色譜指紋圖譜評價

中藥色譜指紋圖譜

操作規(guī)范與評價探討祝晨蔯博士教授廣州中醫(yī)藥大學中藥學院zhuchenchen@2023/1/141主要內(nèi)容◆

色譜指紋圖譜的緣起、屬性、特點和作用◆

中藥色譜指紋圖譜方法學◆

中藥色譜指紋圖譜試驗的規(guī)范化◆

中藥色譜指紋圖譜的定性評價方法◆

應用實踐2023/1/142◆

色譜指紋圖譜的緣起、屬性、特點和作用2023/1/143中藥質(zhì)量控制現(xiàn)狀《中國藥典》關于藥材所收錄的信息【浸出物】【炮制】【性味與歸經(jīng)】【名稱】【性狀】【鑒別】【檢查】【含量測定】【功能與主治】【用法與用量】【貯藏】【來源】宏觀特征鑒別微觀特征鑒別生藥學動物分類學植物分類學礦物學微生物分類學藥物分析學經(jīng)驗鑒別定性鑒別含量測定指標成分、對照藥材2023/1/144齊墩果酸、熊果酸、大黃酸、槲皮素、小檗堿目前中藥質(zhì)量控制的局限●缺乏化學對照品●化學對照品缺乏專屬性●物質(zhì)群體間的量化特征無法體現(xiàn)黃柏、黃連——小檗堿、巴馬亭的比例人參、西洋參或三七——幾種人參皂苷的比例●中藥整體的用藥的特色無法體現(xiàn)2023/1/145中藥色譜指紋圖譜的提出●

中藥依賴其所含的多種化學成份發(fā)揮療效●

任何單一的活性成份或指標成份都難以有效地評價中藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣●

利用現(xiàn)代分析技術分析不同中（成）藥的整體特征以提高鑒別的準確性——色譜指紋圖譜分析（ChromatographicFingerprintAnalysis）——梁逸增（中南大學）

2023/1/146中藥色譜指紋圖譜的特點及屬性

中藥指紋圖譜同傳統(tǒng)鑒別方法的區(qū)別在于：它不是從一個“點”，而是從一個二維的“面”（一個在特定條件下的完整色譜的整體特征信息）來鑒別真?zhèn)?，同時在定量操作的前提下，得到“量”方面的信息還可以估量待測樣品之間總體量的差別，從而從量的角度給以動態(tài)的質(zhì)量評價。

色譜指紋圖譜不強調(diào)個體的絕對唯一性，而強調(diào)統(tǒng)一藥材群體的相似性，及物種群體內(nèi)的唯一性2023/1/147中藥色譜指紋圖譜的特點及屬性整體性模糊性對照樣品與待測樣品指紋圖譜的相似性，而不是完全相同比較色譜的“完整面貌”，在不同環(huán)境的樣品色譜中搜索和提取與該藥材指紋圖譜“面貌”相關的特征，加以區(qū)別因此，中藥色譜指紋圖譜強調(diào)的是準確的辨認，而不是精確的計算2023/1/148◆

中藥色譜指紋圖譜方法學2023/1/149柱色譜ColumnChromatography平面色譜PlanarChromatography液相色譜LiquidChromatography(LC)氣相色譜GasChromatography(GC)薄層色譜ThinLayerChromatography(TLC)毛細管電泳CapillaryElectrophoresis（CE）2023/1/1410反相高效液相色譜(RP-HPLC)ReversedPhaseHighPerformanceLiquidChromatography●適用范圍廣●分離性能好●分析速度快●流動相選擇范圍寬●靈敏度高●色譜柱可多次重復使用●流出組分可以收集●采用多種檢測器，可同時獲取保留值信息和化合物的光譜、值譜信息對較為復雜的色譜實驗條件要求比較苛刻，由此帶來不同實驗室之間重現(xiàn)性的難度增大2023/1/1411薄層色譜ThinLayerChromatography(TLC)●可在同板同時分析多達18個樣品，時效高●所用的是正相展開劑，其組成變化靈活，可適應多種成分的分離●離線操作，即可直觀比較圖譜，又可掃描得到輪廓圖和處理數(shù)據(jù)●占機時間短●具有色彩參數(shù)，可獲得色彩豐富的色譜圖像，直觀性強；同時輔以功能團顯色劑還可提示成分的類別，提高鑒別的專屬性?！裾咕嗑窒拊?0cm~20cm

