2018高中生物微生物培養(yǎng)技術(shù)第3節(jié)測(cè)定微生物的數(shù)量學(xué)業(yè)達(dá)標(biāo)測(cè)評(píng)中圖版1

第三節(jié)測(cè)定微生物的數(shù)量身設(shè)“自主學(xué)習(xí)-基礎(chǔ)知識(shí)身設(shè)“自主學(xué)習(xí)-基礎(chǔ)知識(shí)I接受信息掌握基礎(chǔ)一、測(cè)定微生物數(shù)量的方法測(cè)定微生物數(shù)量的方法可分為兩類(lèi)：直接計(jì)數(shù)法和間接計(jì)數(shù)法。前者常用的是顯微鏡直接計(jì)數(shù)法，這種方法是先將待測(cè)樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。該方法適用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。后者最常用的是稀釋平板計(jì)數(shù)法，需要將待測(cè)樣品配制成均勻的系列稀釋液并使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基中出現(xiàn)的菌落數(shù)，從而推算出樣品中的活菌數(shù)。II思考交流||II思考交流||利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)出的菌體數(shù)與平板計(jì)數(shù)法相比哪個(gè)多些？【提示】血球計(jì)數(shù)板測(cè)出的是全部菌體數(shù)，而平板計(jì)數(shù)法只能測(cè)出活菌數(shù)，而且比實(shí)際數(shù)偏少。二、間接計(jì)數(shù)法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì).制備土壤稀釋液取土壤表層5^10cm處的土樣。準(zhǔn)確稱(chēng)取1g土樣，放入盛有99mL無(wú)菌水的錐形瓶中，振蕩20min后制成101倍的稀釋液。然后進(jìn)行系列稀釋?zhuān)玫?03、10，、105、106倍的系列稀釋菌液。.取樣及倒平板.培養(yǎng).觀察記錄某稀釋倍數(shù)的菌落平均數(shù)(1)計(jì)數(shù)時(shí)對(duì)于細(xì)菌、放線(xiàn)菌以每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)有30?300個(gè)菌落為宜，霉菌以每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)有皿?100個(gè)菌落為宜。某稀釋倍數(shù)的菌落平均數(shù)⑵計(jì)算每克樣品菌數(shù)公式為：每克土壤樣品菌數(shù)=細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)瀛的稀釋液體積乂稀釋倍數(shù)。疑難問(wèn)題卡片預(yù)習(xí)完成后，請(qǐng)把你認(rèn)為難以解決的問(wèn)題記錄在下面的表格中問(wèn)題1問(wèn)題2

問(wèn)題3問(wèn)題4以固園合作探究-重難疑點(diǎn)以固園合作探究-重難疑點(diǎn)步步探究吸收內(nèi)化ZHONGNANTUPO突破一、微生物生長(zhǎng)量的測(cè)定1.測(cè)重量法干重法：將單位體積待測(cè)的培養(yǎng)液離心后，用清水洗滌1?5次，放入干燥器中加熱干燥，加熱溫度一般在100?105c之間，再稱(chēng)重。以細(xì)菌為例，一個(gè)細(xì)胞一般重約10-12?10-13g,也可在較低溫度（如40℃）下進(jìn)行真空干燥。濕重法：將一定量的菌懸液離心或過(guò)濾，得到菌體，反復(fù)洗滌后稱(chēng)濕重，干重一般為濕重的20%?25%。2.計(jì)數(shù)法（1）直接計(jì)數(shù)法這種方法是利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點(diǎn)是不能區(qū)分死菌與活菌。計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，上面有一個(gè)特定的面積1mm2和高0.1mm的計(jì)數(shù)室，在1mm2的面積里又被劃分成25個(gè)（或16個(gè)）中格，每個(gè)中格進(jìn)一步劃分成16個(gè)（或25個(gè)）小格，但計(jì)數(shù)室都是由400個(gè)小格組成。將稀釋的樣品滴在計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)4?5個(gè)中格的細(xì)菌數(shù)，并求出每個(gè)小格所含細(xì)菌的平均數(shù)，再按下面公式求出每毫升樣品所含的細(xì)菌數(shù)。每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)=每小格平均細(xì)菌數(shù)X400X1000X稀釋倍數(shù)（2）間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）稀釋平板涂布法，常用來(lái)統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌數(shù)。此法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說(shuō)一個(gè)菌落即代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)先將待測(cè)樣品做一系列稀釋?zhuān)偃∫欢康南♂尵航臃N到培養(yǎng)皿上，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可換算出樣品中的含菌數(shù)。