除草劑撲草凈腐植酸對斑馬魚的毒理作用,漁業(yè)論文

除草劑撲草凈腐植酸對斑馬魚的毒理作用,漁業(yè)論文三氮苯類除草劑是當(dāng)前國內(nèi)外廣泛使用的選擇性內(nèi)吸收傳導(dǎo)型除草劑，可防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草及某些多年生惡性雜草。撲草凈〔2-甲硫基-4,6-雙異丙氨基均三氮苯，Prometryn〕是三氮苯類除草劑中常見的一種，主要通過抑制植物的電子傳輸來影響植物的光合作用，進而到達除草的作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中也被頻繁應(yīng)用，主要用于去除魚、蝦、蟹、貝、海參等養(yǎng)殖水體中的絲狀藻類〔如滸苔〕、大型草類及其他有害藻類。撲草凈在歐洲已于2004年被禁用[1],但由于它毒性低、殺草譜廣，當(dāng)前中國[2]、美國、加拿大、新西蘭、南非還在廣泛使用[3].撲草凈在環(huán)境中比擬穩(wěn)定，半衰期為13個月，其較長的殘效期，更容易在環(huán)境中殘留并造成危害。有學(xué)者對渤海某海域60個站點海水分析后發(fā)現(xiàn)，撲草凈的檢出率為100%[4];上海某河水中也檢測出撲草凈，其濃度高達7.12~0.54gL-1[5].馬曉雁等[6]檢測了上海某水廠〔該水廠以黃浦江水為原水〕中撲草凈的平均濃度，結(jié)果表示清楚4月?lián)洳輧舻臐舛茸罡?，到達1.25gL-1.有報道顯示捷克的河流中撲草凈的濃度為0.51gL-1[7],希臘的地表水中撲草凈的范圍在0.91~4.40gL-1,而在地下水中超過1gL-1[8].可見，撲草凈在環(huán)境中不僅殘留時間長，而且分布較為廣泛。撲草凈進入環(huán)境后會對非靶細胞生物造成影響。研究發(fā)現(xiàn)撲草凈對月牙藻〔Selenastrumcapricor-nutum〕的5dEC50為0.023mgL-1[9],對浮萍〔Lemnaminor〕的24hEC50為0.083molL-1,對輪藻〔Characanescens〕的24hLC50為0.071molL-1[10].李雪芹等[11]發(fā)現(xiàn)撲草凈對蛋白核小球藻〔Chlorellapyrenoidosa〕的EC50為0.16mgL-1,并且在低濃度〔0.01mgL-1〕下對蛋白核小球藻表現(xiàn)出一定的刺激生長效應(yīng)，而隨撲草凈濃度的增加，抑制生長作用加強，藻體內(nèi)丙二醛含量急劇升高。Jiang等[12]發(fā)現(xiàn)撲草凈能夠抑制小麥的生長，表現(xiàn)為撲草凈〔4mgkg-1〕能夠?qū)е氯~綠素含量的大幅度降低，植物體脂質(zhì)過氧化水平升高?？扇苄杂袡C質(zhì)〔DOM〕通常被定義為能夠透過0.45m濾膜，且在以后的分析經(jīng)過中不因蒸發(fā)而丟失的有機物質(zhì)。在外表水體中的濃度〔按溶解性有機碳DOC計〕為1~15mgL-1[13].也有報道稱天然水體中DOM的濃度范圍為1~40mgL-1,江河中平均可達7mgL-1.腐植酸〔Humicacid,HA〕是DOM的主要組成部分[14],在水環(huán)境中普遍存在，它不僅能對生物產(chǎn)生直接影響[15],還能夠通過改變有機污染物的生物有效性間接影響生物。Cnepa等[16]以膽堿酯酶活性作為生物標(biāo)志物，研究了在不同濃度〔5、20、60mgL-1〕HA存在條件下殺螟硫磷對雙臍螺〔B.glabrata〕的影響，發(fā)如今20、60mgL-1HA條件下，殺螟硫磷處理組雙臍螺體內(nèi)膽堿酯酶的活性與空白組近似，講明該條件下高濃度HA的存在沒有使殺螟硫磷的可利用性增加。撲草凈的檢測手段、在土壤和水環(huán)境中的吸附解吸[17]以及它對植物的影響[11-12]已有報道，而其對斑馬魚〔Daniorerio〕的毒性以及HA的存在對其毒性的影響未見報道。