第章DNA重組技術(shù)

第六章DNA重組技術(shù)佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院唐冬生廣東醫(yī)學(xué)院黃迪南第六章DNA重組技術(shù)

DNA重組（DNArecombination）不同來(lái)源的DNA，通過(guò)磷酸二酯鍵連接而重新組合成新的DNA分子的過(guò)程。DNA克?。―NAclone）在體外對(duì)DNA分子進(jìn)行重組，構(gòu)建成具有自主復(fù)制能力的重組DNA分子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增，最終獲得大量同一的DNA分子亦稱分子克隆或DNA重組技術(shù)第六章DNA重組技術(shù)第六章DNA重組技術(shù)第二節(jié)常用載體第三節(jié)DNA重組與鑒定第一節(jié)常用的工具酶第一節(jié)常用的工具酶第一節(jié)常用的工具酶

工具酶：DNA重組技術(shù)，需要利用一些酶在體外對(duì)DNA進(jìn)行切割、連接等基因操作，這些酶常被稱為工具酶。主要的工具酶:限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶Ⅰ堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶TaqDNA聚合酶第一節(jié)常用的工具酶第一節(jié)常用的工具酶

二、DNA連接酶三、分子克隆中常用的其他酶一、限制性內(nèi)切酶一、限制性內(nèi)切酶

簡(jiǎn)稱限制酶，是DNA重組技術(shù)的基本工具識(shí)別和切割雙鏈DNA分子特異序列的核酸水解酶一、限制性內(nèi)切酶

（二）命名（三）Ⅱ類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列特點(diǎn)

（四）限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用

（五）限制性內(nèi)切酶的活力單位和星號(hào)活力

（六）甲基化酶

（一）分類(lèi)（一）分分類(lèi)根據(jù)酶的的分子組組成及裂裂解方式式的不同同，將限限制性內(nèi)切酶酶分為三三類(lèi)：1.Ⅰ類(lèi)類(lèi)和Ⅲ類(lèi)類(lèi)限制性內(nèi)內(nèi)切酶一、限制制性內(nèi)切切酶兼有修飾飾作用和和依賴于于ATP的限制制活性在DNA重組技技術(shù)中并并不常用用一、限制制性內(nèi)切切酶2.Ⅱ類(lèi)類(lèi)限制性內(nèi)內(nèi)切酶能識(shí)別并并切割特特異性的的核苷酸酸序列通常所說(shuō)說(shuō)的限制制性內(nèi)切切酶即指指此類(lèi)（二）命命名通常由三三個(gè)斜體體字母表表示1.第一一個(gè)大寫(xiě)寫(xiě)字母為為微生物物屬名的的第一個(gè)個(gè)字母2.第二二、三個(gè)個(gè)小寫(xiě)字字母為微微生物種種名的頭頭兩個(gè)字字母3.如有有株名則則再加一一個(gè)字母母一、限制制性內(nèi)切切酶一、限制制性內(nèi)切切酶4.同一一株微生生物發(fā)現(xiàn)現(xiàn)幾種限限制性內(nèi)內(nèi)切酶，，根據(jù)其發(fā)現(xiàn)和和分離的的先后順順序，用用羅馬數(shù)數(shù)字表示示例如:淀粉液化化芽胞桿桿菌（Bacillusamyloliguefaciens）H株第1種限制性性內(nèi)切酶酶，命名名為BamHⅠ(三)ⅡⅡ類(lèi)限制制性核酸酸內(nèi)切酶酶識(shí)別序序列特點(diǎn)點(diǎn)切口：：平端切口口--平末末端粘端切口口--粘性性末端GGATCCCCTAGG回文結(jié)構(gòu)構(gòu)一、限制制性內(nèi)切切酶BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口口粘端切口口一、限制制性內(nèi)切切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ1.同功功異源酶酶：來(lái)源不同同的限制制酶，能能識(shí)別和和切割同同一位點(diǎn)點(diǎn)，這些些酶稱同同功異源源酶。一、限制制性內(nèi)切切酶BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGG

AGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA2.同尾尾酶：有些限制制性內(nèi)切切酶雖然然識(shí)別序序列不完完全相同同，但切切割DNA后產(chǎn)產(chǎn)生相同同的粘性性末端，，稱為同同尾酶。。一、限制制性內(nèi)切切酶（四）限限制性內(nèi)內(nèi)切酶的的應(yīng)用主要應(yīng)用用：DNA重重組克隆隆及亞克克隆改造和構(gòu)構(gòu)建質(zhì)粒粒組建基因因組DNA物理理圖譜基因組DNA同同源性研研究DNA雜雜交DNA序序列分析析一、限制制性內(nèi)切切酶一、限制制性內(nèi)切切酶（五）限限制性內(nèi)內(nèi)切酶的的活力單單位和星星號(hào)活力力1.酶活活力單位位2.星號(hào)號(hào)活力3.注意意事項(xiàng)1.酶活活力單位位在合適溫溫度、pH值和和離子強(qiáng)強(qiáng)度等條條件下，，1小時(shí)內(nèi)完全全消化1μg特特異DNA底物物所需的的酶量，，定義為一個(gè)活活力單位位。（五）限限制性內(nèi)內(nèi)切酶的的活力單單位和星星號(hào)活力力一、限制制性內(nèi)切切酶2.星號(hào)號(hào)活性限制性內(nèi)內(nèi)切酶在在非標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)反應(yīng)條條件下，，對(duì)識(shí)別別序列的的特異性性下降，，能切割割一些與與特異識(shí)識(shí)別順序序類(lèi)似的的序列，，一般在在酶的右右上角加加“*”表示示克隆過(guò)程程中需同同時(shí)進(jìn)行行雙酶切切時(shí)，應(yīng)應(yīng)選用二二種酶都都能接受受的反應(yīng)應(yīng)緩沖體體系，否否則可能能影響酶酶的特異異性一、限制制性內(nèi)切切酶3.注意意事項(xiàng)底物DNA不能能含有痕痕量的酚酚、氯仿仿和乙醚醚溶液中不不能含SDS和和過(guò)量的的鹽，EDTA的含含量不能能大于10mmol/L一、限制制性內(nèi)切切酶反應(yīng)緩沖沖體系中中一般可可加入2-巰基基乙醇或或二硫蘇蘇糖醇，，防止含含巰基酶酶的氧化化失活加入牛血血清白蛋蛋白穩(wěn)定定酶活性性操作時(shí)應(yīng)應(yīng)注意混混勻反應(yīng)應(yīng)體系一、限制制性內(nèi)切切酶一、限制制性內(nèi)切切酶2.Ⅱ類(lèi)類(lèi)限制－－修飾系系統(tǒng)3.甲基基化酶的的應(yīng)用(六)甲甲基化化酶1.細(xì)菌菌的限制制－修飾飾系統(tǒng)(六)甲甲基化化酶1.細(xì)菌菌的限制制－修飾飾系統(tǒng)限制（降降解）外外來(lái)DNA，并并通過(guò)對(duì)對(duì)自身DNA的的修飾而起起保護(hù)作作用。一、限制制性內(nèi)切切酶一、限制制性內(nèi)切切酶2.Ⅱ類(lèi)類(lèi)限制－－修飾系系統(tǒng)由兩種酶酶分子組組成的二二元系統(tǒng)統(tǒng)一種為限限制性內(nèi)內(nèi)切酶，，另一種種為甲基基化酶兩種酶識(shí)識(shí)別序列列相同大腸桿菌菌株一般般有dam甲基基化酶和和dcm甲基化化酶（PstⅠ甲基化化酶使A甲基化化形成5′-CTGCmAG-3′）3.甲基基化酶的的應(yīng)用當(dāng)制備克克隆用雙雙鏈cDNA時(shí)時(shí)，外源源DNA片段可可用EcoRⅠ甲基化化酶處理理，使雙雙鏈cDNA內(nèi)內(nèi)部EcoRⅠ位點(diǎn)因甲甲基化受受到保護(hù)護(hù)而不被被切割一、限制制性內(nèi)切切酶二、DNA連接接酶催化雙鏈鏈DNA中相互互鄰近的的5′磷磷酸末端端和3′′羥基末端端生成磷磷酸二酯酯鍵，從從而封閉閉DNA雙鏈中中的切口或或?qū)⒍€(gè)個(gè)DNA分子連連接起來(lái)來(lái)。