說(shuō)明：①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30?300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②將待測(cè)樣品經(jīng)一系列10倍稀釋?zhuān)缓筮x擇三個(gè)稀釋度的菌液，分別取0.1mL接種到已制備好的平板上，然后用無(wú)菌涂布器將菌液涂布整個(gè)平板表面，放入適宜的溫度下培養(yǎng)計(jì)算菌落數(shù)。為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平板中，經(jīng)涂布、培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來(lái)表示。④涂布平板法所選擇倒平板的稀釋度很重要，一般以三個(gè)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。每克樣品中的菌落數(shù)=(C：V)XM,其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL),M代表稀釋倍數(shù)。二、測(cè)定土壤中的微生物數(shù)量土壤中生活的微生物種類(lèi)和數(shù)量是極其豐富的，這些數(shù)量眾多的微生物對(duì)提高土壤肥力有重要作用。因此，測(cè)定土壤的含菌量可以作為判定土壤肥力的一個(gè)重要指標(biāo)。.實(shí)驗(yàn)原理平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)定的微生物樣品按比例作一系列稀釋后，將其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，吸取一定量某幾個(gè)稀釋度的菌液接種到平板上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成單個(gè)菌落，根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣接種量和菌落數(shù)即可換算出樣品的含菌數(shù)。.材料用具土壤樣品：尿素，酵母粉，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉、酚紅、瓊脂，1mol/LNaOH溶液，無(wú)菌吸管，盛有9mL無(wú)菌水的試管，盛有90mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的錐形瓶，試管架，無(wú)菌培養(yǎng)皿，記號(hào)筆，燒杯等。.方法步驟(1)制備尿素固體培養(yǎng)基準(zhǔn)確稱(chēng)取尿素20g,酵母粉0.1g,磷酸二氫鉀9.1g,磷酸氫二鈉9.5g,酚紅0.01g,瓊脂20g,依次加入盛有900mL蒸餾水的燒杯中，加熱溶解后，用1mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.2?7.4,補(bǔ)加蒸餾水至1000mL。(2)制備土壤樣品稀釋液稱(chēng)取土樣10目，放入盛有90mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的錐形瓶中，振蕩約20min,使土樣和水充分混合，將土壤懸液制成10-1、10-2、10-3、10—4、10—5、10-6不同稀釋度的稀3釋液。制備土壤樣品稀釋液時(shí)應(yīng)注意每個(gè)吸管只能接觸一個(gè)濃度的稀釋液，且取樣前需充分搖勻。(3)加樣取10套無(wú)菌培養(yǎng)皿，取10-4、10-5和10-6每種稀釋度做3個(gè)重復(fù)平板，留下一個(gè)平板作空白對(duì)照。分別用1mL無(wú)菌移液管精確吸取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度菌懸液各0.2mL,加至相應(yīng)編號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中(如圖)。微生物數(shù)量測(cè)定的流程圖(4)倒平板將菌液移入培養(yǎng)皿后立即倒入溶化并冷卻至45℃左右的尿素培養(yǎng)基(倒入量約15mL),隨即快速晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液和培養(yǎng)基充分混勻后平置，待凝。(5)培養(yǎng)待平板完全凝固后，倒置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)。(6)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)培養(yǎng)48h后取出平板，統(tǒng)計(jì)各皿中的菌落數(shù)，將結(jié)果記錄在表格中，計(jì)算結(jié)果時(shí)，應(yīng)選取每皿菌落數(shù)在30?300(如圖)的一組平板為代表進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。太多偏多合適太少每皿菌落數(shù)示意圖⑺計(jì)算樣品中菌數(shù)的公式每克樣品的菌數(shù)=同一稀釋度的菌落平均數(shù)：0.2：稀釋度X10Ml ……? 直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)菌數(shù)

