XXXX年本科實(shí)驗(yàn)四 重組質(zhì)粒DNA提取雙酶切鑒定

質(zhì)粒DNA的制備

限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒朱文博中山醫(yī)學(xué)院基因克隆定義：經(jīng)無性繁殖獲得基因許多相同拷貝的過程。通常是將單個(gè)基因?qū)胨拗骷?xì)胞中復(fù)制而成。

基因工程定義：實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為基因工程，又稱重組DNA技術(shù)?；蚩寺∈疽鈭D分、切接轉(zhuǎn)篩

基因載體 基因工程中常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)柯斯質(zhì)粒。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2.限制性內(nèi)切酶的酶切鑒定(P82)3.定性鑒定:DNA的瓊脂糖凝膠電泳4.定量檢測(cè)：DNA的紫外分光光度法測(cè)定(P39)1.質(zhì)粒DNA的提取與純化(P70堿法)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用

;掌握核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的原理并學(xué)會(huì)運(yùn)用內(nèi)切酶一.質(zhì)粒DNA的提取1關(guān)于質(zhì)粒的概念a.什么是質(zhì)粒（plasmid）？b.質(zhì)粒的本質(zhì)是什么？c.質(zhì)粒有哪些構(gòu)型？c.質(zhì)粒有哪些特點(diǎn)？d.質(zhì)粒的用途有哪些？81.1質(zhì)粒的定義

質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺旋形式存在。

9(1)超螺旋DNA(supercoiledDNA,SCDNA)1.2質(zhì)粒的三種構(gòu)型10(2)開環(huán)環(huán)DNA(opencircularDNA,OCDNA)如果果兩兩條條鏈鏈中中有有一一條條的的一一處處或或多多處處斷斷裂裂，，分分子子就就能能發(fā)發(fā)生生旋旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)而而消消除除鏈鏈的的張張力力，，形形成成松松弛弛型型的的環(huán)環(huán)狀狀分分子子。。11(3)線狀狀DNA(linearDNA,LDNA):如果果兩兩條條鏈鏈均均斷斷開開，，即即為為線線狀狀DNA。電泳泳時(shí)時(shí)，，三三者者泳泳動(dòng)動(dòng)速速度度大大小小關(guān)關(guān)系系（（？？？？？？））12最快快中最慢慢1.3質(zhì)粒粒DNA的基基本本特特征征：：(1)自主主復(fù)復(fù)制制性性：能能獨(dú)獨(dú)立立于于染染色色體體DNA外自自主主復(fù)復(fù)制制；；(2)可擴(kuò)擴(kuò)增增性性：嚴(yán)嚴(yán)緊緊型型復(fù)復(fù)制制-復(fù)制制1-5個(gè)拷拷貝貝松弛弛型型復(fù)復(fù)制制-復(fù)制制數(shù)數(shù)十十個(gè)個(gè)拷拷貝貝；；(3)可轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移性性：通通過過細(xì)細(xì)菌菌結(jié)結(jié)合合作作用用從從一一個(gè)個(gè)宿宿主主細(xì)細(xì)胞胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移到到另另一一個(gè)個(gè)宿宿主主細(xì)細(xì)胞胞；；(4)不相相容容性性：具具有有相相似似復(fù)復(fù)制制子子結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)特特征征的的兩兩種種不不同同質(zhì)質(zhì)粒粒不不能能穩(wěn)穩(wěn)定定地地存存在在于于同同一一受受體體細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)。。141.4理想想的的克克隆隆載載體體：：(1)分子子質(zhì)質(zhì)量量小小、、多多拷拷貝貝、、松松弛弛控控制制型型；(2)具有有多多種種常常用用的的限限制制酶酶的的單單切切點(diǎn)點(diǎn)；(3)能插插入入較較大大的的外外源源DNA片段段；(4)具有有容容易易操操作作的的檢檢測(cè)測(cè)表表型型。15151.4提取取質(zhì)質(zhì)粒粒DNA的目目的的與與意意義義：：基因因載載體體/基因因克克隆隆/基因因工工程程2.1提取取質(zhì)質(zhì)粒粒DNA的常常規(guī)規(guī)方方法法(1)SDS堿裂裂解解法法(2)煮沸沸法法(3)highpureplasmidisolationkit等。。但原原理理相相似似，，都都是是利利用用宿宿主主染色色體體DNA和質(zhì)質(zhì)粒粒DNA的差異來分離的的：★宿宿主菌染染色體DNA通常比質(zhì)質(zhì)粒DNA要大得多多★純純化分離離的宿主主菌DNA多為線性性分子，，而質(zhì)粒粒DNA呈閉合環(huán)環(huán)的形式式。2提取大腸腸桿菌質(zhì)質(zhì)粒DNA的

