真核基因組中重復序列

基因組小，單拷貝；非編碼序列較少化學組成多樣；多順反子；基因重疊

斷裂基因；分段基因組

核基因組之一病毒基因組核基因組之二原核生物基因組1.基本是單拷貝的；2.擬核（類核）結構；3.存在多順反子結構；4.非編碼序列相對較少；

真核生物核基因組1.基因組較大，低等真核生物：107-108bp,較原核生物大10倍；高等真核生物：5X108-1010bp，某些植物和兩棲生物可達1011bp；哺乳類生物大于2X109它們可編碼100萬個基因。2.真核生物核DNA與蛋白質結合，形成核小體，再纏繞成染色質（染色體）；重樓百合1.5X10e11

NucleosomestructureNucleosomecore(left)146bpDNA;13/4turnsofDNADNAisnegativelysupercoiledtwoeach:H2A,H2B,H3,H4(histoneoctomer)Nucleosome(right)~200bpDNA;2turnsofDNAplusspaceralsoincludesH1histoneNucleofilamentstructureVideoDNA包裝人體DNA的總長度大約為3.5米，細胞核直徑僅有0.01毫米。按比例放大，相當于將150公里的長繩硬塞進一個足球里。Wapl控制cohesin與DNA結合緊密程度。Vermicelli（意，小蟲子）骨架，維持染色體的形狀。

AntonioTedeschi,etal.Waplisanessentialregulatorofchromatinstructureandchromosomesegregation.Nature,25August2013;doi:10.1038/nature124713.基因組一般為雙倍體（diploid）;4.基因組中非編碼序列多于編碼序列，有大量的冗余DNA；5.存在大量重復序列，重復次數(shù)可高達百萬倍；6.基因為單順反子。一個基因單獨轉錄，一個基因一條mRNA,翻譯成一條多肽鏈；7.大部分基因有內含子，因此基因不連續(xù)；8.具有基因家族。

真核生物基因組的特點：

重復性、基因家族、不連續(xù)性。

5’3’promoterregionexons(filledandunfilledboxedregions)introns(betweenexons)transcribedregiontranslatedregionmRNAstructure+1Genestructure（一個完整的具有轉錄功能的單元）不連續(xù)性

基因家族genefamily1.概念

基因組中來源相同、結構相似、功能相關的一組基因成為基因家族（genefamily）。一些基因彼此靠近，成串地排列在一起，這種基因排列結構叫基因簇（genecluster）。在基因家族結構中經(jīng)常會看到基因簇結構?；虼亍囗樂醋咏Y構

分類：串聯(lián)重復多基因家族組蛋白、tRNArRNA分散重復多基因家族Alu家族不同組織、細胞類型、發(fā)育時期表達的多基因家族同工酶（珠蛋白）真核生物中重要的基因家族1.Alu基因家族分散重復序列在單倍體人基因組中有5X105個拷貝，約占人基因組的3-6%。每個重復單元的長度為300bp,含一個Alu酶切位點，因而得名。酶切后生成130bp和170bp兩個片段，每個Alu片段兩側有6-20bp的同向重復序列，存在于間隔區(qū)（space）和內含子中。功能：可能與基因轉錄、調控、加工有關。LDLreceptorgeneAlurepeatspresentwithinintronsAlurepeatsinexons444555666AluAluAluAluX46Aluunequalcrossingoveroneproducthasadeletedexon5(theotherproductisnotshown)

2.rRNA基因家族串聯(lián)重復，有轉錄活性

大多數(shù)真核生物rRNA基因家族集中分布在一條或幾條染色體上，以核仁區(qū)含量最高。通常編碼區(qū)較為保守，內間區(qū)具有種間特異性，常被用作物種種類鑒定及進化分析。

rRNA基因家族（genecluster）

5SrRNA基因家族在所有染色體上都有，分布頻率較高。一般由120bp組成每個重復單元由5sRNA基因和和轉錄區(qū)前的非轉錄區(qū)組成，重復串聯(lián)形成基因簇。非洲爪蟾卵母細胞的5sRNA基因：富含A-T的序列，由不同的15bp序列重復而成，（CAAAGTTTGAGTTTT）這段序列的串連數(shù)不同，非轉錄的間隔區(qū)的長度會有所改變。

真核生物tRNA基因家族

tRNA基因長約70-90bp,基因全長約140bp；基因之間串聯(lián)重復排列；多個不同的tRNA基因組成一個串聯(lián)重復，每個基因的方向不同，并單獨轉錄。組蛋白基因家族與細胞DNA復制有關中度重復序列（幾十~幾百個重復），不含內含子，無需轉錄后加工，mRNA產(chǎn)物無3’—polyA與DNA復制無關的組蛋白組織特異性表達的組蛋白單拷貝

