第六章-發(fā)酵工程

第四章

發(fā)酵工程第一節(jié)發(fā)酵工程概況第二節(jié)微生物工業(yè)菌種與培養(yǎng)基第三節(jié)發(fā)酵操作方法與工藝控制第四節(jié)發(fā)酵產(chǎn)物的下游加工過(guò)程第五節(jié)發(fā)酵工程的應(yīng)用第六節(jié)代謝調(diào)控和代謝工程第七節(jié)發(fā)酵與產(chǎn)物分離偶聯(lián)第一節(jié)發(fā)酵工程概況發(fā)酵工程的定義發(fā)酵工程反應(yīng)過(guò)程的特點(diǎn)發(fā)酵工程的內(nèi)容和發(fā)展1.發(fā)酵工程的定義發(fā)酵：利用微生物在有氧和無(wú)養(yǎng)條件下的生命活動(dòng)來(lái)制備微生物菌體或其代謝產(chǎn)物的過(guò)程發(fā)酵工程：發(fā)酵工程是生物技術(shù)的重要組成部分，是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的重要環(huán)節(jié)。它將微生物學(xué)、生物化學(xué)和化學(xué)工程的基本原理有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，是一門利用微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)來(lái)生產(chǎn)各種有用物質(zhì)的工程技術(shù)。由于它以培養(yǎng)微生物為主，所以又稱微生物工程。發(fā)酵產(chǎn)品：人干擾素、乙肝疫苗、心活素、紅細(xì)胞生成素、血凝因子、青霉素?；浮⒊衫w維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等等2.發(fā)酵工程反應(yīng)過(guò)程的特點(diǎn)a.反應(yīng)條件溫和b.原料來(lái)源廣泛:原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物為主，可以是農(nóng)副產(chǎn)品、工業(yè)廢水或可再生資源(植物秸稈、木屑等)，微生物本身能有選擇地?cái)z取所需物質(zhì)。

c.反應(yīng)以生命體的自動(dòng)調(diào)節(jié)方式進(jìn)行，若干個(gè)反應(yīng)過(guò)程能夠像單一反應(yīng)一樣，在單一反應(yīng)器內(nèi)很容易地進(jìn)行d.發(fā)酵產(chǎn)品多為小分子，但能很容易的生產(chǎn)出復(fù)雜的高分子化合物e.高度選擇性的進(jìn)行復(fù)雜化合物在特定部位的反應(yīng)f.發(fā)酵液一般對(duì)生物體無(wú)害g.易發(fā)生雜菌污染h.通過(guò)菌種改良，可以利用原有設(shè)備較大幅度的提高生產(chǎn)水平需注意的一些問(wèn)題1.副產(chǎn)物的產(chǎn)生，造成提取和精制的困難2.活細(xì)胞的反應(yīng)，細(xì)胞容易發(fā)生變異，影響反應(yīng)物的生成率，不易控制3準(zhǔn)備工作量大，花費(fèi)高4.底物濃度不能過(guò)高，要使用較大反應(yīng)器5廢水具有較高的BOD/COD(水質(zhì)生物耗氧量和化學(xué)需氧量）,需進(jìn)行處理3.發(fā)酵工程的研究?jī)?nèi)容內(nèi)容：生產(chǎn)菌種的選育、發(fā)酵條件的優(yōu)化與控制、反應(yīng)器的設(shè)計(jì)及產(chǎn)物的分離、提取與精致等過(guò)程有價(jià)值的發(fā)酵產(chǎn)物：微生物菌體本身；菌體代謝產(chǎn)物；菌體或酶系實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化得到的產(chǎn)物發(fā)酵工程的內(nèi)容發(fā)酵工程的內(nèi)容是隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展而不斷擴(kuò)大和充實(shí)的?，F(xiàn)代的發(fā)酵工程不僅包括菌體生產(chǎn)和代謝產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)，還包括微生物機(jī)能的利用。其主要內(nèi)容包括生產(chǎn)菌種的選育、發(fā)酵條件的優(yōu)化與控制、反應(yīng)器的設(shè)計(jì)及產(chǎn)物的分離、提取與精制等。目前已具有生產(chǎn)價(jià)值的發(fā)酵類型有微生物菌體發(fā)酵、微生物酶發(fā)酵、微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵、微生物的轉(zhuǎn)化發(fā)酵和生物工程細(xì)胞的發(fā)酵五種。(一)微生物菌體發(fā)酵