方法法和原則則2.2分離純化化質(zhì)粒DNA的主要步步驟(1)培養(yǎng)細(xì)菌菌使質(zhì)粒粒擴(kuò)增（（DNA的擴(kuò)增與與選擇））(2)細(xì)菌的收收集與裂裂解收集方法法：高速速離心的的方法裂解細(xì)菌菌方法：：去污劑劑法、有有機(jī)溶劑劑法、堿變性法法、沸水熱裂法、、溶菌酶酶法、超超聲處理理法等。。根據(jù)質(zhì)粒粒的大小小、宿主主菌菌株株及裂解解后的純化方法法等因素素綜合后后加以選選擇。(3)質(zhì)粒DNA的純化常用的方方法有：：超速離離心、層層析法、、聚乙二二醇沉淀淀法等所有純化化方法都都是利用用了質(zhì)粒粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)價(jià)閉合環(huán)環(huán)狀的性性質(zhì)。2.3核酸分離離純化的的總原則則：(1)保證核酸酸一級(jí)結(jié)結(jié)構(gòu)完整整(2)排除其他他分子的的污染（（蛋白質(zhì)質(zhì)、脂類類、糖、有機(jī)溶劑劑、金屬屬離子、、其他DNA、RNA等）3.SDS-堿裂解法法提取Puc119-U6重組質(zhì)粒粒DNA3.1實(shí)驗(yàn)原理理：高堿細(xì)菌的細(xì)細(xì)胞壁破破裂，內(nèi)內(nèi)容物釋釋放①染色體體DNA斷裂成不不同長(zhǎng)度度的線性性雙鏈DNA；②線性雙雙鏈DNA片段中的的氫鍵斷斷裂，雙雙鏈解離離變性。。①質(zhì)粒DNA不發(fā)生斷斷裂，保保持雙鏈鏈閉合環(huán)環(huán)狀；②雙鏈DNA并不完全全分離。。高酸中和至中性變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中純化RNA酶消化除除去RNA，并用酚酚抽提法法除去殘殘留的蛋蛋白質(zhì)3.2主要試劑劑及作用用溶液Ⅰ：：由葡萄萄糖、EDTA、Tris?HCl組成.(保護(hù)、緩緩沖)①葡萄糖的作用是是增加溶溶液的粘粘度,減減少抽提提過程中中的機(jī)機(jī)械剪切作用用,防止止破壞質(zhì)質(zhì)粒.(保護(hù)作用用)②EDTA的作用是是絡(luò)合掉掉鎂等二二價(jià)金屬屬離子,防止止DNA酶對(duì)質(zhì)粒粒分子的的降解作作用。（（保護(hù)作作用）③Tris?HCl能使溶菌菌液維持持溶菌作作用的最最適PH范圍（緩緩沖作用用）21溶液II：由SDS（（十二烷基基硫酸鈉鈉）與NaOH組成(裂解、變變性)①SDS的作用是是解聚核核蛋白并并與蛋白白質(zhì)分子子結(jié)合使使之變性（裂裂解細(xì)胞胞和蛋白白質(zhì)變性性作用））②NaOH（PH>12）的作用用是破壞壞氫鍵，，使DNA分子變性性（DNA變性作用用）22溶液III：：HAC(乙酸)和KAC(乙酸鉀)組成的高高鹽溶液液(復(fù)性，分分離)①HAC溶液能中和溶溶液Ⅱ的的堿性，，使染色色體DNA變性而發(fā)發(fā)生纏繞繞，并使使質(zhì)粒DNA復(fù)性。②KAC會(huì)與SDS形成溶解解度很低低的鹽，，并與蛋蛋白質(zhì)形形成沉淀而除除去；溶溶液中的的DNA也會(huì)與蛋蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏纏繞成大大分子而而與小分分子質(zhì)粒粒DNA分離。3.3實(shí)