特點：組蛋白基因缺乏內含子；組蛋白基因家族是重復序列中唯一已知具有蛋白質編碼功能的基因。珠蛋白基因家族血紅蛋白分子是珠蛋白的四聚體22，型亞基基因在16號染色體上，型亞基基因在11號染色體上，珠蛋白基因以基因家族的形式排列。核基因組之三真核生物核基因組1.一般為雙倍體,基因組較大，2.真核生物核DNA與蛋白質結合，形成核小體，再纏繞成染色質（染色體）；3.基因為單順反子,有內含子不連續(xù)；4.基因組中非編碼序列多，存在大量重復序列；5.基因家族基因組結構與進化的關系：1.基因組的物質組成從多樣→單一；DNA、RNA分工明確單鏈、雙鏈，線狀、環(huán)狀→雙鏈線狀2.基因組由小→大；3.DNA的利用率越來越低；（多拷貝、非編碼區(qū)、基因不連續(xù)）4.調控序列增多，調控方式更復雜。PropertiesofthehumangenomeNuclearthehaploidhumangenomehas~3X109bpofDNAsingle-copyDNAcomprises~75%ofthehumangenomethehumangenomecontains~23,000to25,000genesgenesarecomposedoffrom1to>75exonsgenesvaryinlengthfrom<100to>2,300,000bpAlusequencesarepresentthroughoutthegenomeMitochondrialcirculargenomeof~17,000bpcontains<40genes遺傳性疾病----DMD

遺傳性疾病----DMD的分子診斷迪謝內肌營養(yǎng)不良(DMD)是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X染色體連鎖的遺傳性疾病，發(fā)病率為1/3500個男孩DMD基因位于Xp21.2-21.3，全長2400Kb,有79個外顯子。DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%~70%。DMD基因的突變導致dystrophin缺陷檢測DMD基因的技術：Southern印跡、多重PCRDMD基因外顯子缺失的檢測

史蒂芬·霍金

ALS肌萎縮性側索硬化癥

TypeofDNA%ofGenomeFeaturesSingle-copy(unique) ~75% Includesmostgenes1RepetitiveInterspersed ~15% Interspersedthroughoutgenomebetween andwithingenes;includesAlusequences2

Satellite(tandem) ~10% Highlyrepeated,VNTRs

2

Alusequencesare about300bpinlength andarerepeatedabout 300,000timesinthe genome.Theycanbe foundadjacenttoor withingenesinintrons ornontranslatedregions.1Somegenesarerepeated,wouldbeintherepetitiveDNAfraction501000IIIIIIIIIfast~10%intermediate

~15%slow(single-copy)

~75%ClassesofrepetitiveDNAInterspersed(dispersed)repeats(e.g.,Alusequences)TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTandemrepeats(e.g.,microsatellites)GCTGAGGGCTGAGGGCTGAGG

重復性（重復序列）DNA的復雜性Cot1/2=1/k

據(jù)基因組重復次數(shù)高低：單拷貝序列重復序列輕度重復序列2~101中度重復序列10~102高度重復序列102~106

1.單拷貝序列：只有一個拷貝，占基因組的40-70%.主要是功能基因。2%2.輕度重復基因組中有2-10個拷貝,主要是組蛋白和tRNA基因.

3.中度重復序列

拷貝數(shù)有幾十至幾百個，一般無RNA轉錄產(chǎn)物（非編碼序列）,一般認為與基因的表達調控有關(包括轉錄調控序列，復制控制序列，轉錄后的加工等).

長周期分散的重復序列LINE5000bp疾病分兩種短周期分散的重復序列SINE100~300bp

4.高度重復序列

衛(wèi)星：（satelliteDNA）序列較短5-100bp，大部分集中在異染色質中（中心粒和端粒的附近）真核生物中含10~20%。特點：A、T含量高，序列簡單，不轉錄，其功能尚不清楚。小衛(wèi)星:15-70核心序列為33bp，常定位在人常染色體區(qū)域，呈多態(tài)性微衛(wèi)星(microsatellite)。微衛(wèi)星在2～6bp之間，普遍散布在人類整條染色體上，或者在基因間區(qū)域或者位于內含子內。又稱簡單串聯(lián)重復序列STR，SSR（SimpleSequenceRepeats）DNAdetective分子探針1.RFLP2.SSR/STR3.SNP應用：正常樣本的差異鑒定病理樣本的變化1982年，Bell等發(fā)現(xiàn)高度串聯(lián)重復的短序列單位，重復單位數(shù)目的差異導致了這種高度的可變性，由于這些結構特征，人們稱這些區(qū)域可變數(shù)目的串聯(lián)重復(VariableNumberofTandemRepeats，VNTR)。