二、DNA連接接酶DNA連連接酶只只能作用用于雙鏈鏈DNA分子而而不能將將二個(gè)單單鏈DNA分子子連接DNA連連接酶是是重要的的基因重重組的工工具酶應(yīng)用DNA連接接酶將具具有相同同粘性末末端或平平端的DNA分子連連接起來(lái)來(lái)DNA連連接酶的的特點(diǎn)：：T4噬菌體DNA連連接酶能能連接帶帶粘性末末端或平平末端的的DNA分子大腸桿菌菌DNA連接酶酶不能連連接平末末端DNA分分子DNA重重組技術(shù)術(shù)常用T4噬菌體DNA連連接酶二、DNA連接接酶T4噬菌體DNA連連接酶連連接帶粘粘性末端端DNA分子的的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于連連接平末末端的DNA分分子連接反應(yīng)應(yīng)需要ATP、、Mg2+和二硫蘇蘇糖醇，，最適pH為7.2～7.4，，ATP為連接接反應(yīng)提提供能量量，二硫硫蘇糖醇醇可提高高連接效效率二、DNA連接接酶三、分子子克隆中中常用的的其他酶酶1.逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶2.TaqDNA聚聚合酶3.T4多核苷酸酸激酶4.末端端轉(zhuǎn)移酶酶（脫氧氧核苷酸酸末端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶））5.堿性性磷酸酶酶6.DNA聚合合酶Ⅰ7.Klenow片片段（DNA聚合酶酶Ⅰ大片段段）三、分子克克隆中常用用的其他酶酶1.逆轉(zhuǎn)錄錄酶以RNA為為模板逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄合成cDNA2.TaqDNA聚合酶PCR擴(kuò)增增目的DNA片段DNA序列列分析目的DNA片段3′′端加A，，用于A－－T克隆三、分子克克隆中常用用的其他酶酶3.T4多核苷酸激激酶催化多聚核核苷酸5′′端羥基磷磷酸化標(biāo)記探針5′端4.末端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶（脫脫氧核苷酸酸末端轉(zhuǎn)移移酶）DNA片段段3′端加加上同聚物物尾標(biāo)記DNA片段3′′端5.堿性磷磷酸酶去除多聚核核苷酸5′′端磷酸基基團(tuán)6.DNA聚合酶ⅠⅠ合成雙鏈DNA分子子缺口平移法法，獲得高高比活性探探針DNA序列列分析補(bǔ)平3′端端三、分子克克隆中常用用的其他酶酶7.Klenow片片段（DNA聚合酶酶Ⅰ大片段段）具有完整的的DNA聚聚合酶活性性保留3′→→5′外切切酶活性無(wú)5′→3′外切酶酶活性三、分子克克隆中常用用的其他酶酶Klenow片段的的主要應(yīng)用用：合成cDNA第二鏈鏈補(bǔ)齊雙鏈DNA分子子3′端或或標(biāo)記3′′端DNA序列列分析三、分子克克隆中常用用的其他酶酶第二節(jié)常常用載載體載體（vector）的概念念攜帶靶DNA（目的的DNA））片段進(jìn)入入宿主細(xì)胞胞進(jìn)行擴(kuò)增和表表達(dá)的運(yùn)載載工具。第二節(jié)常常用載載體第二節(jié)常常用用載體常用的載體體主要有：：質(zhì)粒載體、、噬菌體載載體、病毒毒載體和人人工染色體體等根據(jù)其用途途不同分為為：克隆載體（（cloningvector）表達(dá)載體（（expressingvector）載體構(gòu)建和和選擇的條條件：1.自主復(fù)復(fù)制能力或或能整合到到宿主染色色體上與基基因組一同復(fù)復(fù)制的能力力2.合適的的限制性酶酶切位點(diǎn)供供外源DNA片段插插入3.分子量量不宜過(guò)大大，以便于于容納較大大的外源DNA片段并獲得得較高的拷拷貝數(shù)第二節(jié)常常用用載體第二節(jié)常常用用載體4.