膜片鉗常見問題匯總（人人都會膜片鉗）

人人都會膜片鉗膜片鉗常見問題匯總目錄膜片鉗系統(tǒng) 4做膜片鉗之前 4什么是膜片鉗？Patchclamp 4信號流 4重要概念： 4膜電位： 4參考電極： 5記錄電極： 5電極參數(shù)： 5電極參數(shù)對patch的影響： 5怎樣得到需要的電極參數(shù)？ 6膜被動反應參數(shù)： 6細胞外液的配置要注意什么？ 6電極內(nèi)液配置有什么要求？ 7沒有滲透壓儀，怎么計算滲透壓？ 7封接時需要給正壓嗎？ 7為什么封接維持不了很長時間？ 7膜片鉗放大器到底記錄哪些參數(shù)？ 8快電容與慢電容 8Mode： 8Membranetest測試脈沖怎樣設置？ 9鉗制電位是什么？如何設置？ 10達不到G歐封接的原因 10腦片細胞破膜困難怎么辦？ 10什么是protocol?什么是Ramp?什么是step? 10記錄時發(fā)現(xiàn)Overload信號燈閃，為什么？ 10解決噪音與基線問題的通用招數(shù)： 10基線怎么老是上下跳動？ 11濾波頻率，采樣頻率的應該如何設置？ 11Whole-cell問題及解答 12全細胞記錄一般使用什么樣的電極內(nèi)液？ 12如何確定已經(jīng)破膜？ 12是否每次一定要做電容消除、串連電阻補償、漏減、和液接電位矯正？ 12什么是尾電流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？ 13實驗記錄應該保留那些參數(shù)？ 13記錄到的電流幅度差異大怎么辦？ 13為什么我記錄到的電流越來越??？ 13什么是漏電流，為什么要做Leaksubtraction？ 13Cell-attached單通道記錄問題及解答 14其他記錄模式常見問題及解答 14數(shù)據(jù)分析 14如何分析突觸放電活動數(shù)據(jù)？ 14如何選用數(shù)碼濾波類型？ 14細胞類型 15急性腦切片 15要保證細胞活性需要注意什么問題？ 15腦切片一般切多厚合適？ 15如何判斷腦片細胞的好壞？ 15ACSF的配方中的Mg離子，有的用的MgSO4，有的用的MgCl2，他們有什么區(qū)別？ 15培養(yǎng)腦切片 15急性分離神經(jīng)元 15分離大鼠海馬神經(jīng)元的方法 15培養(yǎng)神經(jīng)元 16為什么我們用培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元記錄NMDA電流，總是會出現(xiàn)電流的衰減? 16急性分離細胞 16怎樣用離體灌流的方法急性分離大鼠心肌細胞？ 16如何對心肌細胞懸液進行復鈣？ 17心肌細胞急性分離液體一般配方： 17分大鼠心肌細胞，液體充氧是用的是純氧、還是95％O2和5％CO2的混合氣？ 17心肌細胞急性分離是用什么酶，消化多少分鐘比較好？ 17如何通過觀察細胞狀態(tài)調(diào)整酶濃度？ 17如何判斷心肌細胞的狀態(tài)？實驗室需要持續(xù)灌流嗎？ 18用消化酶灌流心臟后整個心臟迅速變白,不知道是什么原因？ 18分離平滑肌細胞需要注意什么？ 18如何分離動脈平滑肌細胞？ 18分離動脈平滑肌細胞用什么酶？怎么判斷消化時間是否合適？ 18平滑肌細胞patch要注意什么？ 18急性分離的DRG要消化到什么程度才合適，進行全細胞膜片鉗？ 19細胞系 19HeK293細胞轉(zhuǎn)染多長時間合適？ 19為什么我記錄的細胞沒有Ca電流呢？ 19我記錄的細胞非常扁平，不好patch怎么辦？ 19離子通道問題 20離子通道的種類： 20什么是離子通道的激活，失活，去激活？ 20如何繪制離子通道的激活曲線？ 20如何繪制離子通道的I-V曲線？ 20什么叫整流？內(nèi)向整流、外向整流的區(qū)別有什么區(qū)別？ 20如何繪制離子通道的失活曲線？ 21鉀離子通道 21神經(jīng)元鉀通道電流的電極內(nèi)液和細胞外液配方 21如何記錄及確認KATP電流？ 21記錄KATP電流內(nèi)液加不加Na2ATP的問題？ 21鈉離子通道 21鈣離子通道 21外液中用Ba2+取代Ca2+對不同的鈣電流會有什么不同的影響？ 21全細胞記錄不到Ca2+電流,好像還是K+電流,都是正向電流 22電極內(nèi)液和細胞外液都用了TEA-Cl，仍然沒有記到Ca電流，是什么原因？ 22記錄L型Ca電流，阻斷Na電流應該加TTX吧? 22記錄鈣離子通道電流的時候，怎樣判斷記錄的就是鈣電流，而不是其它通道電流？ 22電極液中已加過TTX和TEA-Cl，用不用再判斷記錄電流為鈣電流？ 22氯離子通道 22水通道 22膜片鉗配套設備問題 23刺激器與刺激電極 23隔離器 23微操 23那個牌子的微操比較好？ 23微操一動就有噪音怎么辦？ 23為什么patch上細胞以后，電極一會兒就不在原來的位置了？ 23電極拉制儀 23我應該選垂直拉制儀還是水平拉制儀？ 23換了新的鉑金片，如何重新設置拉制儀參數(shù)？ 23我用的水平拉制儀，兩根電極參數(shù)差很多怎么辦？ 24電極拋光儀 24我做腦片細胞，電極要不要拋光？ 24顯微鏡 24灌流給藥系統(tǒng) 24震動切片機 24膜片鉗相關設備\軟件的具體操作 25怎樣連接放大器和Digitizer？ 25MultiClamp700A中，在放大器和信號器的連接中，放大器的rawoutput是否需要連接信號器的ANALOGIN接口?scaledoutput，rawoutput有什么區(qū)別? 25AxonCNS中如何消除膜電容？ 25使用Clampex

