版PKH26說明書(中文)

PKH26紅色熒光細胞連結(jié)試劑盒（一般細胞膜標志）產(chǎn)品編號：MINI26，MIDE26和PKH26GL室溫保留TECHNICALBULLETIN產(chǎn)品說明PKH26熒光細胞連結(jié)試劑盒采納擁有專利的膜標志技術(shù)，可以將帶有較長脂質(zhì)尾巴的黃色-橙色熒光染料（PKH26）聯(lián)合到細胞膜脂質(zhì)地區(qū)上。試劑盒中供給染色過程中所需的溶劑（稀釋液C），該溶劑可以可以在染色過程中，增添染料溶解度和染色效率，同時保持細胞活力。稀釋液C與哺乳動物細胞等滲，且不含去垢劑或有機溶劑，也不含生理鹽水緩和沖鹽。依據(jù)細胞種類及標志后細胞膜內(nèi)在的變化，標志后的細胞表面會由均一透亮變得有點狀突出或補丁狀。但在生理范圍內(nèi)，PKH26熒光不受pH的影響，每個細胞的熒光強度與染料標志地點沒關(guān)。PKH26熒光在黃色-橙色地區(qū)（圖一），可用來標志追蹤體內(nèi)外多種細胞。在細胞毒性分析，熒光蛋白、抗體或DNA染料在該地區(qū)發(fā)出的紫色、綠色、紅色和遠紅外等，不會與PKH26產(chǎn)生攪亂。PKH26最常被用于鑒于染料稀釋增殖的分析的染料稀釋應用，包含成立抗原特異性前體frequecies和正?；蚰[瘤組織中靜止或遲緩干細胞或祖細胞的判斷。同時PKH26也可用于監(jiān)測外來病毒、血小板和其余納米顆粒的攝??；干細胞分裂過程中膜的分派；細胞-細胞之間膜的轉(zhuǎn)移；細胞吞噬作用；抗原呈遞；粘附；經(jīng)過空隙連結(jié)的信號傳達；以及組織切片中的神經(jīng)元遷徙。因為其熒光堅固性較強，PKH26被用于體內(nèi)細胞追蹤研究，特別是在標志的細胞的研究周期超出一周時。

圖1.PKH26激發(fā)和發(fā)射光譜試劑構(gòu)成PKH26染料*稀釋液C（P9691）（G8278）MINI261×0.1mL1×10mLMIDI262×0.1mL6×10mLPKH26GL1×0.5mL6×10mL-3（溶于乙醇）*1×10MMINI26試劑盒介紹用于小的或初步試驗研究，PKH26GL用于體內(nèi)實驗研究所需設施和試劑（試劑盒未供給）·充分分其余單個懸浮細胞·含血清的組織培育基（圓滿培育基）·無Ca2+，Mg2+和血清的培育基或許緩沖鹽（如Dulbecco’sPBS或Hank’sBSS）·血清，白蛋白或其余組織兼容性蛋白·離心管（4-15mL）·溫控離心計（1,000×g）·熒光分析設施（熒光讀板機，熒光或共聚焦顯微鏡，流式細胞儀）·層流罩·血球計數(shù)板或細胞計數(shù)器·載玻片和蓋玻片C中，不含注意事項和免責說明該產(chǎn)品僅用于科研，不用于制藥、家庭或其余用途。請依據(jù)安全數(shù)據(jù)清單中對于有害及安全操作規(guī)范操作。積蓄/堅固性PKH26乙醇溶液（貨號P9691）可室溫或冷藏保留。減少蒸發(fā)以防備染料濃度高升。保證染料乙醇溶液瓶蓋蓋緊。該染料避光保留，使用前察看能否有結(jié)晶。如出現(xiàn)結(jié)晶，37℃熱水浴加熱，此后超聲或震蕩直至溶解。稀釋液C可室溫或冷藏保留。假如冷藏保留，使用前復溫至室溫（過程，步驟A5和A6）。稀釋液C為無菌溶液，不含任何防腐劑和抗生素，其需保持無菌。不要將染料積蓄于稀釋液C中。溶于稀釋液C的工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，且配好后需立刻使用。操作過程一般細胞膜標志親脂性染料聯(lián)合到細胞膜上達成標志。染色強度是染料濃度和細胞濃度的函數(shù)，與浸透性沒關(guān)。所以，保證染料增添量可是量特別重點。過標志的細胞將會致使細胞膜圓滿性缺失和reducedcellrecovery。以下過程可用于體內(nèi)體外細胞的標志，包含干細胞、淋巴細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞或許任何其余細胞。體內(nèi)細胞的標志過程需必定的改良，如血小板的染色，或許選擇性標志吞噬細胞。Generalcellmembranelabelingshouldbeperformedpriortomonoclonalantibodystaining.Themembranedyeswillremainstableduringthemonoclonalstainingat4；however,cappingofthemonoclonalantibodiesishighlyprobableifthegeneralcellmembranelabelingiscarriedoutatambienttemperaturesubsequenttoantibodylabeling.下述染色過程中細胞濃度和染料濃度代