本研究考察了撲草凈對斑馬魚的毒性，以及HA對撲草凈毒性的影響，為評價撲草凈對水生生物乃至非靶標(biāo)生物的潛在威脅提供理論根據(jù)，對更好地控制和預(yù)測環(huán)境中撲草凈污染情況具有重要意義。同時，以丙二醛〔MDA〕為測定指標(biāo)，研究HA對斑馬魚的直接影響，并選擇紫外-可見光吸收光譜法對撲草凈和HA進行定性分析，探尋求索HA影響撲草凈對斑馬魚毒性的原因。1材料與方式方法1.1受試生物斑馬魚，購自天津市安琪花鳥蟲魚市場。斑馬魚為成魚，平均體長2.9cm,平均體重0.13g.實驗用水為充分曝氣脫氯的自來水，pH7.9,溫度〔242〕℃。在實驗室水族缸內(nèi)馴養(yǎng)14d以上，每3d喂食一次，及時清理缸底糞便，試驗前24h停止喂食，馴養(yǎng)期間自然死亡率1%.馴養(yǎng)經(jīng)過中去除受傷、體色異常、畸形個體，選擇生長良好的魚作為試驗魚，雌雄不限。1.2試驗方式方法試驗用水為曝氣一周以上的自來水，采用自然光照。每個處理設(shè)置2個重復(fù)，處理系列均采用5L燒杯盛2L溶液，每個燒杯中放入10條斑馬魚，試驗期間稍微曝氣，周期為96h.試驗前將燒杯用2%〔質(zhì)量分數(shù)〕KMnO4消毒。撲草凈〔表1,純度97%,浙江省中山進出口有限公司〕儲備液以丙酮為助溶劑，45℃超聲30min后，過0.45m有機濾膜，現(xiàn)配現(xiàn)用。標(biāo)準(zhǔn)曲線用撲草凈標(biāo)樣〔純度99%,Aladdin〕配置。HA購自美國Sigma-Aldrich公司，CAS號為1415-93-6,它的提取來源是褐煤，主要組成元素的質(zhì)量百分含量和原子比等理化值見表2.稱取2g腐植酸于2L蒸餾水中，攪拌24h,3500rmin-1離心10min后，取上清液過0.45m濾膜。測定該溶液的總有機碳TOC〔AnalytikjenamultiN/C3100〕濃度，用該濃度〔mgCL-1〕表示腐植酸濃度。1.2.1急性毒性實驗1.2.1.1撲草凈對斑馬魚的急性毒性為保證試驗水體中撲草凈濃度維持基本穩(wěn)定，利用高效液相色譜測定10mgL-1〔對斑馬魚的100%致死濃度〕撲草凈在曝氣條件下96h前后的濃度，結(jié)果顯示濃度僅減少了0.26%,因而能夠采用靜態(tài)方式進行此急性毒性實驗。根據(jù)預(yù)實驗，得到撲草凈對斑馬魚的急性毒性耐受范圍為0~10mgL-1,在這里范圍內(nèi)設(shè)置0〔CK小于0.1%的丙酮〕、3、4、5、6、7、8、9、10mgL-1共9個撲草凈濃度水平。1.2.1.2腐植酸對撲草凈毒性的影響各濃度組設(shè)定見表3,同時設(shè)置0.1%的丙酮助溶劑、15mgL-1HA對照和空白組。待各濃度組溶液混勻平衡48h后放入斑馬魚，實驗期間及時去除死亡魚體，稱重記錄。1.2.2HA對斑馬魚的急性毒性配置0、5、15mgL-1HA溶液，容器為1L的燒杯，設(shè)置2個重復(fù)，每個燒杯中放5條斑馬魚，其他條件與上述急性毒性試驗一樣。96h后測定試驗溶液的電導(dǎo)率及魚體內(nèi)MDA濃度。1.2.3紫外-可見光吸收分析根據(jù)1.2.1.2中毒性試驗的梯度設(shè)置配制各組溶液及5、15mgL-1HA溶液，以雙蒸水作為對照，平衡48h后，將樣品置于1cm的石英比色皿中，在200~420nm范圍內(nèi)全掃描。此分析在TU-1901雙光束紫外可見分光光度計〔北京普析通用儀器有限責(zé)任公司〕上完成。1.2.4測定方式方法MDA的測定方式方法：將斑馬魚活體解剖，在冰浴條件下按1∶9〔魚體質(zhì)量/0.86%生理鹽水體積〕的比例參加預(yù)冷的生理鹽水，在預(yù)先冷凍過的玻璃勻漿器中勻漿，制備成10%的組織液。組織液在4℃、2500rmin-1條件下離心〔HettichMikro200R,德國〕15min,取上清液備用。