8.0記錄配體門控離子通道電流，protocol

如何設置 25膜片鉗采集軟件Clampex的Acquisition

Mode中Fixed-Length

Events

Mode和Variable-Length

Events

Mode是如何采樣的？ 26附錄膜片鉗系統(tǒng)設備與參考價格 26附錄國內(nèi)著名電生理實驗室目錄 28附錄國外著名電生理實驗室目錄 28附錄國內(nèi)外電生理設備供應商 29附錄名詞目錄 30

膜片鉗系統(tǒng)（不包括細胞）：做膜片鉗之前對于實驗所用樣本一定要有足夠的了解，不同的細胞系，不同的動物種屬，甚至不同的制備方法，離子通道的表達都有巨大的差異，最好是采用前人使用過的模型。千萬不要白白浪費時間。什么是膜片鉗？Patchclamp采用尖端經(jīng)過處理的微電極與細胞膜發(fā)生緊密接觸，是尖端下的細胞膜在電學上與其他細胞膜分離，從而降低背景噪聲，記錄到細胞的微弱電流。該技術的核心就是降低背景噪聲：1，G歐封接2低噪聲放大器3噪音過濾膜片鉗電路可以簡單的理解為一個電流表，一個電壓表，一個電阻，一個命令中心施加電壓和電流刺激。信號流Amplifier命令電壓或刺激電流（數(shù)字信號）AD/DA轉(zhuǎn)換（轉(zhuǎn)換成模擬信號）細胞AD/DA轉(zhuǎn)換（轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號）Amplifier重要概念：膜電位membranepotential，靜息膜電位restmembranepotential，電極電阻PipetteResistence；電極電容PipetteCapacitance；液接電位LJP；串聯(lián)電阻Rs；膜電阻Rm；膜電容；快電容C；慢電容；鉗制電位Vh；去極化depolarization；超極化Hyperpolarization；membranetest；protocol；ramp；step；電容充電反應；膜電位，靜息電位，超極化，去極化，反轉(zhuǎn)電位：細胞膜內(nèi)外兩側的電位差稱為膜電位（membranepotentialVm）。離子順濃度梯度進行移動，但細胞膜在靜息狀態(tài)下僅離子的通過具有選擇性，主要為K離子，因此，K離子的由內(nèi)向外的單向流動造成膜內(nèi)外電位差，從而產(chǎn)生靜息電位（RestmembranepotentialRMP），一般為-70mV左右。如果膜內(nèi)電位變的更負，稱為超極化Hyperpolarization，反之，稱為去極化depolarization。當細胞受到刺激，膜上部分Na通道打開，產(chǎn)生去極化，當刺激足夠大，膜電位達到一個臨界值，大量Na通道打開，造成動作電位(ActionpotentialAP)，這個臨界值稱為閾電位thresholdpotential。反轉(zhuǎn)電位是針對某種離子來說的，即離子的平衡電位。參考電極：氯化銀電極通過氯化銀電解導電，具有消耗性，發(fā)白了就要重鍍。鍍之前用砂紙或刀片打磨干凈。泡到84或者飽和KCl溶液里。84要快一些，一個小時就夠了。也可以電鍍，可以使用專門的電鍍儀，或者將使用刺激器電鍍：正極氯化銀電極，負極連接金屬絲，同時放入飽和84或者飽和KCl溶液里，然后設定刺激器的刺激電壓，數(shù)秒完成。常見問題：基線不穩(wěn)，氯化銀消耗太多了，需要重鍍。直流漂移：基線不斷向一個方向移動。內(nèi)外液氯離子差太太，需要重新考慮配方或者使用鹽橋參考電極。記錄電極：氯化銀電極：同上，注意鍍的時候不要整個鍍黑，上端連接電路的部分要露出銀絲，不然斷路了。玻璃電極：分為有芯和無芯。不同細胞，不同記錄需要的電極參數(shù)不盡相同，參考群文《pipettecookbook》。電極保存不好很容易變臟，會增加封接難道和噪音，一般用無水乙醇浸泡數(shù)小時，用超聲清洗10min，然后放到烤箱烤干。電極拋光，對于記錄腦片尤其需要，如果記錄單通道還可能要對電極進行涂膠。電極參數(shù)：電極電位：固體電極與液體內(nèi)液之間產(chǎn)生的電位差。電極電阻：玻璃微電極本身的電阻，主要有電極開口大小決定，為串聯(lián)電阻的主要成分。電極電容：快電容的主要成分，是浸液部分電極內(nèi)外液之間形成的跨壁電容和非浸液部分與臨近地表形成的漂浮電容。電極參數(shù)對patch的影響：小開口，高電阻有利于封接，但難以破膜，而且破膜以后開口容易被重新堵上（reseal）.適合記錄小細胞，或者細胞狀態(tài)不太好的時候。短時間記錄大開口，低電阻不利于封接，但容易破膜，不容易reseal.適合細胞狀態(tài)好的時候，能夠長時間記錄比較穩(wěn)定的電流。一般細胞，電極電阻4M-5M左右比較容易封接，破膜。小細胞適當提高阻抗。怎樣得到需要的電極參數(shù)？1-1-1膜被動反應參數(shù)：膜電阻membraneresistance：一般指膜上離子通道未開發(fā)是的膜輸入電阻，一般為數(shù)百兆到數(shù)G。也稱被動膜電阻或者漏電阻。膜電容membranecapacitance：指細胞膜內(nèi)外液之間的電容，為慢電容的主要成分。膜漏電流leakcurrent：也稱被動發(fā)應電流，包括膜電容電流和膜穩(wěn)態(tài)電流。膜電容電流發(fā)生在脈沖起始部位和結束部位，是膜電容充放電反應，電流較大，持續(xù)時間很短。膜穩(wěn)態(tài)電流發(fā)生在脈沖持續(xù)期間，電流小，持續(xù)時間長，電流大小與脈沖電壓成正比。細胞外液的配置要注意什么？根據(jù)細胞類型和記錄電流不同，配方會有變化。PH值，7.4左右。有時需要通CO2調(diào)節(jié)。滲透壓300-310Osm。一邊攪拌一邊加試劑，避免生成Ca沉淀。存儲液一般配4X，不加葡萄糖。最好現(xiàn)用現(xiàn)配。電極內(nèi)液配置有什么要求？根據(jù)記錄的方式，電流的不同，電極內(nèi)液有所不同。一般為等張液，也有用低滲液，比外液滲透壓低-10mOsm（據(jù)說利于封接）.PH值一般為7.3左右。配置后2μm濾網(wǎng)過濾，分裝，-80可保存一年左右。電極內(nèi)液一般會加入EGTA，酸性環(huán)境難溶，需要在堿性環(huán)境下首先融掉。沒有滲透壓儀，怎么計算滲透壓？根據(jù)離子濃度可以計算滲透壓，比如120mMNaCl,產(chǎn)生240mMOsM滲透壓。外液滲透壓在300左右。內(nèi)液可以稍低。封接時需要給正壓嗎？單細胞不需要，或者給很小的正壓。單細胞比較脆弱，很容易被吸到電極里。腦片細胞一般需要給正壓，細胞周圍比較臟，給適當正壓更利于封接。為什么封接維持不了很長時間？好的封接單細胞可以維持30分鐘以上，腦片細胞可以維持的時間更長。如果不能維持到理想的時間需要檢查一下幾個方面：細胞狀態(tài)。內(nèi)外液。所有細胞狀態(tài)開始很好，然后迅速變差，一般為外液問題。每個細胞都很好封接，但維持不了很長時間，一般為內(nèi)液問題。電極開口過大，很快就掉。過小，很快reseal。物理原因，比如震動。膜片鉗放大器到底記錄哪些參數(shù)？放大器直接記錄的有電流，電壓，時間，其他參數(shù)都是通過這三個參數(shù)計算得來。膜片鉗系統(tǒng)的計算方式：1-1-2Rm,Rs的計算見axonguide或劉振偉實用膜片鉗技術。快電容與慢電容快電容Cfast:主要指電極電容，形成G歐封接之后補償，必須補償，原因如下：細胞對命令電壓的反應延遲Tau=RsCm影響鉗制電位Vm=Vcmd*Rm/(Rm+Rp)限制攝取電信號的頻帶寬。（-3dB）f=1/2πRsCm慢電容Cslow:主要指形成全細胞記錄后的細胞膜電容，破膜之后補償。Mode：電極未入水，電路是斷路狀態(tài)，理想電阻無限大，理想電流為0.Bath:記錄電極入水，電路接通。基線調(diào)零（LJP調(diào)零），正常電極電阻為3-6M左右，可根據(jù)細胞類型自己調(diào)整。一般此時給一個方波刺激（Membranetest），此時電路主要電阻為電極電阻（其實還有各種其他電阻，此處忽略），電流≈方波電壓/電極電阻。系統(tǒng)顯示電極電阻Ra。Patch:電極接觸細胞，細胞膜片電阻接入電路，電流開始變小，直到形成G歐封接，電流≈方波電壓/（串聯(lián)電阻Rs+封接電阻Rm）。同時看見電極電容的充電反應,此時補償Cfast。Rm為G歐以上，可能高達十幾G。此時理想電流接近零。Wholecell:打破細胞膜，整個細胞被接入電路。電流≈方波電壓/（串聯(lián)電阻Rs+細胞膜電阻Rm）。理想Rm為數(shù)百兆到數(shù)G，因此電流也不大，可以見到很強的電容充放電。如需要，此時補償Cslow。（）1-1-3Membranetest測試脈沖怎樣設置？Membranetest是檢測細胞膜輸入電阻，即離子通道未打開時的電阻，因此不應將測試脈沖設置太大，否則離子通道開放，導致誤差。