辣椒中常見產毒性真菌的裸磁珠-多重實時熒光定量PCR檢測方法

辣椒中常見產毒性真菌的裸磁珠-多重實時熒光定量PCR檢測方法金燕;張薇薇;王溯源;葉正茂;張立實;裴曉方【摘要】ObjectiveToestablishamethodfordetecting3commontoxigenicmolds(Aspergillus,Penicillium,andFusarium)basedonnon-modifiedmagneticbeadscoupledwithmultiplereal-timePCR(NMB-multipleqPCR).MethodsTheprimersandgenus-specificprobesweredesignedbasedontherDNAsequencestodevelopamultiplereal-timePCRusingnon-modifiedmagneticbeadtoenrichmentoffungalspores.Thesensitivity,specificityandrepeatabilityofthisassaywereevaluated.ResultsThedetectionlimitofthisassayforspikedsampleswas104CFU/g,demonstratinga10-foldgreaterdetectionsensitivityofthisassaythanthatofreal-timePCR.TheNMB-multipleqPCRassayalsoshowedgoodspecificityandreproducibilityandyieldedcomparableresultswiththosebytraditionalcolonycountingmethodforspikedsamples(P>0.05).ConclusionNMB-multipleqPCRassayweestablishedallowsrapidandsensitivedetectionofcommonmycotoxigenicfungiinpaprika.%目的：將多重實時熒光定量PCR技術與裸磁珠富集技術聯用，建立辣椒樣品中常見3類（曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬）產毒性真菌的快速定量檢測方法。方法根據真菌核糖體RNA（rDNA）基因序列選擇真菌廣譜引物及屬特異性探針，聯用裸磁珠富集技術，建立多重實時熒光定量PCR體系，并評價所建方法的靈敏度、特異性、重復性和一致性。結果裸磁珠-多重實時熒光定量PCR方法靈敏度高，與本研究優(yōu)化后的普通實時熒光定量PCR相比提高了10倍，是原報道的100倍，直接檢測辣椒樣品中3類產毒性真菌的檢出限均可達103CFU/ml，即104CFU/g，且特異性良好（與非目標菌無交叉反應）、重復性良好（CV<1.5%），該方法模擬檢37h（7~14d）。結論構PCR3【期刊名稱】《南方醫(yī)科大學學報》【年(卷),期】2015(000)001【總頁數】6頁(P23-28)【關鍵詞】產毒性真菌;裸磁珠富集;多重實時熒光定量PCR;辣椒模型【作者】金燕;張薇薇;王溯源;葉正茂;張立實;裴曉方【作者單位】四川大學華西公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗與檢疫學系，四川成都610041;成都醫(yī)學院公共衛(wèi)生系，四川成都610500;四川大學華西公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗與檢疫學系，四川成都610041;四川大學華西公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗與檢疫學系，四川成都610041;四川大學華西公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗與檢疫學系，四川成都610041;食品安全監(jiān)測與風險評估四川省重點實驗室，四川成都610041;四川大學華西公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗與檢疫學系，四川成都610041;食品安全監(jiān)測與風險評估四川省重點實驗室，四川成都610041【正文語種】中文常見產毒性真菌，如曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和鐮刀菌屬（Fusarium），可在適當條件下繁殖并產生有毒次級代謝產物真菌毒素，這些毒素已發(fā)現400多種，可致急、慢性中毒并存在“三致”（致癌、致畸、致突變）危害［1］。我國辣椒等香辛料受真菌及其毒素的污染情況嚴重，辣椒中真菌污染量可達103～106CFU/g，其優(yōu)勢菌主要為曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬真菌［2-5］，產生的真菌毒素如黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）、赭曲霉毒素A（ochratoxinA，OTA）和伏馬菌素（fumonisin，FB）等在香辛料中普遍存在，須對其進行及時的預防和控制，許多國家及國際組織為此制定了真菌毒素的限量標準［6-7］。