常用的的篩選標(biāo)記記有抗藥性性、酶基因因、營(yíng)養(yǎng)缺陷型或形形成噬菌斑斑的能力等等5.配備與與宿主相適適應(yīng)的調(diào)控控元件，如如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子子和前導(dǎo)序序列等第二節(jié)常常用用載體二、噬菌體體載體三、穿梭載載體四、人工染染色體一、質(zhì)粒載載體一、質(zhì)粒載載體質(zhì)粒載體是是應(yīng)用最廣廣的載體質(zhì)粒載體大大多是在天天然松馳型型質(zhì)粒的基基礎(chǔ)上經(jīng)人工改造拼拼接而成質(zhì)粒在宿主主蛋白質(zhì)合合成及染色色體復(fù)制停停止后尚能繼續(xù)復(fù)制制理想質(zhì)粒載載體的特點(diǎn)點(diǎn)：1.松馳型型復(fù)制子（（如ColE1）復(fù)制子（replicon））為質(zhì)粒自自我增殖所所必需2.幾個(gè)單單一的酶切切位點(diǎn)（或或多克隆位位點(diǎn)）以便目的DNA片段段插入一、質(zhì)粒載載體一、質(zhì)粒載載體3.插入失失活的篩選選標(biāo)志具有兩種抗抗生素抗性性標(biāo)志，如如氨芐青霉霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素素抗性基因因（Tetr）等。4.分子量量相對(duì)較小小和拷貝數(shù)數(shù)較高5.缺點(diǎn)：：容量較小小，一般只只能接受小小于15kb的DNA一、質(zhì)粒載載體（一）pBR322質(zhì)粒載載體（二）pUC質(zhì)粒粒載體系列列（一）pBR322質(zhì)粒載載體pBR322載體是是最早被廣廣泛應(yīng)用克克隆的載體體之一pBR322載體的的組成：來(lái)源于ColE1的的派生質(zhì)粒粒pMB1的復(fù)制起起始位點(diǎn)來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒易易位子Tn3的Ampr來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的Tetr一、質(zhì)粒載載體pBR322質(zhì)粒載載體的特點(diǎn)點(diǎn)：1.帶有一一個(gè)復(fù)制起起始點(diǎn)（ori）2.抗生素素抗性基因因（Ampr和Tetr）作選擇標(biāo)標(biāo)志3.數(shù)數(shù)個(gè)個(gè)單單一一的的限限制制性性酶酶切切位位點(diǎn)點(diǎn)一、、質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體4.較較小小的的分分子子量量易于于自自身身DNA的的純純化化，，而而且且能能有有效效地地克克隆隆6kb大小小的的外外源源DNA片片段段。。5.較較高高的的拷拷貝貝數(shù)數(shù)每個(gè)個(gè)細(xì)細(xì)胞胞達(dá)達(dá)1000～3000個(gè)個(gè)拷拷貝貝。。一、、質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體一、、質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體rrpBR332質(zhì)質(zhì)粒粒結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)示示意意圖圖（二二））pUC質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體系系列列在pBR322基基礎(chǔ)礎(chǔ)上上改改建建而而成成一、、質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體典型型的的pUC質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體有有4個(gè)個(gè)組組成成部部分分：：來(lái