也不應該太小，太小也會導致誤差，因為系統(tǒng)的精確度有限。測試脈沖越小，誤差越大。所以一般測試脈沖設置在5-6mV,最大不超過10mV.另外，測試脈沖的時間不能太短，必須要等到膜電容充電反應結束，形成穩(wěn)態(tài)電流，一般需要設置為數(shù)個ms。電極入液后，測試脈沖變小或者消失是怎么回事？說明電路阻抗增大或斷路：電極尖端是否有氣泡？參考電極是否入液？有大的直流漂移，需要重鍍氯化銀電極。檢查是否有其他地方斷路。比如是否將氯化銀電極整根鍍了，而沒有留出銀絲部分。放大器與數(shù)模是否連接。電極入液后，測試脈沖變的很大怎么回事？說明阻抗變小或者短路：電極尖端是否折斷？電極夾持器是否被液體污染？接地不良鉗制電位是什么？如何設置？電壓鉗模式下，系統(tǒng)通過放大器或者軟件，將細胞跨膜電位固定在某一數(shù)值，這一數(shù)值即為鉗制電位(holdingpotential)。電位一般鉗制在細胞的靜息電位，或者測量的離子通道的反轉(zhuǎn)電位。Clampex可以在realtimecontrolpanel設置cmd，也可以在membranetest設置holding，還可以protocoleditor設置每一個輸出通道的holdingpotential達不到G歐封接的原因1細胞種類和狀態(tài)問題。2電極問題，清洗，拋光，調(diào)節(jié)電極參數(shù)，小開口更利于封接。3液體問題，更換內(nèi)外液。外液中的Ca,內(nèi)液中的ATP都有利于封接。4氣路漏氣或者氣路不暢。腦片細胞破膜困難怎么辦？增加電極開口，降低阻抗。調(diào)整負壓，過大會導致電極尖端被堵，無法破膜。給予ZAP，可以同時結合ZAP和負壓破膜。什么是protocol?什么是Ramp?什么是step?Protocol是膜片鉗系統(tǒng)通過軟件給細胞施加的一組電壓或電流刺激，可以通過軟件對進行編輯。Step，步階脈沖，連續(xù)給予細胞固定電壓或電流差的數(shù)個刺激，用于制作離子通道I-V曲線，激活曲線。ramp在pClamp軟件中表示施加給細胞的一種逐漸變化的電壓或電流，稱為“斜坡電壓或電流”，可用于作通道I-V曲線。記錄時發(fā)現(xiàn)Overload信號燈閃，為什么？檢查電路是否有短路，氯化銀電極是否鍍好。電極沒有斷頭、過粗現(xiàn)象。holder和參比電極的銀絲要鍍得均勻，時間過久則需要重新鍍銀。有可能探測到極大的瞬變電流或電壓，更改濾波設置，降低瞬變值。說明信號飽和，應降低輸出增益gain值，如果仍然閃爍，查看一下反饋電阻設置，看能否選擇。解決噪音與基線問題的通用招數(shù)：1重鍍氯化銀電極，包括參考電極和記錄電極。2使用cellmodel確定是系統(tǒng)噪音還是干擾。（使用cellmode正常可以排除一切軟硬件問題，是排除系統(tǒng)故障的利器！！?。?逐個關掉周圍的儀器，排除噪音來源。4檢查地線。一點接地，將所有儀器地線接到銅板，然后銅板接地。5更換內(nèi)外液。灌流時產(chǎn)生噪音怎么去除？1接地。2避免液體一直連續(xù)，可參考輸液裝置。3在管道中加入一根金屬管，然后將金屬管接地。4將管道用錫紙包起來。5更換低噪音的灌流泵。6使用重力灌流。基線怎么老是上下跳動？如果基線總是圍繞0點上限做幅度有限的跳動，一般是因為holding的電壓不對導致離子通道開放。尤其是Na離子通道開放更容易有這類情況的發(fā)生。如果將Holding的電壓設為更負的情況比如-90，情況會好轉(zhuǎn)，就更能確定是因為Na離子通道開放的原因。濾波頻率，采樣頻率的應該如何設置？在進行模擬/數(shù)字信號的轉(zhuǎn)換過程中，當采樣頻率fs.max大于信號中，最高頻率fmax的2倍時，即：fs.max>=2fmax,則采樣之后的數(shù)字信號完整地保留了原始信號中的信息，一般實際應用中保證采樣頻率為信號最高頻率的5～10倍，稱為過頻采樣；采樣定理又稱奈奎斯特定理。采樣頻率設置為低通濾波的2倍為最低要求，否則系統(tǒng)會有提示。膜片鉗一般設置為低通濾波的5-10倍。采樣頻率直接決定信號頻寬，采樣頻率越高，越接近真實信號（時間分辨率越高），但缺點是數(shù)據(jù)量變大，同時膜片鉗系統(tǒng)對信號帶寬也有限制，比如axon200B全細胞模式的信號帶寬為50K。低通濾波必須高于記錄的信號頻率，因為一般濾波器都會對通帶信號有衰減。但一般不超過10K因為信號寬會被電極電阻與細胞電容形成的RC濾波器限制。Whole-cell問題及解答全細胞記錄一般使用什么樣的電極內(nèi)液？2-1-1根據(jù)所記錄的電流不同，內(nèi)液成分會有變化。如何確定已經(jīng)破膜？高阻封接形成后，轉(zhuǎn)到全細胞模式，輕輕給予負壓吸引破膜，細胞狀態(tài)好或者破膜困難時還可嘗試ZAP破膜。看Cm值，cellattached模式下，Cm一般為數(shù)個pF,破膜后為十幾個pF到數(shù)十個pF甚至更大。細胞越大，Cm越大。Rm值，高阻封接時，Rt為數(shù)個G到十幾個G，破膜后，會有明顯下降。一般為數(shù)百M到數(shù)個G。破膜后，有明顯的細胞膜充放電反應。是否每次一定要做電容消除、串連電阻補償、漏減、和液接電位矯正？在電壓鉗實驗中，如果需要給予細胞電刺激來改變細胞膜電位（如超極化或去極化），則會出現(xiàn)膜的被動反應，產(chǎn)生電容電流與電阻電流，此時，前者需要用電容補償消除，后者需要用漏減功能消除。全細胞記錄中，串聯(lián)電阻是必須要補償?shù)模ㄖ辽僖a償80%），除非它很小而忽略不計。液接電位（一般在10mV左右）也需要校正，除非它很小。你可采用Clampex軟件中的菜單Tools/JunctionPotential功能對其測算，然后決定是否需要校正。什么是尾電流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？答：在離子通道的激活因素（去極化或超級化）結束時通道的關閉過程叫做去激活(Deactivation)，所記錄到的電流稱為尾電流（Tailcurrent），主要反映通道的關閉特征。延遲整流性K+離子通道以及一些不同類型的Ca2+離子通道，它們的尾電流均具有電壓依賴性，關閉過程呈指數(shù)分布，可用指數(shù)方程擬合而獲得通道關閉過程的時間常數(shù)。尾電流的分析對研究電壓門控性離子通道的激活、關閉、失活等動力學過程很有幫助。如研究尾電流幅度與脈沖電壓的關系、脈沖電壓的不同持續(xù)時間或尾電流不同的鉗制電壓對尾電流幅度、衰減時間常數(shù)的影響等等。通過這些研究可了解通道關閉過程中出現(xiàn)的不同關閉狀態(tài)。藥物可影響通道的關閉過程，表現(xiàn)為尾電流的衰減過程變快或變緩慢。如何知道靜息電位的數(shù)值？將細胞鉗制模式改為電流鉗，不施加任何刺激情況下，所顯示的電壓即為靜息電位。實驗記錄應該保留那些參數(shù)？Cm,Rm,Ra為最基本的參數(shù)，必須保留。同時根據(jù)自己的要求保留其它參數(shù)。（）記錄到的電流幅度差異大怎么辦？因為細胞大小不均勻，或者通道表達量的問題，電流幅度可能差異比較大，此時可以計算電流密度pA/pF。如果不需要電流的絕對值，還可以將電流進行標準化。為什么我記錄到的電流越來越小？全細胞記錄所記錄到的電流具有rundown的現(xiàn)象，隨著記錄時間的延長，細胞電流越來越小，對于Ca電流尤其明顯。造成rundown現(xiàn)象的原因有：1）細胞內(nèi)液與電極內(nèi)液交換，細胞內(nèi)大分子，信號分子減少。2）細胞內(nèi)ATP被稀釋，但Ca離子排出卻是一個耗能的過程。防止或延遲rundown現(xiàn)象的方法：1）電極內(nèi)液加ATP和GTP;或者采用ATPregeneratingsystem2）采用穿孔膜片鉗來記錄電流。什么是漏電流，為什么要做Leaksubtraction？漏電流的概念比較混亂，可以指封接電流（封接時從封接處“漏掉”的電流），也可指放大器的系統(tǒng)偏差，還可指膜漏電流。一般來講，膜漏電流是細胞膜的被動反應電流，是非離子通道電流，因此在記錄離子通道電流時要將它去除。膜片鉗放大器與采樣分析軟件都具有將其去除的漏減功能。Cell-attached單通道記錄問題及解答其他記錄模式常見問題及解答數(shù)據(jù)分析如何分析突觸放電活動數(shù)據(jù)？Minianalysis可以通過設置參數(shù)，分析自發(fā)放電的頻率，幅度，動力學參數(shù)。Clampfit可以通過選取模板分析突觸點活動的頻率，幅度，動力學參數(shù)。如何選用數(shù)碼濾波類型？如果經(jīng)過設置膜片鉗系統(tǒng)的濾波參數(shù)以后，數(shù)據(jù)仍噪音過大，可以進行數(shù)碼濾波。一般采用Bessel濾波或者RC濾波方法，信號不失真。如果只是頻率分析，則可以選擇其他如Butterworth濾波。