，‘柱效’相對較低，對復雜組分不提高分離度則難以提取指紋特征的藥材受到限制?！耖_放系統(tǒng)，對環(huán)境溫度、相對濕度要求較高2023/1/1412氣相色譜GasChromatography(GC)●分離效能高●分析速度快●適用于植物的揮發(fā)油成分及其它易揮發(fā)性成分或可轉化為可揮發(fā)的成分測定●可提供保留值信息，與質(zhì)譜聯(lián)用，還可提供更豐富的化學結構信息分辨率高，得到的色譜組份非常復雜，尤其是含揮發(fā)油藥材，單萜類成分組成很不穩(wěn)定，樣品間差異可能很大，處理數(shù)據(jù)和判別相似度時一定程度的取舍毛細管電泳CapillaryElectrophoresis●分離效能高●分析速度快●高分辨率●可與紫外、熒光、電化學、質(zhì)譜、拉曼光譜等聯(lián)用，可提供更豐富的化學結構信息2023/1/1413◆

中藥色譜指紋圖譜試驗的規(guī)范化2023/1/1414中藥指紋圖譜的建立指紋圖的獲取方法驗證指紋圖的校驗和復核中藥材指紋圖譜飲片指紋圖譜中藥提取物指紋圖譜中藥生產(chǎn)中間產(chǎn)品指紋圖譜中藥各類制劑和相關產(chǎn)品指紋圖譜中藥指紋圖譜2023/1/1415指紋圖譜的獲取指紋圖譜建立和辨識指紋圖譜試驗研究對照品（參比物）供試品收集供試品制備2023/1/1416供試品的收集真實性、代表性；收集量不少于10批原始紀錄藥材名稱供試品來源藥材名稱收集時間及收集人貨源情況調(diào)查基原鑒定及鑒定人質(zhì)量評估供試品的留樣、貯藏和標簽◆

原料藥材2023/1/1417◆

半成品原始紀錄半成品名稱混批前批號日期提取方法（關鍵技術）混批后批號中藥指紋圖譜供試品的留樣、貯藏和標簽2023/1/1418◆

成品原始紀錄供試品批號生產(chǎn)單位供試品數(shù)量供試品的留樣、貯藏和標簽2023/1/1419供試品制備取樣稱樣制備定容放置標簽避光、低溫、密閉容器條件下短期放置標示濃度溶劑萃取、固相萃取、其他方法供試品與選樣1:10具有代表性與藥材標號一致2023/1/1420對照品（參照物）◆

對照品（參照物）的作用

考察指紋圖譜的穩(wěn)定程度和重現(xiàn)性有助于指紋圖譜的辨認◆

對照品（參照物）的選擇供試品種的活性成分或指標成分指紋圖譜中的穩(wěn)定的指紋峰內(nèi)標物◆

對照品（參照物）溶液制備2023/1/1421色譜方法選擇的原則?

專屬性

建立的指紋圖譜必須能夠表達該品種的特征?

重現(xiàn)性

同一品種同一樣品指紋圖譜中構成指紋特征的各特征峰（或斑點）作為整體（峰位、峰數(shù)、峰的豐度、各峰的大致比例）在不同實驗室和不同操作者之間得到的色譜整體特征應有較高的相似度?

普遍適用性

色譜方法和實驗條件應易于推廣和便于操作指紋圖譜的實驗研究2023/1/1422中藥指紋圖譜實驗研究的基本要求?

實驗室基本要求●實驗室應具備承擔指紋圖譜測定的總體能力●

試驗設備通過檢驗證明符合指紋圖譜實驗研究的需要●

技術人員具備從事指紋圖譜實驗研究的能力●

對實驗室的技術能力評價應由定期的內(nèi)部獨立檢查●試驗數(shù)據(jù)有可追溯，與其它實驗室有可比性●實驗室應有質(zhì)量保證體系，以確保各種措施的透明與一致2023/1/1423?

儀器

性能能夠滿足指紋圖譜實驗需要需經(jīng)校驗?

