埃博拉病毒生物學(xué)特性及其防治進(jìn)展,預(yù)防醫(yī)學(xué)論文

埃博拉病毒生物學(xué)特性及其防治進(jìn)展,預(yù)防醫(yī)學(xué)論文埃博拉病毒感染導(dǎo)致的病毒性出血熱具有極高的致死率。人感染埃博拉病毒后，主要臨床表現(xiàn)為急性發(fā)熱、肌肉酸痛、頭痛、嘔吐，有出血趨勢和皮膚丘疹、胃腸道呼吸道和器官瘀血出血。固然是一種致命病毒，但埃博拉病毒較為罕見，僅在西非地區(qū)流行爆發(fā)，因此并未像研發(fā)艾滋病藥物和疫苗一樣存在迫切壓力。另外，埃博拉疫情的爆發(fā)時(shí)間不規(guī)律，沒有特定的季節(jié)性，無法預(yù)知和防備?？共《舅幬锘蛞呙绲难邪l(fā)需要投入宏大的人力、物力、資金和時(shí)間，因而，針對埃博拉病毒藥物的研發(fā)速度較慢，當(dāng)前尚未研制出有效的抗埃博拉病毒的藥物和疫苗。1埃博拉病毒的流行大概情況埃博拉病毒可分為5種亞型：扎伊爾型〔zaireebolavirus,ZEBOV〕；科特迪瓦型〔cotedivoireebolavirus,CEBOV，也稱塔伊森林埃博拉病毒，taforestebolavirus,TAFV〕〕；蘇丹型〔sudanebolavirus,SUDV/SEBOV〕；雷斯頓型〔restonEbolavirus,REBOV〕和本迪布焦型〔bundibugyoebolavirus,BEBOV〕。五種亞型毒力各不一樣，華而不實(shí)，扎伊爾型毒力最強(qiáng)，人感染后致死率高達(dá)90%；蘇丹型次之，致死率約為50%；科瓦迪特型對人的毒力較弱，而雷斯頓型埃博拉病毒對人不致病，對人以外的靈長類動(dòng)物有致死性，僅在菲律賓和美國有過猴子感染的報(bào)道。埃博拉病毒最早于1976年在非洲中部的扎伊爾和蘇丹幾乎同時(shí)爆發(fā)。盡管分離的病原體都屬埃博拉病毒，但不完全一樣，根據(jù)首發(fā)地點(diǎn)不同分別命名為為蘇丹型和扎伊爾型，華而不實(shí)扎伊爾行病毒共感染318人，284人死亡，致死率高達(dá)89%。1979年7~10月，蘇丹型埃博拉病毒再次出現(xiàn)，隨后沉寂于非洲叢林，直至1994年6月，1名瑞士女獸醫(yī)在科特迪瓦因解剖死亡的黑猩猩而感染了埃博拉病毒，在之后的3年里，埃博拉病毒再次肆虐非洲。2000~2004年，在剛果、加蓬、烏干達(dá)等地屢次爆發(fā)埃博拉病毒疫情，主要為扎伊爾型和蘇丹型埃博拉病毒。在埃博拉病毒發(fā)現(xiàn)的30多年里，共爆發(fā)24次埃博拉病毒疫情，綜合死亡率約為67%。2020年3月24日，世界衛(wèi)生組織發(fā)表聲明，一場新的埃博拉病毒疫情在幾內(nèi)亞爆發(fā),截至2020年8月28日，共報(bào)告埃博拉病毒病3069例，死亡1552人，死亡率達(dá)52%。病毒疫情的爆發(fā)不斷加速，40%的感染病例是在過去的21d報(bào)告的。2埃博拉病毒生物學(xué)特性埃博拉病毒主要通過與病毒攜帶者的血液、體液及污染物接觸傳播，尚無證據(jù)表示清楚空氣能夠傳播該病毒。通過對黑猩猩和猴子等靈長類動(dòng)物以及蝙蝠體內(nèi)病毒的研究，大致上可判定出果蝠為其自然條件下的儲存庫，但需要進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。病毒的構(gòu)造特征及致病機(jī)制見文獻(xiàn)。3埃博拉病毒的防治進(jìn)展3.1埃博拉病毒疫苗傳統(tǒng)的疫苗來源于經(jīng)高溫、福爾馬林及-射線滅活的病毒，這類滅活病毒的埃博拉病毒疫苗在嚙齒類動(dòng)物和靈長類動(dòng)物中沒有明顯保衛(wèi)作用。當(dāng)前，大量的病毒或非病毒載體被用于埃博拉病毒疫苗的構(gòu)建，如DNA質(zhì)粒、具有復(fù)制或缺乏復(fù)制功能的活病毒載體等。帶有埃博拉病毒抗原基因的疫苗在接種者體內(nèi)表示出大量的病毒抗原蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，進(jìn)而預(yù)防病毒感染。