然而，對于真菌毒素危害的預防不能僅針對真菌毒素本身，對于產毒性真菌的監(jiān)測也同樣重要。傳統(tǒng)真菌定量檢測方法為計數培養(yǎng)法［8］，產毒性真菌鑒定則需要進行分離鏡檢［9］，操作繁瑣費時且依賴經驗，培養(yǎng)鑒定時間長達7～14d，存在嚴重滯后性，無法對污染進行及時預警，因此迫切需要建立產毒性真菌快速定量檢測的方法。裸磁珠（non-modifiedmagneticbeads，NMB）具有在磁場中非特異性富集的特性，目前利用裸磁珠對細菌進行富集的研究已有不少［10-12］，但針對真菌進行富集的研究仍未見報道。因此本研究擬將裸磁珠與多重實時熒光定量PCR（multipleqPCR）技術聯用，利用裸磁珠富集能力提高方法檢出限，建立辣椒中常見三類產毒性真菌裸磁珠-多重實時熒光定量PCR（NMB-MultipleqPCR）的快速檢測方法，為辣椒等香辛料中常見產毒性真菌污染的監(jiān)測提供更為高效的技術方法。菌株與培養(yǎng)基本研究所使用標準菌株由廣東環(huán)凱生物技術有限公司、中國普通微生物保藏中心提供及四川大學華西公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗與檢疫學系保存，食品分離菌株由本研究前期調查獲得（表1），所用察氏、沙氏瓊脂、LB及麥康凱培養(yǎng)基購自北京陸橋技術有限責任公司。材料與儀器樣品辣椒粉購自成都市區(qū)農貿市場，真菌基因組DNA提取試劑盒購自BioFlux公司，10×ReactionBuffer、TaqDNApolymerase及pGM-T載體試劑盒購自TIANGEN公司，dNTPs購自Roche公司，引物由Invitrogen公司合成，TaqMan探針由上海生工公司合成，PCR擴增儀為S1000ThermalCycler（Bio-Rad）。方法孢子懸液至無菌試管中充分振蕩，用血細胞計數板計數［13］并用生理鹽水調節(jié)所需孢子懸液濃度。稱取滅菌辣椒粉25g，加入225ml無菌生理鹽水中均質2min，制備為辣椒均質液［8］。取1ml孢子懸液加入9ml上述均質液，混勻后制備為模擬樣品懸液。［14］，利用化學沉降法制備所需的裸磁珠［15］。將50μl濃度為100μg/μl裸磁珠加入1ml懸液中，在室溫下緩慢振蕩吸附1min。用磁分離架分離棄上清后，按真菌DNA提取試劑盒相關說明操作。提取的模板于-20℃保存?zhèn)溆?。非磁珠吸附法提取的模板僅取1ml懸液按試劑盒相關說明操作。rDNATranscribedSpacer，ITS）1ITSR）3TaqMan（ASPP，青霉PENPFUSP）［16］進行擴增（2）。MultipleqPCR體系 建立并優(yōu)化如下擴增反應體系：10×Buffer4.0μldNTP（10mmol/L）0.4μl、Mg2+（25mmol/L）2.4μl、引物及探針（10μmol/L）各0.8μl、TaqDNA聚合酶（2.5U/μl）0.8μl、模板1.0μl、ddH2O7.4μl，共20μl；反應參數為：95℃，5min；95℃，30s；65℃，1min，共50個循環(huán)，退火階段采集熒光信號。NMB-MultipleqPCR以pGM-T載體試劑盒說明制備重組質粒，分別提取鑒定后曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌107-100copies/MultipleqPCR檢測三類真菌重組質粒模板的檢出限并繪制標準曲線。分別制備含曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬孢子的模擬樣品懸液以磁珠吸附法提取模板，并10NMB-MultipleqPCR非磁珠法取的模板做為對照評價磁珠富集效果。模板的準確濃度以標準培養(yǎng)計數法確定。NMB-MultipleqPCR1-1qPCRNMB-MultipleqPCR重復性評價根據檢出限及線性范圍檢測結果，對33定，評價方法的重復性。NMB-MultipleqPCR與標準培養(yǎng)法一致性評價制備濃度為107CFU/ml曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬孢子懸液并進行混合，將該混合懸液適當稀釋加入6NMB-MultipleqPCRqPCR2.1 NMB-MultipleqPCR對鑒定后的曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬三種重組質粒梯度模板進行MultipleqPCR擴增，Ct值≤35為陽性。結果顯示，對于曲霉、青霉和鐮刀菌其檢出限分別為1.02×102copies/反應，1.04×102copies/反應和1.05×102copies/反應（圖1）。