驗(yàn)步步驟加1.4ml培養(yǎng)物于于EP管，12000rpm×1min，去上清清，再加1.4ml培養(yǎng)物至至原管，，12000rpm×1min，去上清清加入冰的的200μμl溶液I，劇烈振蕩蕩EP管，室溫溫放置3min加入200μμl溶液II，快速顛顛倒數(shù)次次，冰浴浴3min（不要振振蕩?。┘尤?50μμl冰溶液III，溫和振振蕩10s，冰浴5min，12000rpm×5min轉(zhuǎn)移上清清500μμl到新EP管，加入入等體積積500μμl的酚與氯仿/異戊醇的的混合物物（1:1混合），充分顛顛倒混勻勻，4℃12000rpm××5min400μl上層水相相轉(zhuǎn)移到到新的EP管，加入等體體積400μμl氯仿/異戊醇，顛倒混混勻，4℃12000rpm5min400μl上層水相相轉(zhuǎn)移到到新的EP管，加入2倍體積800μμl無水乙醇醇，顛倒混混勻，-20℃℃冰箱中放放置15min，4℃12000rpm10min棄上清，，沉淀中中加1ml70%乙醇，4℃12000rpm××5min去上清，，管平放放室溫靜靜置5-10min，20μμlTE溶解DNA注意事項(xiàng)項(xiàng)：1、加樣樣槍正確確使用；；2、標(biāo)記記自己所所提取的的質(zhì)粒類類型；3、廢液液倒在水水池中，，槍頭扔扔到垃圾圾桶中；；4、加不不同溶液液要換槍槍頭；5、離心心前把管管擦干；；6、轉(zhuǎn)移移上清時(shí)時(shí)不要吸吸到沉淀淀；7、吸取取酚時(shí)槍槍頭伸到到下層溶溶液中，，注意不不要沾到到皮膚；8、每人最終終得到20ul質(zhì)粒DNA，其中10ul用于酶切和電泳泳，其余余DNA儲(chǔ)存于-20℃℃用于電泳泳對(duì)照！二、限制制性內(nèi)切切酶切割割重組質(zhì)質(zhì)粒1關(guān)于限制制性核酸酸內(nèi)切酶酶（（restrictionendonuclease）1.1定義能在特特異位位點(diǎn)（（酶切切位點(diǎn)點(diǎn)）上上催化化雙鏈鏈DNA分子的的斷裂裂,產(chǎn)生相相應(yīng)的的限制制性DNA片段。。主要存存在于于細(xì)菌菌體內(nèi)內(nèi)。切割不不同來來源的的DNA分子將將產(chǎn)生生特征征性限限制性性酶切切圖譜譜，具具有重重大應(yīng)應(yīng)用價(jià)價(jià)值（（“分子手手術(shù)刀刀”）。261.3作用與甲基基化酶酶共同同構(gòu)成成細(xì)菌菌的限限制修修飾系系統(tǒng)，，限制制外源源DNA，保護(hù)自自身DNA。1.2分類Ⅰ、ⅡⅡ、ⅢⅢ（基因因工程程技術(shù)術(shù)中常常用ⅡⅡ型））第一個(gè)個(gè)字母母取自自產(chǎn)生生該酶酶的細(xì)細(xì)菌屬屬名，，用大大寫；；第二、、第三三個(gè)字字母是是該細(xì)細(xì)菌的的種名名，用用小寫寫；第四個(gè)個(gè)字母母代表表株；；用羅馬馬數(shù)字字表示示發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的先先后次次序。。1.4命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜嗜血桿桿菌d株的第第三種種酶2BamHI、HindⅢⅢ酶切質(zhì)質(zhì)粒及及鑒定定2.1實(shí)驗(yàn)原原理：：利用限限制性性內(nèi)切切酶特特異的的識(shí)別別DNA特異的的核苷苷酸序序列，，并切切割DNA,產(chǎn)生一一定長(zhǎng)長(zhǎng)度的的DNA片段，，通過過電泳泳對(duì)酶酶切前前后產(chǎn)產(chǎn)物分分析可可以鑒鑒別目目的基基因（（重組組質(zhì)