèi)其所有的半胱氨酸均處于復(fù)原狀態(tài)，具有去除體內(nèi)自由基、解除重金屬毒性、加強(qiáng)機(jī)體對各種不良適應(yīng)能力等功能.十分是作為一種重要的重金屬解毒蛋白，體內(nèi)唯一能有效解離、解毒重金屬的一種生物途徑，MT成為重金屬污染監(jiān)測和治理的研究熱門.重金屬進(jìn)入機(jī)體可特異性誘導(dǎo)MT的高水平表示出，進(jìn)而螯合一定的重金屬構(gòu)成重金屬-MT復(fù)合物，或者奪取與其他功能蛋白結(jié)合的重金屬離子來降低功能蛋白的損傷，減少重金屬對組織的損害.由于水生生物體內(nèi)的MT與水環(huán)境和體內(nèi)組織中重金屬之間顯著的相關(guān)性，因此生物組織中的MT含量能夠作為水環(huán)境監(jiān)測重金屬暴露的一個(gè)分子生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)，為確定水環(huán)境污染程度提供客觀和全面的指標(biāo).現(xiàn)前階段MT含量的測定方式方法主要有金屬結(jié)合法、電化學(xué)法、色譜分析法等，因MT蛋白的特殊性，上述測定方式方法無一不受MT結(jié)合金屬種類、MT同形體多態(tài)性等因素的影響而對結(jié)果產(chǎn)生偏差.受制于MT定量測定方式方法的限制，MT在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用尚未進(jìn)一步開發(fā)。當(dāng)前很多學(xué)者通過制備特異性抗體建立免疫學(xué)檢測方式方法定量檢測MT,相關(guān)報(bào)道主要集中在魚類和貽貝、牡蠣等海洋動物中，且主要通過制備多克隆抗體來實(shí)現(xiàn).而與淡水蟹類的相關(guān)研究，十分是MT單克隆抗體〔monoclonalantibodies,mAb〕制備尚未見報(bào)道。河南華溪蟹〔Sinopotamonhenanense〕,由海洋蟹多元轉(zhuǎn)化而成，終身?xiàng)⒂诘?，屬于甲殼綱、十足目中一個(gè)特殊分支。作為生活于水體基底層的低等生物，溪蟹直接面對沉積在水體的金屬離子，是一種理想的水環(huán)境監(jiān)測指示生物.本研究在原核表示出純化重組河南華溪蟹MT的基礎(chǔ)上，制備其mAb,為深切進(jìn)入研究MT的生物學(xué)功能以及建立快速、敏感的新型免疫學(xué)檢測方式方法奠定基礎(chǔ)。1材料和方式方法1.1材料重組工程菌PET-28a-SUMO-MT/BL21〔DE3〕、phoA-MT/BL21〔DE3〕由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。健康雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；QuickAntibody-Mouse5W免疫佐劑購自北京康碧泉生物技術(shù)公司；PEG1500購自Roche公司；HT、HAT、ITS合劑、青-鏈霉素、胰島素、L-谷氨酰胺、抗體亞類鑒定試劑盒均購自Sigma公司；NCTC-109培養(yǎng)基購自Gibco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自HyClone公司；-巰基乙醇購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜、NC膜購自Bio-Rad公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自GeneTex公司；堿性磷酸酶〔alkalinephosphatase,AP〕標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自生工生物工程〔上?！彻煞萦邢薰?；鄰苯二胺〔o-phenylenediamine,OPD〕和NBT/BCIP顯色劑購自Amresco公司；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。HGPRT缺陷型小鼠骨髓瘤細(xì)胞株Sp2/0購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，融合前經(jīng)8-氮鳥嘌呤挑選2周。1.2方式方法1.2.1抗原的制備免疫用抗原小泛素樣修飾蛋白-金屬硫蛋白〔smallubiquitin-likemodifier-metallothionein,SUMO-MT〕的制備：重組工程菌PET-28a-SUMO-MT/BL21〔DE3〕經(jīng)1mmol/LIPTG誘導(dǎo)表示出可溶性重組融合蛋白SUMO-MT,利用Ni離子螯合柱分離純化后超濾濃縮交換至pH7.8、0.01mol/LTris-HCl儲存液，操作步驟根據(jù)文獻(xiàn)方式方法進(jìn)行.