)自自pBR322質(zhì)質(zhì)粒粒的的復(fù)制制起起始始點(diǎn)點(diǎn)Ampr基因因大腸腸桿桿菌菌ββ-半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因（（LacZ））啟啟動(dòng)動(dòng)子子及及編編碼碼αα-肽肽鏈鏈的的DNA序序列列（（LacZ′′基基因因）多克克隆隆位位點(diǎn)點(diǎn)（位位于于LacZ′′基基因因中中靠靠近近5′′端端））一、、質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體pUC系系列列的的優(yōu)優(yōu)越越性性最通通用用的的大大腸腸桿桿菌菌克克隆隆載載體體之之一一優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)具有有更更小小的的分分子子量量和和更更高高的的拷拷貝貝數(shù)數(shù)僅保保留留了了pBR322的的復(fù)復(fù)制制子子和和Ampr具有有來(lái)來(lái)自自大大腸腸桿桿菌菌LacZ操操縱縱子子的的LacZ′′基基因因，，適適應(yīng)應(yīng)于于組組織織化化學(xué)學(xué)篩篩選選重重組組體體一、、質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體一、、質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體rpUC18/pUC19質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)二、、噬噬菌菌體體載載體體λ噬菌體載體體粘粒載體稱柯柯斯質(zhì)粒（cosmid）單鏈絲狀噬菌菌體載體二、噬菌體載載體λgt10（（插入型）結(jié)結(jié)構(gòu)二、噬菌體載載體Charon40（替替換型）結(jié)構(gòu)構(gòu)二、噬菌體載載體r粘粒載體pJB8結(jié)構(gòu)二、噬菌體載載體M13mp18/M13mp19結(jié)結(jié)構(gòu)三、穿梭載體體同時(shí)具有原核核和真核細(xì)胞胞的復(fù)制起始始點(diǎn)真核生物的克克隆載體常構(gòu)構(gòu)建成穿梭載載體，使其先先在大腸桿菌菌中擴(kuò)增，再再轉(zhuǎn)入真核細(xì)細(xì)胞若加上適當(dāng)?shù)牡恼婧藛?dòng)子子等元件，則則成為真核表表達(dá)載體，能能在真核細(xì)胞胞中表達(dá)插入入載體中的外外源基因三、穿梭載體體真核系統(tǒng)載體體還必需具備備適當(dāng)?shù)暮Y選選標(biāo)記使用遺傳缺陷陷型細(xì)胞株與與載體的基因因產(chǎn)物互補(bǔ)（（如TK基因因產(chǎn)物）抗新霉霉素基基因三、穿穿梭載載體（二））逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病病毒載載體（一））SV40（猿猿猴病病毒））載體體（一））SV40（猿猿猴病病毒））載體體真核表表達(dá)載載體中中的調(diào)調(diào)控元元件大大都來(lái)來(lái)源于于SV40的調(diào)調(diào)控順順序和和復(fù)制制信號(hào)號(hào)用SV40DNA與外外源DNA構(gòu)建建重組組子，，轉(zhuǎn)染染細(xì)胞胞后允允許細(xì)細(xì)胞形形成含含外源源DNA的的病毒毒顆粒粒重組子子不包包裝成成病毒毒顆粒粒，而而在細(xì)細(xì)胞中中復(fù)制制或整整合到到染色色體組組中三、穿穿梭載載體例：PSVK3質(zhì)粒粒PSVK3是一一類(lèi)廣廣泛適適用于于哺乳乳動(dòng)物物細(xì)胞胞系表表達(dá)外外源基基因的的穿梭梭載體體。三、穿穿梭載載體PSVK3具有有下列列構(gòu)件件：1.原原核系系統(tǒng)構(gòu)構(gòu)件：：復(fù)制子子和絲絲狀噬噬菌體體復(fù)制制起始始位點(diǎn)點(diǎn)fl篩選標(biāo)標(biāo)志（（Ampr）啟動(dòng)子子（T7啟動(dòng)子子）2.