細胞類型急性腦切片急性腦切片的步驟：準備所需動物，麻醉。一般采用小于三周的動物，較大的動物細胞活性稍差，可在切片液中加入氯化膽堿。斷頭取腦（1-3min），要避免損傷。浸入冷的氧飽和的ASCF中1min，取出切片。在冷的ASCF中進行切片，同時通氧，切片厚度約為一般為200uM—400uM，如有條件使用震動切片機。震動頻率要快，但不要出現(xiàn)垂直震動。切割速度要慢，每次切割大概1min左右，具體需要根據(jù)自己試驗條件微調(diào)，要注意避免腦片上下翻滾。將腦片轉(zhuǎn)移到孵育槽中孵育待用，轉(zhuǎn)移腦片用吸管或者柔軟的毛筆。一般孵育1小時后可以使用。要保證細胞活性需要注意什么問題？1）速度快2）全程氧飽和3）低溫腦切片一般切多厚合適？一般為200uM—400uM。如何判斷腦片細胞的好壞？健康腦片呈淡黃色，發(fā)白說明狀態(tài)較差邊緣清晰，立體感強，盡量避免第一層細胞。如見空泡或者清晰的細胞核，說明細胞已經(jīng)死亡。電流鉗模式下，看靜息膜電位，一般為-40mv70mv，根據(jù)細胞類型有所變化。是否有自發(fā)放電，給予電流刺激，看能否誘發(fā)動作電位。（）ACSF的配方中的Mg離子，有的用的MgSO4，有的用的MgCl2，他們有什么區(qū)別？有關滲透壓，有的配方是295