檢測用抗原His-MT的制備：MT基因片段與質(zhì)粒phoA通過NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21〔DE3〕構(gòu)建重組工程菌phoA-MT/BL21〔DE3〕,經(jīng)低磷酸鹽誘導(dǎo)后分泌表示出可溶性重組蛋白His-MT,同樣經(jīng)Ni離子螯合柱分離純化，超濾濃縮交換至儲存液保存。1.2.2動物免疫選擇6周齡雌性BALB/c小鼠，取純化后的重組SUMO-MT蛋白免疫小鼠。初次免疫用免疫抗原SUMO-MT與等體積QuickAntibody-Mouse5W水溶性免疫佐劑迅速混合后，于小鼠后腿小腿肌肉注射免疫，每只小鼠注射100L,免疫劑量為25g.免疫前尾部靜脈取血作為陰性對照。3周后根據(jù)同樣的方式加強(qiáng)免疫1針。5周后，采微量尾血進(jìn)行間接ELISA檢測。當(dāng)血清滴度到達(dá)要求后，融合前3d加倍劑量與等體積生理鹽水混勻，腹腔注射沖擊免疫。融合前，小鼠摘除眼球取血，并分離血清作為陽性對照。1.2.3細(xì)胞融合將免疫小鼠脾細(xì)胞懸液和生長狀態(tài)良好的Sp2/0細(xì)胞以10∶1的比例在PEG1500作用下進(jìn)行融合，融合前PEG1500于50mL/LCO2培養(yǎng)箱中孵育24h.參加含HT挑選培養(yǎng)基〔含50mL/LDMEM/F12培養(yǎng)基、10mL/LNCTC-109培養(yǎng)基、20mL/L胎牛血清和1mL/LITS合劑〕,接種于96孔培養(yǎng)板中，1106/mL,100L/孔。37℃、80mL/LCO2培養(yǎng)1d后，換成含HAT挑選培養(yǎng)基培養(yǎng)。7~14d后改用含HT挑選培養(yǎng)基培養(yǎng)，14d后換用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。1.2.4雜交瘤細(xì)胞挑選與克隆根據(jù)Kim等建立的間接ELISA挑選分泌抗MTmAb的雜交瘤細(xì)胞株。選取96孔酶標(biāo)板，每孔用碳酸鹽緩沖液〔0.5mol/LNa2CO3/NaHCO3,pH9.6〕包被重組His-MT〔10g/mL,100L/孔〕,以1∶1000的免疫小鼠血清為陽性對照，1∶1000的不免疫正常BALB/c小鼠為陰性對照，1∶5000稀釋的山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗；以鄰苯二胺〔OPD〕溶液為反響底物，492nm處酶標(biāo)儀測定各孔A值，以P/N2.1時(shí)斷定為陽性。同時(shí)用含His-tag的重組IGF蛋白包被做穿插挑選。采用有限稀釋法對連續(xù)3次檢測為陽性的細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆，即調(diào)整細(xì)胞數(shù)至每毫升10個(gè)，100L/孔鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，亞克隆培養(yǎng)10d后檢測上清。重復(fù)進(jìn)行3次亞克隆，至100%雜交瘤細(xì)胞上清液均呈陽性時(shí)為建株標(biāo)準(zhǔn)。1.2.5抗MTmAb亞類鑒定處于對數(shù)生長期、生長旺盛的雜交瘤細(xì)胞，更換培養(yǎng)于未添加胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2~3d后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，根據(jù)抗體亞類鑒定試劑盒操作講明進(jìn)行亞類鑒定。1.2.6mAb腹水制備及純化以液體石蠟作為致敏劑，選取22周齡經(jīng)產(chǎn)BALB/c小鼠，以0.5mL/只注射液體石蠟。將挑選獲得的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后，以1105/mL~1107/mL的細(xì)胞數(shù)接種雜交瘤細(xì)胞株至小鼠腹腔內(nèi)生產(chǎn)腹水。10~12d后收集腹水，3000r/min離心15min,收獲上清。間接ELISA測定腹水效價(jià)。收獲的腹水上清，采用疏水性電荷誘導(dǎo)層析〔hydrophobicchargeinductionchromatography,HCIC〕和蛋白A親和層析相結(jié)合的方式方法純化腹水，操作步驟根據(jù)文獻(xiàn)[11]方式方法進(jìn)行。純化的樣品經(jīng)120g/LSDS分析其純度。