真真核系系統(tǒng)構(gòu)構(gòu)件：：SV40復(fù)復(fù)制起起始點(diǎn)點(diǎn)SV40早早期啟啟動(dòng)子子三、穿穿梭載載體3.RNA修飾飾信號(hào)號(hào)：SV40小小T抗抗原拼拼接信信號(hào)SV40早早期區(qū)區(qū)mRNApolyA加尾尾信號(hào)號(hào)4.多多克隆隆位點(diǎn)點(diǎn)：SV40啟啟動(dòng)子子下游游有8個(gè)酶酶切位位點(diǎn)三、穿穿梭載載體三、穿穿梭載載體pSVK3質(zhì)粒粒（二））逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病病毒載載體逆轉(zhuǎn)錄錄病毒毒載體體的特特點(diǎn)：：具有廣廣泛的的哺乳乳動(dòng)物物細(xì)胞胞宿主主較大的的容量量，能能插入入7kb甚甚至更更大的的外源源基因因三、穿穿梭載載體病毒基基因組組自身身含有有完整整高效效的調(diào)調(diào)控元元件病毒可可通過(guò)過(guò)主動(dòng)動(dòng)感染染方式式進(jìn)入入宿主主細(xì)胞胞，并并能有有效地地整合合到宿宿主染染色體體基因因組中中，與與染色色體一一起復(fù)復(fù)制、、長(zhǎng)期期存在在逆轉(zhuǎn)錄錄病毒毒作為為載體體需要要相應(yīng)應(yīng)的外外包裝裝，以以形成成完整整的體體系三、穿穿梭載載體逆轉(zhuǎn)錄錄病毒毒載體體的局局限性性：逆轉(zhuǎn)錄錄病毒毒載體體進(jìn)入入細(xì)胞胞依賴賴于細(xì)細(xì)胞表表面的的受體體，并并且只只能感感染并并整合合到分分裂增增殖期期的細(xì)細(xì)胞裝載容容量較較小，，僅8kb左右右可能存存在具具有復(fù)復(fù)制能能力的的野生生型病病毒三、穿穿梭載載體常用外外源DNA片段段取代代病毒毒中的的癌基基因，，即卸卸去其其致癌癌性，，稱為為卸甲甲載體體（disarmedvector）。。三、穿穿梭載載體四、人人工染染色體體酵母人人工染染色體體（YAC）細(xì)菌人人工染染色體體（BAC）噬菌體體P1衍生生的人人工染染色體體（PAC）哺乳動(dòng)動(dòng)物人人工染染色體體（MAC）YAC主要要調(diào)控控元件件著絲粒粒：保保證染染色體體細(xì)胞胞分裂裂過(guò)程程中正正確分分配到子子代細(xì)細(xì)胞端粒：：防止止染色色體被被核酸酸外切切酶降降解復(fù)制起起始點(diǎn)點(diǎn)和限限制性性內(nèi)切切酶位位點(diǎn)四、人工染色色體篩選標(biāo)志：酵母中一般通通過(guò)色氨酸、、亮氨酸、組組氨酸或尿嘧嘧啶的合成基基因產(chǎn)物插入入失活而進(jìn)行行篩選原核序列及調(diào)調(diào)控元件：包括大腸桿菌菌復(fù)制起始點(diǎn)點(diǎn)、Ampr基因等四、人工染色色體YAC作為載載體的主要特特點(diǎn)：酵母是單細(xì)胞胞真核生物，，培養(yǎng)方便酵母的真核細(xì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)統(tǒng)，有利于表表達(dá)真核生物物基因裝載容量大，，可達(dá)Mbp水平四、人工染色色體DNA片段連連接到Y(jié)AC載體的（兩兩）臂上形成成重組體，將將重組體通過(guò)過(guò)常規(guī)方法導(dǎo)導(dǎo)入酵母已廣泛應(yīng)用于于各種生物基基因組計(jì)劃四、人工染色色體第三節(jié)DNA重組與與鑒定第三節(jié)DNA重組與與鑒定將不同來(lái)源的的DNA分子子進(jìn)行特異地地切割獲得的目的基基因或DNA片段與載體體連接重組的DNA分子導(dǎo)入相相應(yīng)的宿主細(xì)細(xì)胞在宿主細(xì)胞中中進(jìn)行無(wú)性增增殖DNA重組(DNArecombination)第三節(jié)DNA重組與與鑒定第三節(jié)DNA重組與與鑒定二、重組子的的篩選與鑒定定三、DNA序序列測(cè)定一、DNA重重組一、DNA重重組（二）重組DNA分子導(dǎo)導(dǎo)入宿主細(xì)胞胞（一）目的DNA片段與與載體的連接接平接法平端連接法人人工接接頭法同聚體加尾連連接一、DNA重重組（一）目的DNA片段與與載體的連接接粘端連接法平端連接法一、DNA重重組2.