采用硫代巴比妥酸法〔TBA法，南京建成公司試劑盒〕測定斑馬魚體內(nèi)MDA濃度；蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法測定。撲草凈的測定方式方法：采用Waters高效液相色譜[Waters1525BinaryHPLCPump,Waters2487Dual-AbsorbanceDetector,VenusilXBPC18-L〔4.6mm250mm]對水溶液中撲草凈濃度進行分析，流動相為75∶25〔V/V〕的甲醇/超純水溶液，流速1mLmin-1,檢測波長220nm,柱溫為室溫，進樣量20L,保存時間為8.83min.1.3數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，顯著性分析采用單因素方差分析，用Origin8.5作圖。2結(jié)果與分析2.1斑馬魚中毒異常感覺和狀態(tài)試驗開場前10h連續(xù)觀察不同染毒濃度下斑馬魚的中毒異常感覺和狀態(tài)。觀察結(jié)果顯示在撲草凈為7、8、9、10mgL-1濃度組，斑馬魚表現(xiàn)出先快速竄動，隨后開場側(cè)臥不動、側(cè)身游動、游動延遲緩慢、頭向下游動、身體旋轉(zhuǎn)游動等異常行為，最后或逐步適應(yīng)水體繼續(xù)存活，或因無法適應(yīng)而死亡。這些異常行為在染毒濃度較高的處理組，出現(xiàn)的時間較早。而在撲草凈3、4、5、6mgL-1濃度下，魚體的中毒異常感覺和狀態(tài)較輕，與空白組沒有明顯差異不同。2.2撲草凈對斑馬魚的急性毒性撲草凈對斑馬魚的96hLC50為7.488mgL-1〔表4〕，參照國家環(huán)保局制訂的(生物技術(shù)監(jiān)測規(guī)范〔水環(huán)境部分〕〕，撲草凈對斑馬魚的毒性屬于高毒。對照組中斑馬魚的死亡率為0.2.3HA對撲草凈毒性的影響HA存在下，當(dāng)撲草凈濃度為6.5mgL-1和7.5mgL-1時，斑馬魚的96h致死率沒有顯著性差異〔P0.05〕。在P8.5+HA15實驗組斑馬魚的致死率到達100%,而P8.5和P8.5+HA5組的死亡率分別為60%和50%〔圖1〕。0.1%的丙酮助溶劑及HA15對照組中斑馬魚沒有死亡。在下面表述中P6.5、P6.5+HA5、P6.5+HA15為Ⅰ組，P7.5、P7.5+HA5、P7.5+HA15為Ⅱ組，P8.5、P8.5+HA5、P8.5+HA15為Ⅲ組。Ⅰ組在72~96h累積死亡率增加較快，96h累積死亡率較72h時高出30%~35%;Ⅱ和Ⅲ組較早進入快速死亡期〔48~72h〕，72h累積死亡率較48h時高出30%~40%和20%~80%〔圖2〕。另外，在Ⅰ組中，HA對撲草凈毒性的影響不大，而隨著撲草凈濃度的升高，HA對撲草凈毒性的影響逐步增大，并且這一經(jīng)過在染毒的72h最為顯著。3討論撲草凈對斑馬魚的96hLC50為7.488mgL-1,95%置信區(qū)間為7.032~7.971mgL-1.這與撲草凈對鯉魚〔Cyprinuscarpio〕的96hLC50〔8mgL-1〕[21]毒性數(shù)據(jù)類似，可能是由于斑馬魚和鯉魚均屬于鯉科種類的原因。撲草凈對雜色鳉〔Cyprinodonvariegatus〕和虹鱒〔Oncorhynchusmykiss〕的96hLC50分別為5.1mgL-1[3]和2.9mgL-1[9],低于斑馬魚的96hLC50,可能是由物種之間的差異、生物體大小不同等因素所致。HA是水體中一類重要的溶解性有機質(zhì)〔DOM〕，含有一系列功能團，如羥基、羧基、酚羥基、烯醇羥基等，會對疏水性有機污染物在環(huán)境中的行為產(chǎn)生重要影響。研究表示清楚HA能改變污染物在生物體內(nèi)的富集、急性毒性和抗氧化能力[22-23].曹璐等[22]研究發(fā)現(xiàn)低濃度HA〔0~2mgL-1〕與0.5mgL-1四溴雙酚共存條件下，HA降低了四溴雙酚A在金魚藻中的富集。