試驗方法和試驗條件優(yōu)選的目的

選取相對簡單易行的方法和條件，獲取足以代表品種特征的指紋圖譜，以滿足指紋圖譜的專屬性、重現(xiàn)性和普遍適用性的需要2023/1/1424試驗需考察的內(nèi)容?

液相色譜

●

色譜柱：比較試驗加以選擇2023/1/1425●

流動相：至少用三種不同組成比較流動相1流動相2流動相32023/1/1426●

適宜的柱溫和檢測波長2023/1/1427?

薄層色譜

●

展開劑系統(tǒng)：至少需作三種進行比較●

考察濕度和溫度的影響2023/1/1428?

氣相色譜

●色譜柱：選擇適宜色譜柱●升溫程序設定樣品的預處理不同提取方法比較樣品預處理前后比較2023/1/1429中藥指紋圖譜的方法驗證?

目的

考察和證明采用的指紋圖譜測定方法具有可靠性和可重復性，符合指紋圖譜的要求。?

驗證內(nèi)容

●

專屬性

●準確度（結果準確度和系統(tǒng)準確度）

●精密度（重復性、中間精密度、重現(xiàn)性）

●范圍

●穩(wěn)健性（耐用性）2023/1/1430●

專屬性（Specificity）

指紋圖譜的測定方法對中藥樣品的分析鑒定能力專屬性的考察參數(shù)

＆峰純度

＆總峰響應值

＆容量因子分布

＆最難分離物質(zhì)對的分離情況

＆總分離效能

此外，還需評價有關樣品（藥材、中間體、制劑和相關產(chǎn)品）見的相關性，并盡可能顯示出樣品中特征響應2023/1/1431●

準確度（Accuracy）

測定系統(tǒng)所的指紋圖譜與“對照用指紋圖譜”之間的相近程度

系統(tǒng)準確度儀器的操作指標與波動范圍樣品在分析系統(tǒng)中的殘留和對基線的響應色譜分離情況（峰純度、再現(xiàn)程度、峰型變化描述）指標成分的定量內(nèi)容結果準確度

多批次（10批以上）樣品測定結果的相似度2023/1/1432●

精密度（Precision）

規(guī)定條件下對均質(zhì)樣品多次取樣進行一系列檢測結果有相近程度（離散度）

重復性（Repeatability）

同樣的操作條件下在較短的時間間隔的精密度線性范圍內(nèi)至少測定9次或100％的試驗濃度下測定6次

中間精密度（IntermediatePrecision）

實驗室內(nèi)部條件改變測定的精密度

重現(xiàn)性（Reproducibility）

不同實驗室間的精密度2023/1/1433●

范圍（Range）

樣品中被分析組分的較高濃度和較低濃度的一個區(qū)間，并已證實在此區(qū)間內(nèi)，該方法具有合適的準確度和精密度

相似度維持在0.9以上的濃度范圍位指紋圖譜測定范圍●

穩(wěn)健性（Robustness）

不同條件下分析同一樣品所得結果的變化程度，是中藥指紋圖譜測定方法耐受環(huán)境變化的顯示2023/1/1434指紋圖譜實驗操作規(guī)程◆

高效液相色譜指紋圖譜實驗操作規(guī)程◆薄層色譜指紋圖譜實驗操作規(guī)程◆氣相色譜指紋圖譜實驗操作規(guī)程◆毛細管電泳指紋圖譜實驗操作規(guī)程2023/1/1435◆

中藥色譜指紋圖譜的定性評價方法2023/1/1436中藥指紋圖譜整體評價方法面臨的難題?沒有足夠的標樣，能否進行可靠的中藥多組份的定性定量分析？能否建立起基于中藥的色譜指紋圖譜中要質(zhì)量的評價標準？?如何對待色譜峰保留時間的漂移？?如何對待色譜分析儀器的背景與基線的漂移？?如何選取合適的內(nèi)標化合物？如果難于選取，是否存在其他的方法來解決此問題??如何處理色譜圖中大量的未知成分2023/1/1437中藥指紋圖譜的信息意義

表達中藥復雜混合體系中各種不同化學成分濃度分布的整體狀況中藥指紋圖譜的標準建立與矢量相似度