mOsm，有的300多mOsm，他們又有什么區(qū)別？如何調(diào)整ACSF的滲透壓？

答：用MgSO4和用MgCl2沒多大區(qū)別，但如果要記錄Cl電流，就要有所考慮；另外若所需要的Mg濃度有大的變化，也要考慮到Cl和SO4離子所可能帶來的問題。滲透壓有個范圍，一般在290－320之間都沒有問題，精確地測量與調(diào)節(jié)滲透壓需要特殊的滲透壓儀，但一般都是通過離子強度進行計算，只要大體在上述范圍就行。培養(yǎng)腦切片培養(yǎng)海馬切片，急性分離神經(jīng)元分離大鼠海馬神經(jīng)元的方法成年Wistar大鼠(200~250g)麻醉后(水合氯醛40mg/100g)迅速斷頭取腦,置于0~4℃的高濃度蔗糖溶液中冷凍約2min,再用振動切片機(WorldPrecisionInstrumentsMA752-045)切成400μm厚的腦片。高濃度蔗糖溶液的成分為(mmol/L):蔗糖234、KCl2.5、Na2HPO41、MgSO44、CaCl20.1、HEPES15、葡萄糖11、用1mol/L的NaOH調(diào)pH值至7.3。將切好的腦片置于通以95%O2+5%CO2混合氣的EBSS液中孵育1~6h(室溫),然后將腦片移入低Ca2+的羥乙基磺酸鈉緩沖液中,并在解剖顯微鏡下用細解剖針按Paxinos圖譜所示,將海馬CA1區(qū)含錐體細胞層的一小塊組織從腦片上分割下來將組織塊放入用100%O2飽和的HBSS液中(33℃)用鏈白蛋白酶(proteaseXIV,1.1~1.4mg/ml)消化30~45min后取出置于低Ca2+的羥乙基磺酸鈉緩沖液中清洗3次,用尖端經(jīng)火拋光處理的吸管(口徑依次為500、300和150μm)將之吹打成細胞懸液,并移數(shù)滴至蓋玻片上。待細胞貼壁后,先將蓋玻片用浴槽液清洗兩遍,再移至浴槽內(nèi)進行實驗。實驗僅選用形態(tài)為錐形或梭形、有頂樹突和基樹突特征的錐體細胞進行記錄。培養(yǎng)神經(jīng)元為什么我們用培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元記錄NMDA電流，總是會出現(xiàn)電流的衰減?而且我們記錄是選擇的培養(yǎng)第10-14天的大鼠，可是電流大小不等，具體在100-1500pA間波動，這讓我們很疑惑，注明一下，電極內(nèi)液中我們用了CsCl和ATP、GTP。電流大小不等與細胞大小、細胞狀態(tài)等都有關，另外更重要的可能與你的給藥方法有關，不知你采用的是哪種給藥方法？正常情況下，連續(xù)誘發(fā)受體電流會存在失敏，表現(xiàn)為電流的衰減（幅度減?。绻谟涗涍^程中細胞狀態(tài)逐漸不好，也會出現(xiàn)這種情況。我們認為你所選用的細胞培齡沒有問題，內(nèi)液也沒問題.急性分離細胞怎樣用離體灌流的方法急性分離大鼠心肌細胞？分離大鼠心臟，取用4℃的冰臺式液淋在心臟上降低其代謝；將心臟掛上Langendorff裝置，用無鈣臺式液經(jīng)主動脈逆向灌流，清理心腔內(nèi)積血，直至心肌停跳，同時剪去多余的組織

