DNA提取原理和方法

會計學(xué)1DNA提取原理和方法極性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，鈉鹽比游離核酸易溶于水。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。核酸的理化性質(zhì)第1頁/共31頁提取DNA總的原則:

1保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；2其他生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；3核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；4其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。第2頁/共31頁DNA提取的幾種方法基因組DNA的提取

非基因組DNA的提取

質(zhì)粒DNA的提取斷裂成為線狀共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)第3頁/共31頁基因組DNA的提取細(xì)胞破碎方法應(yīng)用Ⅰ機(jī)械法1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母Ⅱ物理法1超聲法細(xì)胞混懸液2反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3冷熱交替法細(xì)菌、病毒4低滲裂解紅細(xì)胞Ⅲ化學(xué)法1有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞3酶解法細(xì)菌、酵母根據(jù)裂解方式的不同有：第4頁/共31頁

吸附材料結(jié)合法：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：

硅質(zhì)材料

陰離子交換樹脂磁珠

高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。快捷高效。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的?；蚪MDNA的提取第5頁/共31頁

濃鹽法：

有機(jī)溶劑抽提法：

密度梯度離心法：

利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物基因組DNA的提取第6頁/共31頁SDS法流程圖

（以動物組織為例）

動物組織細(xì)胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－SDS法第7頁/共31頁Approximately~1cmoftailiscutandputintoanmicrofugetube;Add0.5mltailsolutionand25mlProteinaseK,mixwellandincubateat55oCovernightoruntiltissueisdissolved;

MoreProteinaseKmaybeaddedifdigestionisnotcompleteafter24hr;Add0.5mlPhenol/Chloroformandvortexattopspeedfor15minatRT;Spinat13,000rpmfor30minatRT;Transferthetopaqueousphasetoafreshmicrofugetube;Add0.5mlChloroformandvortexattopspeedfor5minatRT;Spinat13,000rpmfor5minatRT;Transferthetopaqueousphasetoafreshmicrofugetube,add50ml3MNaOAc(pH=6.0)and0.5ml100%ethanol,invertseveraltimes;

ANaOAcsolutionwithpHlowerthan6.0willcausetheEDTAtoprecipitate;Spinat13,000rpmfor5minatRT;Ifthereisnopellet,placesamplesin-80oCfor10minandspinat13,000rpmfor25minat4oC;Washpelletoncewith70%ethanol,airdry;ResuspendDNAinddH2O.Use~100-200mlddH2Otogetfinalconcentrationas100ng/mlforPCR.Phenol-chloroformextractionofmousetail

DNA第8頁/共31頁1.SDS：十二烷基硫酸鈉2.Tris：緩沖液3.EDTA

2.Add0.5mltailsolutionand25mlProteinaseK,mixwellandincubateat55oCovernightoruntiltissueisdissolved;作用：細(xì)胞裂解時PH值也能穩(wěn)定作用：a.溶解細(xì)胞膜、核膜上脂質(zhì)成分

b.使蛋白質(zhì)變性

作用：是二價金屬螯合劑，抑制核酸酶；降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。Tailsolution:第9頁/共31頁3.MoreProteinaseKmaybeaddedifdigestionisnotcompleteafter24hr;ProteinaseK:作用：廣譜蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白質(zhì)，將DNA游離。第10頁/共31頁4.Add0.5mlPhenol/Chloroformandvortexattopspeedfor15minatRT;5.Spinat13,000rpmfor30minatRT;優(yōu)點：1.有效變性蛋白質(zhì)；2.抑制了DNase的降解作用。缺點：能溶解10-15%的水，從而溶解一部分DNAPhenol：Chloroform：1.加速有機(jī)相與液相分層。2.去除DNA水溶液中殘留的微量酚。減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。Isoamylalcohol：第11頁/共31頁

7.Transferthetopaqueousphasetoafreshmicrofugetube;8.Add0.5mlChloroformandvortexattopspeedforminatRT;9.Spinat13,000rpmfor5minatRT;

經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。Chloroform：第12頁/共31頁10.Transferthetopaqueousphasetoafreshmicrofugetube,add50ml3MNaOAc(pH=6.0)and0.5ml100%ethanol,invertseveraltimes;11.Spinat13,000rpmfor5minatRT;NaOAc(pH=6.0):1.沉淀核酸，縮短乙醇沉淀的時間2.提供單價陽離子。減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，

100%ethanol任意比和水相混溶，奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。但是加其他比例的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。第13頁/共31頁12.

Ifthereisnopellet,placesamplesin-80oCfor10minandspinat13,000rpmfor25minat4oC;13.Washpelletoncewith70%ethanol,airdry;14.ResuspendDNAinddH2O.DNA則多以弱堿性的Tris或者TE溶解。2.基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。

DNA的保存：第14頁/共31頁非基因組DNA的提取堿裂解法密度梯度離心法煮沸法

質(zhì)粒DNA的提取第15頁/共31頁1、培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增---對數(shù)生長后期2、收集和裂解細(xì)菌3、質(zhì)粒DNA的純化質(zhì)粒DNA的提取--堿裂解法第16頁/共31頁1、培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增---對數(shù)生長后期

在含有相應(yīng)抗性的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)菌(單克隆)，使細(xì)菌快速增殖的同時質(zhì)粒DNA得到大量擴(kuò)增。37oC振蕩過夜

質(zhì)粒DNA的提取--堿裂解法第17頁/共31頁2、收集和裂解細(xì)菌

非離子型/離子型去污劑

裂解有機(jī)溶劑/堿

加熱

質(zhì)粒DNA的提取--堿裂解法第18頁/共31頁3、質(zhì)粒DNA的純化

---CsCl-溴化乙錠梯度密度離心

取決于線狀DNA與閉環(huán)DNA與溴化乙錠結(jié)合的量

質(zhì)粒DNA的提取--堿裂解法第19頁/共31頁原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。

質(zhì)粒DNA的提取--堿裂解法第20頁/共31頁離心洗滌對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液

質(zhì)粒DNA的提取--堿裂解法第21頁/共31頁SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液的成分及作用

溶液ⅠResuspensionBuffer

成分：50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0

葡萄糖:

增稠。維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械切力作用降解。

EDTA:

二價金屬離子的螯合劑，抑制DNase的活性。有利于溶菌酶的作用。

這一步溶液中還可以加入RNase

溶菌酶：糖苷水解酶。當(dāng)溶液中PH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。

第22頁/共31頁溶液ⅡLysisBuffer

成分：0.2MNaOH/1%SDS

NaOH：溶解細(xì)胞，DNA變性

SDS：

(1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。(2)解聚細(xì)胞中的核蛋白。(3)SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。

SDS與NaOH聯(lián)用：增強NaOH的強堿性

SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液的成分及作用

第23頁/共31頁SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液的成分及作用

溶液ⅢNeutralizationBuffer

成分：3MKAc

/2MHAc

KAc:K+置換了SDS中的Na+，得到PDS沉淀

HAc:中和NaOH,使DNA復(fù)性

第24頁/共31頁吸附柱SpinColumnwithCollectionTubes結(jié)構(gòu)：特殊硅基質(zhì)吸附材料，特異性吸附DNA，而RNA與蛋白質(zhì)穿過。高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。

第25頁/共31頁大提&小提

區(qū)別：

1.大提可以用于大量菌液的提取，100ml-500ml均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。

2.一般試劑盒中大提