平端連接接3.同聚體加加尾連接4.人工接頭頭連接（一）目的DNA片段與與載體的連接接1.粘性末端端連接1.粘性末端端連接（cohesiveendligation））DNA插入片片段與的載體體存在同源粘粘性末端同源粘性末端端包括相同一一種內(nèi)切酶產(chǎn)產(chǎn)生的粘性末端和不同的的內(nèi)切酶產(chǎn)生生的互補(bǔ)粘性性末端一、DNA重重組（一）目的DNA片段與與載體的連接接一、DNA重重組2.平端連接接(bluntendligation)DNA連接酶酶可催化相同同和不同限制制性內(nèi)切酶切切割的平端之之間的連接。。一、DNA重重組載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目的基因一、DNA重重組3.同聚體加加尾連接適用于外源DNA片段與與載體均為平平末端或?yàn)椴徊黄ヅ涞恼承阅┒硕擞媚┒宿D(zhuǎn)移酶酶使一個(gè)DNA分子3′′端接上多聚聚A,另一個(gè)DNA片段3′端端接上多聚T，按A-T配對(duì)原則相連一、DNA重重組一、DNA重重組4.人工接頭頭連接將目的基因或或DNA片段段的兩端接上上能夠被某一一限制性內(nèi)切切酶識(shí)別的DNA序列，，酶切后和載載體獲得相同同的粘性末端端，再進(jìn)行粘粘性末端的連連接。一、DNA重重組一、DNA重重組宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞（大大腸桿菌）真核細(xì)胞(哺哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)細(xì)胞、酵母和和昆蟲(chóng)細(xì)胞)重組DNA分分子導(dǎo)入宿主主細(xì)胞方式：：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和和感染（二）重組DNA分子導(dǎo)導(dǎo)入宿主細(xì)胞胞一、DNA重重組一、DNA重重組（二）重組DNA分子導(dǎo)導(dǎo)入宿主細(xì)胞胞1.重組DNA分子導(dǎo)入入原核細(xì)胞2.重組DNA分子直接接導(dǎo)入真核細(xì)細(xì)胞3.使用噬菌菌體或病毒將將重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)細(xì)胞1.重組DNA分子導(dǎo)入入原核細(xì)胞將重組的DNA分子導(dǎo)入入細(xì)菌，使其其在細(xì)菌體內(nèi)內(nèi)擴(kuò)增及表達(dá)的過(guò)過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)化的方法可可分為CaCl2法和電穿孔法法一、DNA重重組細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)過(guò)程中，只有有某一狀態(tài)的的細(xì)菌才能成為轉(zhuǎn)化的接接受體，這種種細(xì)菌稱為感感受態(tài)細(xì)菌感受態(tài)細(xì)菌表表面正電荷增增多，細(xì)胞壁壁和膜的通透性增加，有有利于DNA分子的吸附附與吸收一、DNA重重組當(dāng)細(xì)菌處于0℃、二價(jià)陽(yáng)陽(yáng)離子低滲溶溶液中時(shí)，細(xì)細(xì)菌細(xì)胞膨脹成成球形，處于于感受態(tài)轉(zhuǎn)化混合物中中的DNA形形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于于細(xì)胞表面，，在42℃℃短時(shí)間熱沖沖擊后DNA進(jìn)入入細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