Wiegand等[23]研究了三種DOM〔5、25mgL-1〕存在條件下，帶絲蚓〔Lumbriculusvariegates〕對百草枯的富集，結(jié)果表示清楚隨著DOM濃度的升高，百草枯在帶絲蚓體內(nèi)的富集量減少，這是由于DOM與百草枯構(gòu)成了電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物或是離子捆綁導(dǎo)致電荷中和，進而降低了百草枯的生物可利用性。徐盈等[24]發(fā)現(xiàn)一定濃度的HA能夠降低甲氰菊酯的生物可利用性及其對草魚的急性毒性，而且在HA濃度為10mgL-1時這種影響比5mgL-1時更大。而本研究并未得到類似結(jié)果，固然5mgL-1HA對撲草凈的毒性影響不大，但當(dāng)撲草凈濃度大于或等于96hLC50〔7.488mgL-1〕時，15mgL-1HA的存在增加了撲草凈的毒性，并且這一結(jié)果在48~72h表現(xiàn)最顯著。這與Meems等的研究結(jié)果有類似之處，他們發(fā)如今兩種低濃度〔5mgL-1〕的DOM〔天然有機質(zhì)和合成腐殖質(zhì)HS1500〕存在時，能降低氯氰菊酯對大型蚤〔Daphniamagna〕的毒性，而在50mgL-1濃度時含有合成腐殖質(zhì)HS1500組比沒有DOM存在時大型蚤活動抑制的比率增加50%.Oikari等[26]采集5種天然水作為不同濃度和性質(zhì)的DOM來源〔濃度為4.6~20.3mgL-1〕，發(fā)如今這些DOM存在條件下，氰戊菊酯對大型蚤的48h急性毒性效應(yīng)均增加。另外，還發(fā)如今20.3mgL-1DOM〔采自LakeLouhilampi〕存在時，林丹和氰戊菊酯對大型蚤的48h急性毒性效應(yīng)分別增加了4.6、3.6倍。本試驗中HA增加撲草凈毒性可能是由于DOM降低污染物生物可利用性的能力僅在低污染物濃度下顯示出作用，而并非在高濃度下。因而，在較高濃度的撲草凈〔大于LC50值〕與DOM共存時，減少污染物毒性的絡(luò)合機制被其他能夠引起毒性增加的機制所掩蓋，例如DOM中含有的醌型和芳香族構(gòu)造會提高生物體內(nèi)抗氧化酶的活性，已有研究發(fā)現(xiàn)天然DOM能夠引起生物體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶〔GPX〕和氧化物酶〔POD〕的升高[25,27],而這些活性物質(zhì)可能會調(diào)節(jié)污染物在生物體內(nèi)的代謝，進而增加污染物的毒性。另外，DOM可能會促進毒物更快進入生物體內(nèi)，表現(xiàn)為更早出現(xiàn)死亡。Steinberg等[28]曾假設(shè)DOM可能會通過干擾細胞膜的通透性來增加在魚體內(nèi)的富集。有研究報道DOM對多種水生生物有不利影響[29],如其誘導(dǎo)熱休克蛋白[23]、激活谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶〔sGST〕[30]和細胞色素氧化酶〔CYP1A〕[31]或改變生物行為等。Wiegand等[23]發(fā)現(xiàn)三種不同來源的天然DOM在5mgL-1時不能使帶絲蚓〔L.variegates〕體內(nèi)sGST增加，而在25mgL-1時sGST較不含DOM組明顯增加，同時兩個濃度均能引起帶絲蚓體內(nèi)過氧化氫酶和熱休克蛋白水平的明顯增加。除此之外，1、5、10、50mgL-1DOM〔天然可溶性有機質(zhì)SRNOM和人工合成有機質(zhì)HS1500〕的存在均能引起大型蚤〔Daphniamagna〕體內(nèi)sGST的顯著性增加[25].在HA對斑馬魚的96h急性毒性試驗中，15mgL-1的HA增加了斑馬魚體內(nèi)MDA濃度，并且與空白組有顯著性差異，5mgL-1HA組則與空白組無明顯差異〔圖3〕。這一結(jié)果與撲草