1.2.7Westernblot法和Dot-ELISA鑒定重組SUMO-MT和重組His-MT行150g/LSDS后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；用含50g/L脫脂奶粉的PBST封閉過夜，PBST洗膜4次，10min/次，參加1∶2000稀釋的mAb作為一抗，4℃過夜；PBST洗膜4次后，參加1∶5000稀釋的AP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,室溫反響2h;用PBST洗膜4次后，最后用BCIP/NBT顯色試劑盒避光顯色并拍照。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)建立的方式方法制備河南華溪蟹肝胰腺組織MT粗提液.分別取經(jīng)IPTG和低磷酸鹽誘導(dǎo)的PET-28a-SUMO-MT/BL21〔DE3〕、phoA-MT/BL21〔DE3〕裂解液上清、重組SUMO-MT、重組His-MT、重組His-IGF及河南華溪蟹肝胰腺組織MT粗提液各5~10L點(diǎn)1封閉液振蕩封閉30min.PBST洗滌后，參加所獲的mAb,37℃振蕩孵育30min;PBST充分洗滌后，參加HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG〔1∶5000稀釋〕,37℃振蕩孵育30min;充分洗滌、濾紙吸干后，DAB顯色分析。1.2.8mAb抗原辨別位點(diǎn)分析根據(jù)文獻(xiàn)方式方法,利用ELISA疊加試驗(yàn)對2株mAb的抗原辨別位點(diǎn)進(jìn)行分析檢測。利用間接ELISA測定mAb-MT2和mAb-MT32株mAb飽和值。根據(jù)上述建立的ELISA,一抗分別為飽和濃度mAb-MT2、飽和濃度mAb-MT3、飽和濃度mAb-MT2聯(lián)合飽和濃度mAb-MT3、飽和濃度mAb-MT3聯(lián)合飽和濃度mAb-MT2,測定A492nm值，計(jì)算增殖指數(shù)〔AI〕.按如下公式計(jì)算：AI=〔A1+2-A1〕/A2100%.式中：A1為mAb-MT2A492值；A2為mAb-MT3的A492值；A1+2為mAb-MT2疊加mAb-MT3的A492值。AI10%為針對同一抗原位點(diǎn)，AI10%為針對不同抗原位點(diǎn)。2結(jié)果2.1SUMO-MT和His-MT重組蛋白的表示出和純化重組工程菌PET-28a-SUMO-MT/BL21〔DE3〕、phoA-MT/BL21〔DE3〕分別經(jīng)1mmol/LIPTG和低磷酸鹽誘導(dǎo)后，重組可溶表示出重組蛋白SUMO-MT和His-MT,利用Ni離子螯合柱分離純化目的蛋白。SDS結(jié)果顯示SUMO-MT和His-MT相對分子質(zhì)量〔Mr〕分別為26000〔SUMO標(biāo)簽Mr19000,MTMr7000〕和7000左右，且蛋白純度較高〔圖1〕.【圖1】2.2抗MTmAb雜交瘤細(xì)胞株的挑選選擇免疫后血清抗體效價(jià)較高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。將狀態(tài)良好的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞融合，融合率達(dá)99%.融合后10d左右，待細(xì)胞長至孔底的1/2以上時(shí)，取細(xì)胞上清采用間接ELISA進(jìn)行穿插挑選。僅選擇與His-MT蛋白反響為陽性，而與含His-tag的IGF蛋白反響為陰性的克隆，斷定為陽性克隆。經(jīng)初篩、復(fù)測，3次亞克隆培養(yǎng)后，最終挑選獲得2株能穩(wěn)定分泌抗華溪蟹MT抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為mAb-MT2和mAb-MT3,凍存、保種。2.3IgG亞類鑒定根據(jù)試劑盒講明操作，2株雜交瘤細(xì)胞株的DMEM/F12培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)上清經(jīng)夾心ELISA亞類鑒定為IgG1亞型。2.4腹水制備及效價(jià)測定將雜交瘤細(xì)胞接種于經(jīng)產(chǎn)BALB/c小鼠腹腔，12d左右收集腹水。間接ELISA測定mAb-MT2和mAb-MT3腹水效價(jià)分別為1∶500000、1∶1000000.腹水經(jīng)HCIC和蛋白A親和層析純化后，得到純度較高的抗MTmAb〔圖2〕.【圖2】2.5Westernblot鑒定以純化的mAb為一抗，AP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行Westernblot分析鑒定。結(jié)果顯示，2株雜交瘤分泌的mAb均能特異性辨別重組SUMO-MT和His-MT〔圖3〕.