在探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量變化的實(shí)驗(yàn)中，需利用計(jì)數(shù)板對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板是一個(gè)特制的可在顯微鏡下觀察的玻片，樣品就滴在計(jì)數(shù)室內(nèi)。計(jì)數(shù)室由25X16=400個(gè)小室組成，容納液體總體積為0.1mm3。某同學(xué)操作時(shí)將1mL酵母菌樣品加99mL無(wú)菌水稀釋?zhuān)脽o(wú)菌吸管吸取少許使其自行滲入計(jì)數(shù)室，蓋上蓋玻片并用濾紙吸去多余菌液，進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。I十計(jì)數(shù)室放大⑻正面圖I十計(jì)數(shù)室放大⑻正面圖 ?(b)縱切面圖(1)在實(shí)驗(yàn)中，某同學(xué)的部分實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程是這樣的：①?gòu)撵o置試管中吸取酵母菌培養(yǎng)液加入計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并記錄數(shù)據(jù)；②把酵母菌培養(yǎng)液放置在冰箱中；③第七天再取樣計(jì)數(shù)，記錄數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析繪成曲線(xiàn)。請(qǐng)糾正該同學(xué)實(shí)驗(yàn)操作中的3處錯(cuò)誤：①。②。③。(2)在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)該對(duì)計(jì)數(shù)板、吸管等器具進(jìn)行處理。(3)如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過(guò)多，難以數(shù)清，應(yīng)采取的措施是。(4)如果觀察到如圖所示a、b、c、d、e5個(gè)大格共80個(gè)小室內(nèi)共有酵母菌48個(gè)，則上述1mL酵母菌樣品中約有酵母菌個(gè)；要獲得較為準(zhǔn)確的數(shù)值，減少誤差，你認(rèn)為該怎么做？?！窘馕觥繉?duì)各小題逐項(xiàng)分析如下題號(hào)分析(1)在從試管中吸取酵母菌之前，應(yīng)將試管輕輕振蕩幾次，目的是使酵母菌在培養(yǎng)液中均勻分布。酵母菌的培養(yǎng)液應(yīng)置于適宜條件下，并且每隔24小時(shí)就要統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目(2)為了避免雜菌污染，實(shí)驗(yàn)中所用吸管、計(jì)數(shù)板等器具需進(jìn)行滅菌處理(3)(4)解答時(shí)要注意以下兩點(diǎn)：①統(tǒng)一單位；②注意體積的變化。400個(gè)小室共容納液體總體積為0.1mm3,則U80個(gè)小格容納體積為：2X10-2mm3,含酵母菌48個(gè)，又因酵母菌培養(yǎng)液總體積為100mL,統(tǒng)一單位后即可求出酵母菌個(gè)數(shù)【答案】(1)①應(yīng)將試管輕輕振蕩幾次再吸取酵母菌培養(yǎng)液進(jìn)行計(jì)數(shù)②應(yīng)將酵母菌培養(yǎng)液放置在適宜溫度下培養(yǎng)

③應(yīng)連續(xù)七天，每天觀察、取樣計(jì)數(shù)并記錄數(shù)據(jù)⑵滅菌（3）適當(dāng)稀釋?zhuān)?）2.4X108多次計(jì)數(shù)，求平均值)B.偏高分序列。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)10g土壤樣品逐級(jí)僚M甲)B.偏高分序列。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)10g土壤樣品逐級(jí)僚M甲1.上題中某同學(xué)用一支移液管連續(xù)三次取1mL菌液進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)程如圖）中間忘記沖洗移液管，計(jì)數(shù)結(jié)果將（A.偏低C.不變D.C.不變【解析】由于移液管未沖洗，下一次使用時(shí)會(huì)帶有上次的高濃度菌液，使計(jì)數(shù)結(jié)果偏高?！敬鸢浮緽圖甲是從土壤中篩選產(chǎn)脲酶細(xì)菌的過(guò)程，圖乙是脲酶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA部???CUGAGUGAGAAAUUUGGU???271（表示從起始密碼開(kāi)始算起的堿基序號(hào)）（1）圖中選擇培養(yǎng)基應(yīng)以為唯一氮源;鑒別培養(yǎng)基還需添加作指示劑，產(chǎn)脲酶細(xì)菌在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，其菌落周?chē)闹甘緞⒆兂缮?。?）在5個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液0.1mL,培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191。該過(guò)程采取的接種方法是,每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為X108個(gè)；與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法相比，此計(jì)數(shù)方法測(cè)得的細(xì)菌數(shù)較 。（3）現(xiàn)有一菌株的脲酶由于基因突變而失活，突變后基因轉(zhuǎn)錄的mRNA在圖乙箭頭所示位置增加了70個(gè)核甘酸，使圖乙序列中出現(xiàn)終止密碼（終止密碼有UAG、UGA和UAA）。突變基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中，終止密碼為，突變基因表達(dá)的蛋白含個(gè)氨基酸。【審題導(dǎo)析】