。心臟內(nèi)如有微血栓形成，會導致灌流不充分，這是不能分解出好細胞的重要原因，必要時可在取心臟前，先心腔內(nèi)給些肝素以防血栓的形成。灌流過程要通氧，保持恒溫，灌流速度要穩(wěn)定。消化液灌流（含膠原酶II~0.2mg/ml)，灌流到流出液變渾濁為止。將酶液沖洗干凈！至少50ml臺式液。等心臟變得透明，流出液體呈拉絲狀，剪下心肌。也可以根據(jù)情況先剪一些右心房或右心室的組織，看能否吹打開。在含有100umol/Lca2+和1%牛血清白蛋白的MOPS液中剪碎，吹打，溫孵10分鐘。KB液中保存待用PATCH前必須進行復鈣，然后再使用，否則難以封接。如何對心肌細胞懸液進行復鈣？細胞懸液滴在灌流槽中靜置，待細胞貼壁后，然后用含鈣的細胞外液（一般就是臺式液）灌流幾分鐘?；蛘邔⒓毎麘乙涸谠嚬苤徐o置，細胞下沉于管底時，把上清夜用吸管吸掉，再加入含鈣的細胞外液。心肌細胞急性分離液體一般配方：（1）無鈣臺氏液(mmol-1)：NaCl

130，KCl

5.4，KH2PO4

1.2，MgSO4

0.5，HEPES

6.0，Glucose

10.0，PH=7.4

with

NaOH

（2）有鈣臺氏液(mmol-1)：NaCl

137，KCl

5.4，CaCl2

1.8，MgCl2

0.5，HEPES

6.0，Glucose

5.0，PH=7.4

with

NaOH

（3）酶溶液：無鈣臺氏液+0.4mg/ml

collagenase+0.1mg/ml

protease

（4）貯存液(mmol-1)：KOH

70，L-glutamine

acid50，KCl

40，Taurine

20，KH2PO4

20，MgCl2

3，Glucose

10，HEPES

10，EGTA

0.5，PH=7.4

with

KOH

KB

solution

(in

mM):

KOH

85,

L-glutamic

acid

50,

KCl

30,

Taurine

20,

MgCl2

1.0,

KH2PO4

30,

HEPES

10,

EGTA

0.5,

Glucose

10

(pH

adjusted

to

7.4

with

KOH)分大鼠心肌細胞，液體充氧是用的是純氧、還是95％O2和5％CO2的混合氣？這取決于你的ＰＨ緩沖劑是什么．如果用ＮaＨＣＯ３做緩沖就需要通95％O2和5％CO2的混合氣，如果只通純氧，ＰＨ會上升，ＮaＨＣＯ３變?yōu)椋茫希掣腿芤褐械拟}形成沉淀。如果用ＨＥＰＥＳ，則僅需要通純氧，通95％O2和5％CO2的混合氣，則CO2變?yōu)椋龋玻茫希?，ＰＨ會下降?/p>

心肌細胞急性分離是用什么酶，消化多少分鐘比較好？一般使用膠原酶I或者消化時間也受很多因素影響，沒毒濃度、溫度、豚鼠狀態(tài)、個人習慣都影響很大，需要即時觀察，到豚鼠心肌消化變大變軟變色、酶成渾濁，方可剪下。至于消化時間要根據(jù)老鼠大小，和灌流速度來定，沒有固定的時間。在心臟膨大變軟后，從心室內(nèi)吸少量液體在顯微鏡下找單個心肌細胞，見單個細胞后再延長半分鐘到一分鐘。如何通過觀察細胞狀態(tài)調(diào)整酶濃度？如果細胞的量很多，而且碎片多，細胞橫紋不清，表明酶解過頭；如果細胞量不大，且圓球形的細胞較多，細胞懸液較清，表明酶解不夠。如何判斷心肌細胞的狀態(tài)？實驗室需要持續(xù)灌流嗎？在顯微鏡下如果看到清晰橫紋，那是好的細胞。如果橫紋不清，那一定是狀態(tài)不好的細胞。整個實驗過程中要持續(xù)灌流，否則死亡的細胞釋放出多種酶，及鈣，死細胞的碎片也會影響封接，細胞也會缺乏養(yǎng)分，導致細胞狀態(tài)不好。用消化酶灌流心臟后整個心臟迅速變白,不知道是什么原因？可能原因：1.冠脈中有微血栓形成，導致灌流不均勻而致。處死動物之前，先腹腔注射肝素1000u/kg.2.大鼠的狀態(tài)也是非常重要的。分離平滑肌細胞需要注意什么？1去離子水配置溶液，分離液體最好是新配的，超過一周就不要再用了2.明確溶液PH值7.4，不要偏酸3.調(diào)整一下消化酶的劑量,消化酶需要根據(jù)氣候溫度等情況不同隨時加減

4.消化的時間也是根據(jù)具體情況適當?shù)目s短或延長.

