免疫檢驗第十三章免疫細胞分離與檢測

免疫檢驗第十三章免疫細胞分離與檢測第一頁，共三十六頁，2022年，8月28日密度梯度離心(Ficoll)離心第二頁，共三十六頁，2022年，8月28日二、淋巴細胞分離（去單核細胞）貼壁粘附法

（單核細胞貼壁生長的特點、將懸液置玻璃或塑料器皿，未貼壁的為淋巴細胞，此法易造成B流失）吸附柱過濾法

（單核細胞貼壁生長的特點，將細胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠的層析柱中，洗脫下來的為淋巴細胞）

Percoll分離液法

（連續(xù)密度梯度離心，不同密度的細胞懸浮于各自不同的密度區(qū)帶）第三頁，共三十六頁，2022年，8月28日Percoll法分離單個核細胞中各細胞成分的分布示意圖第四頁，共三十六頁，2022年，8月28日E花環(huán)沉降法（T細胞與綿羊紅細胞形成E花環(huán)后用淋巴細胞分層液分離，E花環(huán)沉在管底）尼龍毛柱分離法（B細胞和單核細胞易粘附于尼龍纖維表面，將用HANKS液浸泡后的單個核細胞懸液加入充填有尼龍毛的聚乙烯塑料管內(nèi)，洗脫液中為T細胞，然后邊沖邊擠壓塑料管，洗下B細胞。

三、T、B細胞和T細胞亞群的分離第五頁，共三十六頁，2022年，8月28日第六頁，共三十六頁，2022年，8月28日第七頁，共三十六頁，2022年，8月28日大小免疫磁珠分離細胞的特點比較

比較項目大磁珠小磁珠對細胞的影響對細胞造成機械壓力，影響其生物學活性，不利于分離后培養(yǎng)。對細胞溫和，不影響分離細胞的后續(xù)培養(yǎng)。對流式細胞儀的影響阻塞流式細胞儀的噴嘴，影響散射光?？芍苯由狭魇郊毎麅x檢測，不影響散射光。分離條件要求技術(shù)簡單，分離可在試管中完成。需要很強的磁場來分離細胞。收率得率高。得率不高。純度純度低。純度高。分離時間分離速度快。分離速度慢。分離成本成本低。需要很強的磁場來分離細胞，需要一次性的分離柱，不能在普通試管進行。第八頁，共三十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)淋巴細胞表面標志的檢測及亞群分類

常用于鑒定和檢測淋巴細胞表面標志是簇分化抗（CD）。

一、T細胞表面標志及其亞群

CD3+CD4+CD8-輔助性T細胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+細胞毒性T細胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞（regulatoryTcell,TrorTreg）第九頁，共三十六頁，2022年，8月28日輔助性T細胞Th1（IL-2、IFN-γ、TNF-β

CD3+CD4+CD30-)Th2（IL-4、IL-5、IL-6或IL-10

CD3+CD4+CD30+）第十頁，共三十六頁，2022年，8月28日細胞毒性T細胞Tc1（CD3+CD8+CD30-)Tc2（CD3+CD8+CD30+）第十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日調(diào)節(jié)性T細胞CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞CD8+調(diào)節(jié)性T細胞第十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日二、B細胞表面標志

SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受體、小鼠紅細胞受體都是B細胞的重要表面標志，其中以SmIg為B細胞所特有，是鑒定B細胞可靠的指標。

成熟B細胞的mIg主要為mIgM、mIgD。CD19/CD5分子：可將B細胞區(qū)分為B1細胞和B2細胞，B1細胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細胞僅為CD19陽性，B2細胞為通常所指的B細胞。

人類NK細胞表面標志主要以CD16、CD56來認定，臨床上將CD3-CD16+CD56+淋巴細胞認定為NK細胞。三、NK細胞表面標志

第十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)抗原提呈細胞表面標志的檢測抗原提呈類細胞表面標志第四節(jié)淋巴細胞功能檢測

淋巴細胞功能測定可分為體內(nèi)實驗和體外實驗。

體內(nèi)實驗主要是進行遲發(fā)型超敏反應(yīng)，間接了解淋巴細胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng).

體外實驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產(chǎn)物的測定.第十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日淋巴細胞分類T細胞（負責細胞免疫功能）B細胞（執(zhí)行體液免疫功能）NK和K細胞（非特異性免疫作用）第十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日1.原理：淋巴細胞DNA合成分化母細胞刺激物細胞變大細胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松（一）T淋巴細胞增殖試驗第十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日

未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細胞的形態(tài)特征轉(zhuǎn)化的淋巴細胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞淋巴母細胞過渡型細胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無第十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.淋巴細胞轉(zhuǎn)化的刺激物非特異性刺激物：

PHA------T細胞

ConA-------T細胞

PWM-------T、B細胞

LPS-------B細胞特異性刺激物：異種抗原同種組織抗原第十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日

同位素法：PHA

淋巴細胞（54h）

DNA合成期+3H-TdR摻入

收集細胞

檢測β射線

測定細胞內(nèi)的3H-TdR3.檢測方法形態(tài)法：刺激物淋巴細胞（4-6天）母細胞化第十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日（1）形態(tài)學檢查法第二十頁，共三十六頁，2022年，8月28日方法學評價：優(yōu)點：形態(tài)學方法簡便易行，普通光學顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實驗室應(yīng)用。缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復性和準確性較差。第二十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日（2）3H-TdR摻入法優(yōu)點：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強，重復性好。缺點：但需一定設(shè)備條件，同時還存在放射性核素污染問題。（3）MTT比色法第二十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日(二)T細胞分泌功能測定

體外培養(yǎng)的T細胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細胞因子,可借助免疫學、細胞生物學及分子生物學技術(shù)分別檢測細胞因子含量、生物學活性或基因表達水平，以反映T細胞功能。

第二十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日1.原理：靶細胞抗原T細胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細胞（三）T細胞介導的細胞毒試驗第二十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日形態(tài)學方法：淋巴細胞+腫瘤細胞計數(shù)殘留腫瘤細胞同位素法：淋巴細胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細胞腫瘤細胞破壞51Cr

釋放測定γ射線2.方法意義：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力

第二十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日(四)體內(nèi)試驗特異性抗原皮膚試驗PHA皮膚試驗二、B細胞功能檢測溶血空斑試驗B細胞抗體形成功能的檢測體內(nèi)試驗第二十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.方法學：經(jīng)典溶血空斑形成試驗被動溶血空斑試驗

(一)溶血空斑試驗溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響評價免疫治療或免疫重建后機體產(chǎn)生抗體的能力。

第二十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日應(yīng)用與方法學評價：該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量。優(yōu)點：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。(二)酶聯(lián)免疫斑點法第二十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日三、NK細胞活性測定靶細胞溶解常用靶細胞:

K562細胞株(人）

YAC-1細胞株(小鼠）第二十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日形態(tài)法酶釋法熒光法同位素法化學發(fā)光法染色計數(shù)離心取上清測LDH或AKP離心取沉淀測活細胞熒光測CPM值測發(fā)光強度方法學及原理第三十頁，共三十六頁，2022年，8月28日

吞噬細胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。一、中性粒細胞功能檢測技術(shù)二、巨噬細胞功能檢測技術(shù)第五節(jié)其他免疫細胞功能檢測技術(shù)第三十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日一、中性粒細胞功能的檢測