3.1.1DNA疫苗將經(jīng)過挑選的埃博拉病毒基因如GP、NP等連接到DNA質(zhì)粒載體中，構(gòu)成表示出病毒蛋白的質(zhì)粒，用注射器、基因槍或電穿孔等方式將重組DNA質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射輸入患者體內(nèi)，輸入的重組DNA在患者細(xì)胞中表示出相應(yīng)抗原，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反響，產(chǎn)生抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞去去除病毒的感染。這種DNA疫苗制作工藝簡單，經(jīng)濟(jì)且易于存儲，同時(shí)不會誘發(fā)針對載體的免疫反響，但在體實(shí)驗(yàn)表示清楚，埃博拉病毒感染后的靈長類動(dòng)物注射此類疫苗后再接種埃博拉病毒，存活率沒有明顯提高。3.1.2活載體疫苗活載體疫苗為將編碼病毒蛋白的基因插入無致病性或減毒活病毒載體中構(gòu)成的疫苗。此類疫苗主要有重組水泡性口炎病毒疫苗，重組副流感病毒疫苗和重組腺病毒。華而不實(shí)重組5型血清型腺病毒〔rAD5〕為首個(gè)對感染埃博拉病毒的非靈長類動(dòng)物有保衛(wèi)作用的疫苗。用活病毒為載體表示出EBOVGP蛋白的優(yōu)點(diǎn)是疫苗接種人體，接近于自然感染，EBOV蛋白可在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表示出，但人體血清中含有的rAD5抗體可能影響活載體疫苗的體內(nèi)效價(jià)。3.1.3DNA配合腺病毒〔DNA/Adv〕加強(qiáng)疫苗此類疫苗是繼DNA疫苗和活病毒載體疫苗后研發(fā)的又一新型疫苗，如重組5型血清型腺病毒〔rAD5〕與DNA疫苗〔SUDVGP，TAFVGP〕重組疫苗。首先向動(dòng)物體內(nèi)接種DNA疫苗使機(jī)體產(chǎn)生免疫反響，隨后用腺病毒載體疫苗加強(qiáng)免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠抗體效價(jià)較單用DNA疫苗增長10~100倍。在恒河猴中進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)，結(jié)果顯示，接種疫苗的猴子體內(nèi)針對GP蛋白的特異性抗體及抗原特異性CD4+和CD8T+細(xì)胞水平明顯升高，接種疫苗的4只猴子在感染埃博拉病毒2周內(nèi)均存活，而接種安心撫慰劑的4只猴子死亡。此疫苗當(dāng)前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。3.2抗病毒藥物的研究3.2.1抑制病毒進(jìn)入的活性化合物病毒的細(xì)胞進(jìn)入階段是病毒復(fù)制周期中的重要時(shí)期，在病毒感染的早期抑制病毒的進(jìn)入能夠減少病毒感染的幾率，同時(shí)可以降低藥物耐藥性的發(fā)生。因而，病毒的進(jìn)入階段成為挑選抗病毒藥物的重要靶點(diǎn)。當(dāng)前，病毒進(jìn)入抑制劑的研究主要有：〔1〕靶向病毒包膜蛋白的進(jìn)入抑制劑。病毒的包膜蛋白GP與病毒進(jìn)入細(xì)胞密切相關(guān)。采用表示出埃博拉病毒包膜蛋白構(gòu)建的重組EBOV-GP假病毒體系，可高通量挑選抗病毒化合物庫，發(fā)現(xiàn)新的小分子埃博拉病毒進(jìn)入抑制劑。苯二氮雜卓類衍生物〔化合物1，圖1〕對表示出GP蛋白的HIV重組假病毒的感染具有抑制作用?！緢D略】計(jì)算機(jī)輔助分子模擬技術(shù)表示清楚，化合物1通過與GP1及GP2蛋白連接處的疏水域結(jié)合，進(jìn)而阻止了病毒的進(jìn)入。