表操作的初步濃度。該濃度被證明合用于多種細胞。使用者需經(jīng)過評估染色后細胞活率（如，PI染色）、熒光強度、染色均勻度及能否對所研究細胞功能有影響等，依據(jù)實驗目的，確立最優(yōu)的染料濃度和細胞濃度。注意1：PKH26染色過程中，不可以存在疊氮化物或代謝毒性物。注意2：固然貼壁細胞也可以染色，但單個懸浮細胞染色均一性更佳。所以用蛋白酶trypsin/EDTA）將貼壁細胞消化成單個懸浮細胞后再染色見效更佳。以下過程最后體積為2mL，PKH26濃度為-6，細胞濃度為7。2×10M1×10cells/mL以下過程均在室溫下進行（20-25℃）將×7個細胞于離心管中，用不含血清1.210培育基洗一遍。注意：血清蛋白和脂質(zhì)會與染料聯(lián)合，降低與細胞膜聯(lián)合的染料濃度。最幸虧用稀釋液重懸細胞染色前（第四步）用無血清培育基或緩沖液洗細胞一次（第一步）。400g×離心5分鐘。注意：PKH26染料不可以直接加到離心積淀中，這樣會造成細胞染色不均一和細胞活力降低。離心后，當心吸棄上層清液，節(jié)余上層細胞液體積不超出25μL。注意：為獲得可重復的實驗結(jié)果，在用稀釋液C重懸時，減少殘留培育基或緩沖液體積特別重要。見參照文件9的注意28。加℃入1mL稀釋液C（CatalogNumberG8278），用移液管輕輕吹打混勻，制備2×細胞懸液。不要用振蕩器震蕩，不要讓細胞在稀釋液C中保留太長時間。注意：生理鹽（physiologicsalts）的存在會使得染料結(jié)團并大幅降低染色效率。所以，需保證染色時細胞懸浮于稀釋液培育基或緩沖鹽。臨染色以前，將4μLPKH26乙醇溶液加入1mL稀釋液C中，充分混勻，配制的-6）。2×染色液（4×10M注意1：為減少乙醇對細胞活率的影響，步驟5加入的染料使得步驟6中乙醇最后濃度不可以超出1-2%。注意2：假如所需染料最后濃度＜2×10-6M，需用100%乙醇將PKH26稀釋于另一獨自的容器中，以保證明驗結(jié)果的可重復性。6.迅速將1mL2×細胞懸液（步驟4）加入1mL2×染色液（步驟5）中，立刻用移液管混勻。最后細胞濃度為1×710/mL，-6PKH26濃度為2×10M。注意：因為染色瞬時達成，迅速將細胞與染料混勻?qū)Λ@得光明、均勻和可重復的標志結(jié)果特別重要。以下舉措有助于獲得較優(yōu)的結(jié)果：a.不要將PKH26染料直接加入含2×細胞的稀釋液C中。將2×細胞懸液（步驟4）與2×染色液（步驟5）等體積混淆。調(diào)整2×細胞和2×染料的濃度防備染色體積太小（＜100μL）或太大（＞5mL）。用電動移液器迅速將細胞和染料混勻。血清移液管混勻速度太慢而使得染色不均勻。Racking和旋渦震蕩混勻相同混勻較慢，染色均一性較差。e.分派體積盡量正確，以保證樣品與樣品之間，實驗與實驗之間的可重復性。7.混勻后的染色的細胞孵育1-5min。因為染色速度較快，延伸孵育時間對實驗沒有幫助。注意：讓細胞在染色液中逗留盡量短的時間，同時保證獲得理想的染色強度。因為稀釋液C缺乏生理性鹽，過長時間的裸露在稀釋液C中會造成某些細胞活力降低。假如不可以確立其影響程度，可增添僅作稀釋的比較組和只用乙醇而不用染料染色的比較組。

1min以聯(lián)合節(jié)余的染料。注意1：血清（或等效的蛋白濃度）為最優(yōu)的停止液。假如用圓滿培育基代替，增添體積為10mL。注意2：不要經(jīng)過加稀釋液C或離心來停止反響。注意3：不要用無血清培育基或緩沖鹽，他們會使染料產(chǎn)生齊集。染料齊集使沖洗過程中沒法洗凈，使得分析過程中仍存在未標志的細胞。將細胞在20-25℃條件下400×g離心10min，當心吸棄上清。用10mL圓滿培育基重懸，將重懸液轉(zhuǎn)移至另一新的無菌離心管中，20-25℃條件下400×g離心5min。用10mL圓滿培育基再沖洗兩遍以除掉沒聯(lián)合的染料。注意1：將重懸液轉(zhuǎn)移至新離心管中，減少了離心管壁殘留的染料對沖洗效率的影響；注意2：不要用稀釋液C沖洗。最后一步?jīng)_洗后，用10mL圓滿培育基重懸細胞評估細胞回收率，細胞活率和熒光強度（圖2。離心重懸細胞至所需活細胞濃度。注意1：染色后的細胞可以用中性甲醛固定，避光條件下，熒光強度最少3周內(nèi)保持堅固。注意2：染色熒光強度一般為背景的100-1000倍。固