率為每每微克DNA可獲得105～106轉(zhuǎn)化子CaCl2法一、DNA重重組電穿孔法（electroporation））即電擊法，利利用高壓脈沖沖，在細(xì)菌細(xì)細(xì)胞表面形成成暫時(shí)性的微孔孔，重組DNA從微孔孔中進(jìn)入，脈脈沖過(guò)后微孔復(fù)原轉(zhuǎn)化效率高，，每微克DNA可得到109～1010轉(zhuǎn)化子一、DNA重重組將外源DNA直接導(dǎo)入真真核細(xì)胞的過(guò)過(guò)程稱為轉(zhuǎn)染（transinfection）常用的方法：：電穿孔法磷酸鈣共沉淀淀法脂質(zhì)體法DEAE-葡葡聚糖介導(dǎo)顯微注射法等等2.重組DNA分子直接接導(dǎo)入真核細(xì)細(xì)胞一、DNA重組磷酸鈣共沉沉淀法將被轉(zhuǎn)染的的DNA和和正在溶液液中形成的的磷酸鈣微微粒共沉淀淀后，磷酸酸鈣和外源源性DNA形成沉淀淀顆粒附著著在細(xì)胞表表面，在鈣鈣、磷的誘誘導(dǎo)下通過(guò)過(guò)內(nèi)吞作用用被細(xì)胞攝攝取。一、DNA重組脂質(zhì)體法是一種人造造膜泡，它它帶有正電電荷，與DNA或RNA上帶帶負(fù)電的磷磷酸基團(tuán)結(jié)結(jié)合，形成成由陽(yáng)離子子脂質(zhì)包裹裹DNA的的顆粒。脂質(zhì)體上剩剩余的正電電荷與細(xì)胞胞膜上的唾唾液酸殘基基的負(fù)電荷荷結(jié)合，通通過(guò)二者的的融合將外外源基因?qū)?dǎo)入細(xì)胞。。一、DNA重組顯微注射法法將外源基因因的重組體體通過(guò)顯微微注射裝置置直接注入入細(xì)胞核中中并進(jìn)行表表達(dá)，但顯微注射法法需要一定的的儀器和操操作技巧。。一、DNA重組3.使用噬噬菌體或病病毒將重組組DNA分分子導(dǎo)入細(xì)細(xì)胞重組DNA分子在體體外包裝成成具有感染染能力的噬菌體或病毒顆粒粒，然后感感染適當(dāng)?shù)牡募?xì)胞，這這種使用噬菌體或病病毒將重組組DNA分子導(dǎo)入入細(xì)胞的方方法為感染(infection)效率較高，，每微克可可得到107轉(zhuǎn)化子一、DNA重組二、重組子子的篩選與與鑒定（二）根據(jù)據(jù)重組DNA的分子子生物學(xué)特特征進(jìn)行鑒鑒定（一）根據(jù)據(jù)遺傳學(xué)性性狀進(jìn)行篩篩選二、重組子子的篩選與與鑒定（一）根據(jù)據(jù)遺傳學(xué)性性狀進(jìn)行篩篩選1.抗性性標(biāo)志篩選選2.抗性性標(biāo)志插入入失活篩選選3.α互補(bǔ)補(bǔ)篩選4.標(biāo)志志補(bǔ)救篩選選（一）根據(jù)據(jù)遺傳學(xué)性性狀進(jìn)行篩篩選1.抗性標(biāo)標(biāo)志篩選當(dāng)帶有完整整抗藥性基基因的載體體轉(zhuǎn)入無(wú)抗抗藥性細(xì)胞胞后，凡轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入載體的的細(xì)胞都獲獲得了抗藥藥性，能在在含有相應(yīng)應(yīng)抗生素的的瓊脂平板板上生長(zhǎng)成成菌落，而而未被轉(zhuǎn)化化的宿主細(xì)細(xì)胞不能生生長(zhǎng)。二、重組子子的篩選與與鑒定2.抗性標(biāo)標(biāo)志插入失失活篩選選用含有兩兩個(gè)以上的的抗藥基因因載體，外外源DNA片段插入入其中一個(gè)個(gè)基因，導(dǎo)導(dǎo)致這個(gè)基基因失活，，用兩個(gè)含含不同抗生生素的平板板互相對(duì)照照，篩選含含重組DNA的菌落落。二、重組子子的篩選與與鑒定二、重組子子的篩選與與鑒定3.α互補(bǔ)補(bǔ)篩選含有編碼LacZ基基因的調(diào)控控序列和N端146個(gè)氨基酸酸的編碼序列列當(dāng)宿主細(xì)胞胞含有β-半乳糖苷苷酶C端編編碼序列時(shí)時(shí)，此酶的N端端序列與宿宿主細(xì)胞的的C端序列列互補(bǔ)，產(chǎn)產(chǎn)生具有活性性的β-