Miller等發(fā)現(xiàn)，將來源于埃博拉病毒GP2蛋白的C-多肽與HIV的反式轉(zhuǎn)錄激活因子Ta〔t細(xì)胞浸透促進(jìn)劑〕共價(jià)結(jié)合得到的產(chǎn)物Tat-Ebo，較未經(jīng)Tat修飾的C-多肽具有更好的抑制病毒進(jìn)入的活性，這可能與其通過Tat的作用穿過細(xì)胞膜在胞內(nèi)體中構(gòu)成較高的藥物濃度有關(guān)；〔2〕靶向宿主細(xì)胞蛋白的進(jìn)入抑制劑。與病毒互相作用的宿主細(xì)胞膜蛋白也成為進(jìn)入抑制劑藥物的重要靶點(diǎn)。NPC1蛋白〔Niemann-PickC1〕是位于多種胞內(nèi)體和溶酶體膜外表的膽固醇轉(zhuǎn)移蛋白，被以為是埃博拉病毒的特異性受體。人類尼曼-匹克病就是由于NPC1蛋白基因發(fā)生突變引起的嚴(yán)重神經(jīng)退行性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，尼曼-匹克病人來源的神經(jīng)母細(xì)胞能夠抵抗埃博拉病毒的感染。膽固醇合成抑制劑U1866A，抗抑郁藥丙咪嗪同樣能夠抑制埃博拉病毒的感染。經(jīng)高通量挑選得到的芐基哌嗪金剛烷胺乙酰胺類化合物〔化合物2、3，圖1〕通過與位于胞內(nèi)體外表的膽固醇轉(zhuǎn)移蛋白NPC1作用，抑制病毒的進(jìn)入。雌激素受體調(diào)節(jié)劑克羅米芬、托瑞米芬、他莫昔芬等可以抑制埃博拉病毒進(jìn)入細(xì)胞，其作用機(jī)制可能與NPC1蛋白相關(guān)。組織蛋白酶抑制劑E64和CA074都有抑制埃博拉病毒感染的作用，盡管此類化合物對其他病毒也有抑制作用。囊泡膜蛋白相關(guān)蛋白A〔VAPA〕和氧甾酮結(jié)合蛋白互相作用能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的體內(nèi)平衡，是很多病毒感染細(xì)胞所需要的，Amini-Bavil-Olyaee等人發(fā)現(xiàn)，干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白-3〔IFITM3〕能夠與VAPA結(jié)合，阻止VAPA與氧甾酮結(jié)合蛋白互相作用，進(jìn)而阻止病毒進(jìn)入。胺碘酮、腎上腺素受體沖動(dòng)劑決奈達(dá)隆，以及L-型鈣離子通道抑制劑維拉帕米，均能夠抑制埃博拉病毒進(jìn)入細(xì)胞，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。3.2.2抑制病毒復(fù)制的活性化合物Geisbert等用與病毒基因組序列互補(bǔ)的反式寡核苷酸〔siRNA〕干擾病毒基因組復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的方式方法，合成并挑選得到了分別靶向埃博拉病毒基因RNA多聚酶L、VP24及VP35基因的siRNA，即EK-1，VP-24-1160及VP-35-855，并將這三中siRNAs裝配到穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)體〔SNALPs〕中，稱為TKM-Ebola。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，TKM-Ebola能夠抑制靈長類動(dòng)物感染埃博拉病毒，但在人體中的藥效學(xué)及藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)與毒性還需進(jìn)一步研究。第三代合成的反式寡核苷酸磷酰嗎啉寡聚體PMOs〔AVI-6002，AVI-6003〕能夠抑制絲狀病毒的復(fù)制，這類化合物通過空間位阻效應(yīng)干擾病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而影響病毒的復(fù)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表示清楚，感染了埃博拉病毒的恒河猴在給予特異性靶向EBOV核蛋白VP24和VP35的AVI-6002后，存活率明顯提高，且藥物抑制了病毒感染引起的炎癥因子的大量釋放，當(dāng)前此類藥物已進(jìn)入I期臨床階段。