細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

誤差分析【精講精析】（1）脲酶能夠催化尿素水解釋放出氨和二氧化碳，因此選擇培養(yǎng)基中應(yīng)以尿素為唯一氮源。挑取單菌落接種到加有酚紅指示劑的鑒別培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時(shí)間后，菌落周?chē)陌痹黾?，pH升高，酚紅指示劑將變紅。（2）該過(guò)程采取的接種方法為稀釋涂布平板法。利用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)選擇菌落數(shù)在30?300的平板，因此平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落平均數(shù)為（156+178+191）;3=175個(gè)。每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)為175:0.1X105=1.75X108。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法能將死細(xì)胞計(jì)算在內(nèi)，而稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法只能計(jì)數(shù)活細(xì)胞（只有活細(xì)胞才能在平板上生長(zhǎng)），故一般血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法要比稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果大。（3）箭頭處插入70個(gè)核甘酸，箭頭后密碼子的解讀方式為*AG,UGA,GAA……對(duì)比3種終止密碼可發(fā)現(xiàn)，此處的終止密碼為UGA。從起始密碼到終止密碼之前共有273+72個(gè)堿基，因此突變基因表達(dá)的蛋白含115個(gè)氨基酸?！敬鸢浮浚?）尿素酚紅紅（2）稀釋涂布平板法1.75少（3）UGA115稀釋平板計(jì)數(shù)法的誤差分析（1）稀釋時(shí)移液管不沖洗，偏大；（2）平板中菌落數(shù)太多，（可能重復(fù)）偏小；（3）稀釋時(shí)未混合均勻，可能大可能小。―變苴訓(xùn)練.在做土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，甲組實(shí)驗(yàn)用氮源只含尿素的培養(yǎng)基，乙組實(shí)驗(yàn)用氮源除含尿素外還含硝酸鹽的培養(yǎng)基，其他成分都相同，在相同條件下操作、培養(yǎng)與觀察，則乙組實(shí)驗(yàn)屬于（）A.空白對(duì)照 B.標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照C.相互對(duì)照 D.條件對(duì)照【解析】本實(shí)驗(yàn)甲組為實(shí)驗(yàn)組，乙組為對(duì)照組，給實(shí)驗(yàn)組某種處理，給對(duì)照組另一條件的處理，為條件對(duì)照。【答案】D一附圖當(dāng)堂落實(shí)，雙基達(dá)標(biāo) |隨堂訓(xùn)練夯實(shí)基礎(chǔ).噬菌斑（如圖1）是在長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)菌的培養(yǎng)基上，由一個(gè)噬菌體侵染細(xì)菌后不斷裂解細(xì)菌產(chǎn)生的一個(gè)不長(zhǎng)細(xì)菌的透明小圓區(qū)，它是檢測(cè)噬菌體數(shù)量的重要方法之一?，F(xiàn)利用培養(yǎng)基培養(yǎng)并連續(xù)取樣的方法，得到噬菌體在感染大腸桿菌后數(shù)量的變化曲線(xiàn)（如圖2）,對(duì)該曲線(xiàn)的敘述正確的是（）A.曲線(xiàn)a?b段噬菌體數(shù)量不變，說(shuō)明噬菌體還沒(méi)有開(kāi)始侵染細(xì)菌B.曲線(xiàn)a?b段，細(xì)菌內(nèi)正旺盛地進(jìn)行細(xì)菌DNA的復(fù)制和有關(guān)蛋白質(zhì)的合成C.曲線(xiàn)b?c段所對(duì)應(yīng)的時(shí)間內(nèi)噬菌體共繁殖了10代D.限制c?d段噬菌斑數(shù)量增加的因素最可能是絕大部分細(xì)菌已經(jīng)被裂解【解析】圖中a?b段噬菌斑已有一定數(shù)量，說(shuō)明噬菌體已開(kāi)始侵染細(xì)菌。b?c段噬菌斑增加了10倍，說(shuō)明噬菌體數(shù)約增加了10倍，而噬菌體繁殖10代，噬菌體數(shù)目應(yīng)增加到210倍。c?d段噬菌斑數(shù)目增加減緩，很可能由于絕大多數(shù)宿主細(xì)菌細(xì)胞已被裂解。【答案】D.菌種鑒定的重要依據(jù)是（）A.細(xì)菌的大小、形狀和顏色B.菌落的大小、形狀、顏色C.有無(wú)鞭毛D.培養(yǎng)基的不同【解析】不同種類(lèi)的細(xì)菌所形成的菌落在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一定特征，所以，每種細(xì)菌在一