5.動物的狀態(tài)也會影響平滑肌細胞的活性質(zhì)量的,假如動物挨餓,受凍,受熱等使動物處于應急狀態(tài),細胞的質(zhì)量也會下降.如何分離動脈平滑肌細胞？分離動脈平滑肌細胞用什么酶？怎么判斷消化時間是否合適？1）albumin2.5mg/ml，DTT1.5mg/ml，papin1.5mg/ml，collagenase2.5mg/ml，hyaluronidase2.5mg/ml.分離的細胞鏡下成梭形或香蕉狀。2）酶量不是關鍵，酶量少一些可以適當延長一些時間3）第一步剪成的血管塊酶解成接近濃膠狀，迅速轉(zhuǎn)移進行第二步酶解平滑肌細胞patch要注意什么？1由于平滑肌細胞比較小（一般只有20pF左右），封接時，首先應該用灌流液多沖洗幾遍，以去除BSA的影響；2注意測試脈沖電流的變化，電極尖端壓細胞時不能太狠，以免刺破細胞；3灌流液為高滲液體相對容易封接。4分離得到的平滑肌細胞膜都比較脆，給負壓時要輕；5zap功能對血管平滑肌而言，太大了細胞容易掉，小了不起作用，具體的參數(shù)要多次摸索，結合負壓吸引。急性分離的DRG要消化到什么程度才合適，進行全細胞膜片鉗？鏡下觀察細胞圓或橢圓，胞質(zhì)均勻，胞壁干凈完整透亮有光圈感。封接難可能是消化不足，消化不均勻，細胞表面不干凈等原因。消化時應在搖床上或消化過程中輕輕搖動離心管細胞系HeK293細胞轉(zhuǎn)染多長時間合適？取決于轉(zhuǎn)染的基因表達產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的半衰期，一般表達時間為24小時-72小時。為什么我記錄的細胞沒有Ca電流呢？不同的細胞系表達的離子通道有很大不同，如果采用細胞系記錄某種離子通道電流，一定要確定該細胞系是否表達所需離子通道。如果沒有表達，則需要通過轉(zhuǎn)染，使細胞系表達所需通道，然后再進行記錄。我記錄的細胞非常扁平，不好patch怎么辦？有些培養(yǎng)細胞系形狀扁平，不利于patch,這時最好稍微消化做成細胞懸浮液，將懸浮液滴在小玻片上，再過半個小時細胞稍微貼壁就容易patch了。如果細胞貼壁不利，還可以先將玻片上鋪上多聚賴氨酸（polylysine）然后再使用。

離子通道問題離子通道的種類：電壓門控離子通道；受體門控離子通道；機械敏感型離子通道；縫隙連接；細胞內(nèi)膜離子通道；質(zhì)子門控離子通道；水通道；什么是離子通道的激活，失活，去激活？

C<>O<>I

C:

關閉

O：開放

I：失活

激活(activation：從C到O的過程。

失活(inavtivation)：從O到I的過程。

去激活(deactivation)：I

回到C的過程。如何繪制離子通道的激活曲線？1根據(jù)離子通道的電流特點設定離子通道的脈沖電壓，一般包括從通道激活時的電壓到最大電流時的電壓。2測量不同脈沖電壓下的全細胞電流峰值。3計算全細胞電導，g=I/(Vm-Vrev).Vm為脈沖電壓，Vrev為離子通道反轉(zhuǎn)電位。4以g/gmax為縱坐標，以Vm為橫坐標，作出激活曲線。5用Boltzmann方程g/gmax={1+exp[(V1/2-Vm)/K]}-1，對激活曲線進行擬合求得斜率因子K和V1/2。如何繪制離子通道的I-V曲線？1根據(jù)離子通道的電流特點設定離子通道的脈沖電壓，一般包括從通道激活時的電壓到最大電流時的電壓，一般要跨越反轉(zhuǎn)電位，比激活曲線的設定的脈沖電壓還要寬。2以I(電流峰值)為縱坐標，V(脈沖電壓)為橫坐標繪制I-V曲線。Clampfit自帶I-V曲線繪制功能。什么叫整流？內(nèi)向整流、外向整流的區(qū)別有什么區(qū)別？

如果膜只是一個單純的電阻的話，那么通過它的電流就應該和電壓是線性的關系。但由于通道的存在，這種線性關系就會被改變。隨電壓的升高，離子通道電流低于線性關系電流值，稱為內(nèi)向整流，I-V曲線位于相對偏向下；外向整流指離子通道電流隨電壓的升高而更高超過電壓依賴性的線性關系電流值，I-V曲線位于相對偏向上。