通過高通量挑選得到的抑制埃博拉病毒復(fù)制的化合物還有FGI-103，F(xiàn)GI-104和FGI-106〔圖1〕，這些化合物的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。3.3單克隆抗體治療Pettitt等研究發(fā)現(xiàn)，將修飾后的抗體基因?qū)胫袊鴤}鼠卵巢細(xì)胞〔CHO〕或者本氏煙草細(xì)胞中得到的3種單克隆抗體13C6，h-13F6和6D8混合物MB-003，對于埃博拉病毒感染的靈長類動(dòng)物有保衛(wèi)作用。實(shí)驗(yàn)者對感染1~2d的靈長類動(dòng)物給予MB-003單克隆抗體雞尾酒療法，其治病率和死亡率明顯降低。當(dāng)前，這種抗體雞尾酒療法為埃博拉病毒的治療帶來了希望，可能成為當(dāng)前對抗埃博拉病毒最為有效的方式方法。單克隆抗體的植物生產(chǎn)也獲得突破，Huang等建立了一種多復(fù)制子單載體的表示出系統(tǒng)，可在煙草中大量表示出靶向埃博拉病毒GP蛋白的單抗6D8，1g新鮮煙葉葉片4d表示出量到達(dá)0.5mg單抗。4結(jié)論與瞻望迄今為止沒有FDA許可的疫苗和藥物來預(yù)防和治療埃博拉病毒，發(fā)現(xiàn)新的抗病毒藥物和疫苗對埃博拉病毒的疫情控制至關(guān)重要。當(dāng)前已開發(fā)出多種能夠保衛(wèi)靈長類動(dòng)物針對埃博拉病毒的致死性感染的疫苗，部分疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。由于埃博拉病毒抗原表位的多樣性及疫情爆發(fā)的不可預(yù)測性，開發(fā)能夠預(yù)防多種埃博拉病毒亞型的多價(jià)疫苗可能能夠更好防止疫情的發(fā)生。相比于疫苗生產(chǎn)周期長、價(jià)格高、活性不穩(wěn)定及病毒抗原的多樣性等缺點(diǎn)，小分子藥物有其生產(chǎn)迅速、性質(zhì)穩(wěn)定等獨(dú)特優(yōu)勢。由于埃博拉病毒的高致病性和致死率，其研究只能在生物安全級別最高的實(shí)驗(yàn)室BSL-4級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，具備這種安全防護(hù)措施的實(shí)驗(yàn)室在全球范圍內(nèi)數(shù)量有限，進(jìn)而限制了抗病毒小分子藥物的開發(fā)與研究。隨著高通量挑選體系的迅速發(fā)展，利用VSV、MLV及HIV等病毒的復(fù)制機(jī)制，構(gòu)建的包裹埃博拉病毒包膜蛋白GP的有復(fù)制缺陷的假病毒篩藥模型，使抗病毒小分子化合物的快速挑選得以在生物安全2級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，這大大促進(jìn)了抗病毒小分子藥物研究的發(fā)展。同時(shí)，利用RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)的具有抗病毒作用的siRNAs為抗病毒藥物研發(fā)開拓了新的道路。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體藥物為病毒的防治帶來了新的希望，和傳統(tǒng)的從血清來源的抗體相比擬，利用基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)獲得的CHO細(xì)胞、煙草細(xì)胞培養(yǎng)來源的抗體更為經(jīng)濟(jì)，迅速，便于質(zhì)量控制和實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。2020年8月21日，據(jù)英國路透社報(bào)道，美國兩位醫(yī)生在感染了埃博拉病毒后，采用了位于圣地亞哥的馬普〔M