【圖3】2.6Dot-ELISA檢測抗MTmAb的特異性Dot-ELISA分析結(jié)果表示清楚，2株mAb均能與重組菌PET-28a-SUMO-MT/BL21〔DE3〕、phoA-MT/BL21〔DE3〕、重組SUMO-MT、重組His-MT及肝胰腺組織MT粗提液反響，具有良好的反響特異性，而與重組His-IGF、PET-28a-SUMO/BL21〔DE3〕沒有特異反響性〔表1〕.【表1】2.7mAb辨別的抗原位點(diǎn)分析利用ELISA疊加法分析了2株mAb的抗原辨別位點(diǎn)，結(jié)果顯示：mAb-MT2和mAb-MT3疊加后，增殖指數(shù)〔AI〕為6%,小于10%,講明mAb-MT2和mAb-MT可能辨別同一表位〔表2〕.【表2】3討論MT由于分子質(zhì)量較小，半衰期短，在大腸桿菌體內(nèi)不穩(wěn)定且易被酶降解；富含半胱氨酸，極易構(gòu)成無生物活性的包容體和影響宿主體內(nèi)的氧化復(fù)原環(huán)境；易結(jié)合金屬離子影響宿主細(xì)胞的正常生理代謝、對細(xì)胞的毒性以及細(xì)胞對金屬離子的耐受性差等問題，成為一種較難獲得重組表示出的蛋白.在前期研究中，將河南華溪蟹MT基因亞克隆至PET-28a、PQE30等一系列常規(guī)表示出載體上，發(fā)現(xiàn)其無法正常表示出，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了MT由于其獨(dú)特的性質(zhì)而較難獲得重組表示出的推理。為解決這一問題，研究者多利用融合技術(shù)將MT基因與具有協(xié)助蛋白正確折疊的融合蛋白如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶〔glutathioneS-transferase,GST〕融合表示出.在前期工作中，利用GST表示出系統(tǒng)也成功實(shí)現(xiàn)了河南華溪蟹的表示出，但目的蛋白多以包容體的形式存在，可溶表示出量有限。本研究利用兩種特殊的表示出系統(tǒng)：SUMO融合表示出系統(tǒng)和phoA分泌表示出系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了河南華溪蟹MT的重組可溶表示出。在SUMO系統(tǒng)中，MT通過融合SUMOtag,利用其促溶、促折疊等特性實(shí)現(xiàn)了體外重組可溶表示出。而在phoA表示出系統(tǒng)中，河南華溪蟹MT蛋白被分泌表示出至細(xì)胞周質(zhì)中，降低了MT的細(xì)胞毒性，同時(shí)細(xì)胞周質(zhì)中氧化復(fù)原環(huán)境較弱，能夠最大程度的保證MT的天然構(gòu)象，克制了僅帶有6His小分子量標(biāo)簽MT的表示出困難,實(shí)現(xiàn)了其可溶分泌表示出。MT的Mr較低、免疫原性較差.SUMO-MT的成功制備，在最大程度保持MT天然構(gòu)象的基礎(chǔ)上，大大提高了MT的免疫原性。同時(shí)利用僅帶有較弱免疫原性的6Histag完成了MT的重組表示出，以His-MT作為檢測抗原挑選mAb,大大提高了抗體挑選的特異性和準(zhǔn)確性。在雜交瘤挑選經(jīng)過中，以His-MT作為檢測抗原避免SUMOtag假陽性的影響，同時(shí)利用His-IGF進(jìn)行穿插挑選也躲避了針對6Histag假陽性，獲得僅針對MT的陽性雜交瘤細(xì)胞株。同時(shí)，重組SUMO-MT和His-MT均以可溶形式表示出，最大程度的保持了MT的天然構(gòu)象，為我們同時(shí)挑選針對線性抗原表位和構(gòu)象表位的mAb提供了可能。本研究通過2種不同表示出形式實(shí)現(xiàn)了河南華溪蟹MT蛋白的重組表示出，進(jìn)一步利用SUMO-MT良好的免疫原性和His-MT較強(qiáng)的特異性，利用雜交瘤技術(shù)制備了mAb.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚，制備的mAb不僅能夠特異性辨別重組SUMO-MT和His-MT,而且與內(nèi)源性組織MT也具有良好的反響性?？筂TmAb的制備，對建立敏感、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化的免疫學(xué)檢測方式方法及深切進(jìn)入研究MT的重金屬解毒機(jī)制具有重要意義。以下為參考文獻(xiàn)：[1]HamerDH.Metallothionein[J].AnnRevBiochem,1986,55:913-951.[2]KgiJH,SchfferA.Biochemistryofmetallothionein[J].Biochemistry,1988,27〔23〕:8509-85