重組質粒的回歸方程分別為：曲霉屬：Y=-3.264lg（X）+38.920，R2=0.990（1.02×102～1.02×107copies/反應）青霉屬：Y=-3.602lg（X）+41.870，R2=0.992（1.04×102～1.04×107copies/反應）鐮刀菌屬：Y=-3.484lg（X）+41.150，R2=0.995（1.05×102～1.05×107copies/反應）對模擬曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬污染的辣椒樣品，進行NMB-MultipleqPCR擴增，Ct值≤35為陽性。結果顯示，對于3類產毒性真菌其檢出限分別為曲霉屬1.8×103CFU/ml，青霉屬1.6×103CFU/ml和鐮刀菌1.4×103CFU/ml，見圖2。模擬樣品的回歸方程分別為：曲霉屬：Y=-3.324lg（X）+47.102，R2=0.972（1.8×103～1.8×106CFU/ml）青霉屬：Y=-3.402lg（X）+47.607，R2=0.995（1.6×103～1.6×106CFU/ml）鐮刀菌屬：Y=-3.496lg（X）+48.519，R2=0.999（1.4×103～1.4×106CFU/ml）對非磁珠法提取的模擬污染樣品模板進行multipleqPCR擴增，Ct值≤35為陽性。結果顯示，對于3類產毒性真菌其檢出限分別為曲霉屬1.4×104CFU/ml，青霉屬1.1×104CFU/ml和鐮刀菌屬1.6×104CFU/ml，檢出限僅為NMB-MultipleqPCR方法的1/10，說明裸磁珠對于懸液中的真菌具有富集作用，能提高MultipleqPCR方法檢測靈敏度（圖3）。NMB-MultipleqPCR根據表1-1中的菌株信息，對6種細菌27種真菌進行多重實時熒光擴增，Ct值≤35為陽性。結果顯示，所選引物、曲霉屬探針ASPP、青霉屬探針PENP及鐮刀菌屬探針FUSP特異性良好，與非目標菌不存在交叉反應（圖4）。NMB-MultipleqPCR根據方法檢出限的檢測結果，分別對不同濃度（103、104、106CFU/ml）的曲霉、3：3NMB-MultipleqPCR檢測的變異系數均小于1.5%，在允許誤差范圍內。說明該方法對高、中、低不同濃度的模板均具有較好的重復性（3）。NMB-MultipleqPCR對三類產毒真菌混合污染的6份模擬辣椒樣品同時進行NMB-MultipleqPCR以及標準培養(yǎng)計數法的檢測。將標準培養(yǎng)計數法的結果與NMB-MultipleqPCR標準曲線獲得的計數結果進行l(wèi)og變換后，用配對t檢驗進行比較，結果顯示對于三種菌屬的計數結果，兩種方法的檢測結果均無統(tǒng)計學差異（曲霉屬t=-0.193，P＞0.05；青霉屬t=2.315，P＞0.05；鐮刀菌屬t=-0.387，P＞0.05）。建立常見產毒真菌的快速定量檢測方法，可為產毒真菌的有效監(jiān)測提供技術手段，利于從源頭上預防和控制真菌毒素的危害。目前產毒真菌快速檢測主要應用基于PCR的檢測技術［16-19］，但大多研究僅針對某些特定產毒真菌，對常見多種產毒真菌同時進行快速檢測的研究卻不多。Suanthie等［11］報道了針對曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬的multipleqPCR，并成功應用于玉米發(fā)酵液中，但該方法能否應用于辣椒等香辛料的固體樣品仍然未知。另一方面，PCR技術檢測真菌的靈敏度還有待進一步提高，在Suanthie等的研究中，樣品中的真菌檢出限僅為106CFU/g，而其他學者報道真菌純培養(yǎng)物的檢出限也僅為103～104CFU/反應。針對這一問題，本研究利用裸磁珠對懸液中真菌的富集及對multipleqPCR反應體系的優(yōu)化實現了方法靈敏度的提高，檢出限可達103CFU/ml，即104CFU/g辣椒樣品（國家農業(yè)部無公害香辛料霉菌總數的限量標準為104CFU/g［20］），因此該方法可應用于香辛料中產毒性真菌的快速檢測并及時指示污染。同時該方法特異性和重復性良好，檢測結果與標準培養(yǎng)計數法相比無統(tǒng)計學差異，無需純培養(yǎng)，全程7h內即可獲得結果，大大縮短了檢測時間。FAM、HEXCy5，但研究中發(fā)現，HEXPCRHEXRFU40001000道不符，以上問題將在日后研究中進一步驗證。本文首次將裸磁珠技術應用于真菌的分離富集并與多重實時熒光定量PCR聯用，建立了對曲霉屬、青霉屬以及鐮刀菌屬三類常見產毒真菌進行定量檢測的裸磁珠-多重實時熒光定量PCR方法，并成功應用于辣椒模擬樣品，檢出限可達104CFU/g，可望用于香辛料中常見產毒性真菌的監(jiān)測，具有潛在應用價值?！鞠嚓P文獻】［1］RenardA，GómezDP，Egea-CortinesM，etal.ApplicationofwholegenomeamplificationandquantitativePCRfordetectionandquantificationofspoilageyeastsinorangejuice［J］.IntJFoodMicrobiol，2008，126（1）:195-201.［2］樊竹青，查衛(wèi)華，謝 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