只要有離子通道，必然會有整流現(xiàn)象。如何繪制離子通道的失活曲線？鉀離子通道神經(jīng)元鉀通道電流的電極內(nèi)液和細胞外液配方同細胞因為所處環(huán)境以及通道分布的差異,記錄鉀電流時的內(nèi)外液會有一些不同,但大體上是類似的,具體要參照相關文獻。細胞外液：（mmol/l）NaCl144,KCl4.0,CaCl21.8,MgCl20.53,Na2HPO40.33,HEPES5,Glucose5.5,用NaOH調(diào)PH值為7.3。細胞外液加入TTX1umol/l阻滯鈉通道，CdCl20.2mmol/l阻滯鈣通道。電極內(nèi)液：KCl130,Na2ATP5.0,creatinephosphate5.0,HEPES5.0,用KOH調(diào)PH至7.4。如何記錄及確認KATP電流？先用開放及劑100uMpinacidil先使其開放，用特異性阻斷劑10uMglibenclamide完全阻斷，證實我所記錄到的是KATP電流外液配方是(mM)140NaCl,5KCl,1MgCl2,1CaCl2,10Hepes電極內(nèi)液配方是(mM)140KCl，5EGTA，5Hepes，10KOH，1MgCl2,1Na2ATP,0.1GTP記錄KATP電流內(nèi)液加不加Na2ATP的問題？

記錄KATP電流內(nèi)液是要加Na2ATP的，KATP通道在無ATP溶液中表現(xiàn)衰減現(xiàn)象，即先開放，隨后逐漸喪失活性，ATP可恢復衰減的通道活性。鈉離子通道鈣離子通道外液中用Ba2+取代Ca2+對不同的鈣電流會有什么不同的影響？1）為了避免Ca2+升高加速鈣通道得衰減，細胞內(nèi)的鈣離子可以加速鈣通道的失活，而鋇離子卻沒有該作用，因此用鋇離子做出來的通道電流失活較慢，就是通道關閉速率慢，表現(xiàn)在I-V曲線上就是電流達到峰值后上升的比較平坦。2）而且大多數(shù)的鈣通道亞型對Ba2+的通透性要大于Ca2+，用Ba電流替代鈣電流可將電信號適當放大，便于分析通道的特性。全細胞記錄不到Ca2+電流,好像還是K+電流,都是正向電流1Ca的通道電流很小，所以封接質(zhì)量要好；2Carundown明顯，所以破膜后立即記錄，可把protocal的刺激間隔時間設為最小，快速記錄；電極內(nèi)液和細胞外液都用了TEA-Cl，仍然沒有記到Ca電流，是什么原因？1確定細胞狀態(tài)，是否可以記錄其他電流。2查看protocol，是否應用了正確的protocol。記錄L型Ca電流，阻斷Na電流應該加TTX吧?

不一定要加TTX，只要protocal在鉗制在-40mv達200ms以使鈉通道失活，再以+10mv誘導出L型鈣電流，這樣就肯定不會出現(xiàn)鈉電流。記錄鈣離子通道電流的時候，怎樣判斷記錄的就是鈣電流，而不是其它通道電流？1）把外液換為無鈣液（其他離子濃度不變）2)加氯化鎘看能否完全阻斷鈣電流3）加維拉帕米看能否基本阻斷電極液中已加過TTX和TEA-Cl，用不用再判斷記錄電流為鈣電流？氯離子通道水通道

膜片鉗配套設備問題刺激器與刺激電極隔離器微操那個牌子的微操比較好？Scientifica,Burleigh,LuigsandNeumann微操一動就有噪音怎么辦？一般不影響記錄，查看微操接地。為什么patch上細胞以后，電極一會兒就不在原來的位置了？1）查看防震臺。2）微操問題，看看是不是有螺絲松了，或者連線太緊3）如果不能馬上解決，而且必須做實驗的話只能一直觀察電極，發(fā)現(xiàn)有移動就移回原來的位置。4）如果是微操控制器的問題，可以關掉控制器。暫時使用手動調(diào)節(jié)微操。電極拉制儀我應該選垂直拉制儀還是水平拉制儀？水平拉制儀總體來說要好于垂直拉制儀，控制比較精確，拉出的電極參數(shù)比較穩(wěn)定，而且兩根形狀區(qū)別較小。比較經(jīng)典的水平拉制儀是美國sutterinstrument的P-97,現(xiàn)在更好的產(chǎn)品是P-2000.換了新的鉑金片，如何重新設置拉制儀參數(shù)？Ramptest,測試基礎的拉制溫度。上下微調(diào)，找出兩步拉制或者三步拉制的臨界溫度。繼續(xù)微調(diào)（不要設置在臨界溫度），主要是設定拉力（對于P-97拉制儀，只需要設置Velocity，可不用設定Pull）與溫度。一般第一步拉制電極頸部，溫度要比第二步高（對于P-97拉制儀，溫度的設定需要先測量Ramp值），拉力不要過大，以保證頸部較短；第二步拉制尖端，一般要使溫度低些，拉力大些。一般都是通過顯微鏡查看電極尖端，這很簡單，并不復雜！最好是拋光，這樣就在拋光儀顯微鏡下查看。注意拋光后的電極尖端開口會變小，故在拉制電極時，尖端開口要大些。檢查電極還有其它方法，如“氣泡數(shù)法”，也可用放大器通過測量電阻來查看。4)我用的水平拉制儀，兩根電極參數(shù)差很多怎么辦？調(diào)整鉑金片的位置，努力保證其再兩根電極正中央。電極拋光儀我做腦片細胞，電極要不要拋光？對于腦片記錄來說，最好給電極拋光。單細胞記錄則根據(jù)自身情況決定。顯微鏡NikonOlympusZeissLeica灌流給藥系統(tǒng)震動切片機leica

膜片鉗相關設備\軟件的具體操作怎樣連接放大器和Digitizer？信號線是使用BNC線。將放大器的scaled

output連接Digitizer的

ANALOG

IN

任意接口，這是采集信號。將

放大器的

COMMAND

INPUT（任意,分別對應于面板上兩個旋鈕，根據(jù)需要連接）連接Digitizer的

ANALOG

OUT

1或2

。HEADSTAGE

接電極HEAD。MultiClamp700A中，在放大器和信號器的連接中，放大器的rawoutput是否需要連接信號器的ANALOGIN接口?scaledoutput，rawoutput有什么區(qū)別?Rawoutput為原始信號輸出，放大器輸出的信