VNTR1985年，Jeffreys等用肌紅蛋白基因第一內含子中的串聯(lián)重復序列(重復單位含33bp)作探針,從人的基因文庫中篩選出8個含有串聯(lián)復序列(小衛(wèi)星)的重組克隆。序列分析表明，這8個小衛(wèi)星重復單位的長度和序列不完全相同，但都有相同的核心序列(coresequence)。他們先后用兩個多核心小衛(wèi)星探針進行southern雜交，在低嚴謹條件下雜交得到了包含10多條帶的雜交圖譜，不同個體雜交圖譜上帶的位置就象人的指紋一樣千差萬別，Jeffrey稱之為DNA指紋(DNAfingerprint)，又名遺傳指紋(geneticfingerprint)。(VNTR)analysisiscommonlyusedinforensicsVNTRisbasedonhypervariablemicrosatellitesequencepolymorphismswithinthehumangenome.Thesesequences(e.g.,CACACA…)arefoundinmanylocationsinthehumangenomeandvarygreatlyfrompersontoperson.UsingVNTRtocompareforensicandsuspectsamplesIndividualsA&Careexcludedbythisanalysis.ThesamplesfromindividualBwillbesubjectedtofurthertests.微衛(wèi)星MicrosatelliteDNA

SSR（SimpleSequenceRepeats）

微衛(wèi)星DNA是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀簡單重復序列，每個重復單元的長度在2—10bp之間，常見的微衛(wèi)星如(TG)n或(AAT)n等，呈現(xiàn)出長度多態(tài)性(序列多態(tài)性)。而且每個SSR座位兩側一般是相對保守的單拷貝序列.了解SSR座位的側翼序列(FlankingRegion)，尋找其中的特異保守區(qū)。據(jù)此可設計引物來擴增SSR序列。后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色，通過比較譜帶的相對遷移距離，便可知不同個體在某個SSR座位上的多態(tài)性。微衛(wèi)星的優(yōu)點：（1）微衛(wèi)星DNA數(shù)量多且均勻分布在基因組中。據(jù)估計，在基因組中平均30—50kb就存在一個微衛(wèi)星，為在整個基因組中定位更多的基因提供了極大的方便（2）微衛(wèi)星DNA具有豐富的多態(tài)性(SSR重復數(shù)目變化很大，所以SSR標記能揭示比RFLP高得多的多態(tài)性)，并且微衛(wèi)星位點檢測可以顯示純合子和雜合子（孟德爾遺傳）。這就是SSR標記的原理。（3）微衛(wèi)星檢測容易、重復性較好、省時，適合于進行自動化分析。通過GeneScan檢測，一個位點的檢測一般可在24h內完成，且可同時進行多位點的檢測。應用CombinedDNAIndexSystem(CODIS)DNAdatabase(FBI)

DNAdetective應用：1.生物進化2.DNA指紋圖譜（親子鑒定）3.RFLP分析檢測基因缺失、突變、擴增第一代RFLP限制性內切酶多態(tài)性分析RestrictionFragmentLengthPolymorphisms制作方法：酶切—電泳—（轉膜—雜交）—分析

舉例：

——鐮刀狀紅細胞貧血

β－珠蛋白基因的第六個密碼子A→T↓

表達產(chǎn)物：谷氨酸→纈氨酸

一個堿基突變→缺失1個MstⅡ內切酶位點

正常人：1.1kb患者：1.3kb

5’3’

5’3’

1.1kb

1.3kb

MstII酶切位點（CCTNATG）正?；蛲蛔兓?.3kb1.1kb0.2kb123

1、正常人2、突變攜帶者3、患者AFLP—AmplifiedFragmentLengthPolymorphism擴增片段長度多態(tài)性分析制作方法：酶切—加接頭—PCR—電泳—分析。RFLP、AFLP用于突變分析的局限性：突變必須發(fā)生于酶切位點區(qū)域，否則檢測不到。SSCP—Singlestrandconformationpolymorphism單鏈構象多態(tài)性分析

基本原理：單鏈DNA片段呈復雜的空間折疊構象，這種立體結構主要是由其內部堿基配對等分子內相互作用力來維持的，當有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構象，使構象發(fā)生改變，空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中遷移率不同?；具^程是:①PCR擴增靶DNA;②PCR擴增產(chǎn)物變性；③聚丙烯酰胺凝膠電泳;④顯色分析結果.若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構象發(fā)生改變，進而推斷該DNA片段中有堿基突變.

局限性：只有突變位點影響其空間構象才能被檢出來。檢出率：70%

第三代SNPSNP是SingleNucleotidePolymorph