微生物菌體發(fā)酵是以獲得具有某種用途菌體為目的的發(fā)酵。比較傳統(tǒng)的菌體發(fā)酵工業(yè)，有用于面包制作的酵母發(fā)酵及用于人類或動(dòng)物食品的微生物菌體蛋白發(fā)酵兩種類型。新的菌體發(fā)酵可用來(lái)生產(chǎn)一些藥用真菌，如香菇類、依賴蟲(chóng)蛹而生存的冬蟲(chóng)夏草菌、與天麻共生的密環(huán)菌以及從多孔菌科的茯苓菌獲得的名貴中藥茯苓和擔(dān)子真菌的靈芝等藥用菌。這些藥用真菌可以通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)的手段來(lái)生產(chǎn)出與天然產(chǎn)品具有同等療效的產(chǎn)物。有的微生物菌體還可用做生物防治劑，如蘇云金桿菌、蠟樣芽孢桿菌和側(cè)孢芽孢桿菌，其細(xì)胞中的伴孢晶體可毒殺鱗翅目、雙翅目的害蟲(chóng)。絲狀真菌的白僵菌、綠僵菌可防治松毛蟲(chóng)等。所以，某些微生物的劑型產(chǎn)品，可制成新型的微生物殺蟲(chóng)劑，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。因此，菌體發(fā)酵工業(yè)還包括微生物殺蟲(chóng)劑的發(fā)酵。(二)微生物酶發(fā)酵酶普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中。最初，人們都是從動(dòng)物、植物的組織中提取酶，但現(xiàn)在，工業(yè)應(yīng)用的酶大多來(lái)自微生物發(fā)酵。微生物酶制劑有廣泛的用途。食品和輕工業(yè)中常用到微生物酶制劑，如微生物生產(chǎn)的淀粉酶和糖化酶用于生產(chǎn)葡萄糖，氨基?；覆鸱职被岬?。酶也用于醫(yī)藥生產(chǎn)和醫(yī)療檢測(cè)中，如青霉素?；赣脕?lái)生產(chǎn)半合成青霉素所用的中間體6—氨基青霉烷酸，膽固醇氧化酶用于檢查血清中膽固醇的含量，葡萄糖氧化酶用于檢查血中葡萄糖的含量等，角蛋白酶(keratinase)有助于傷口去痂和上皮再生，角蛋白酶還用于皮革脫毛鞣制、配制潤(rùn)膚露、浴皂、洗發(fā)水和脫毛膏等美容品。因此角蛋白酶是外科手術(shù)后刀口縫合不留痂、燒傷病人上皮再生的特效藥，也是皮革鞣制和美容美發(fā)的主要生化原材料等。(三)微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵微生物代謝產(chǎn)物的種類很多，已知的有37個(gè)大類下表，其中16類屬于藥物。在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所產(chǎn)生的產(chǎn)物，如氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、核酸、糖類等，是菌體生長(zhǎng)繁殖所必需的，這些產(chǎn)物叫做初級(jí)代謝產(chǎn)物。許多初級(jí)代謝產(chǎn)物在經(jīng)濟(jì)上有相當(dāng)?shù)闹匾?，分別形成了各種不同的發(fā)酵工業(yè)。在菌體生長(zhǎng)靜止期，某些菌體能合成一些具有特定功能的產(chǎn)物，如抗生素、生物堿、細(xì)菌毒素、植物生長(zhǎng)因子等。這些產(chǎn)物與菌體生長(zhǎng)繁殖無(wú)明顯關(guān)系，因而稱為次級(jí)代謝產(chǎn)物。次級(jí)代謝產(chǎn)物多為低分子量化合物，但其化學(xué)結(jié)構(gòu)類型多種多樣，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)多達(dá)47類，其中抗生素的結(jié)構(gòu)類型，按相似性來(lái)分，也有14類。由于抗生素不僅具有廣泛的抗菌作用，而且還有抗病毒、抗癌和其他生理活性，因而得到了大力發(fā)展，已成為發(fā)酵工業(yè)的重要支柱。1．致酸劑2．生物堿3．氨基酸4．動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑5．抗生素6．驅(qū)蟲(chóng)劑7．抗代謝劑8．抗氧劑9．抗腫瘤劑10．抑制球蟲(chóng)劑11．輔酶12．轉(zhuǎn)化甾醇和甾體13．乳化劑14．酶15．酶抑制劑16．脂肪酸17．鮮味增強(qiáng)劑18．除草劑19．殺蟲(chóng)劑20．離子載體21．鐵運(yùn)載因子22．脂類23．核酸24．核苷25．核苷酸26．有機(jī)酸27．滅害劑28．藥理活性物質(zhì)29．色素30．植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑31．多糖類32．蛋白質(zhì)33．溶媒34．發(fā)酵劑35．糖36．表面活性劑37．維生素(四)微生物的轉(zhuǎn)化發(fā)酵微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物細(xì)胞的一種或多種酶，把一種化合物轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相關(guān)的更有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)物?？蛇M(jìn)行的轉(zhuǎn)化反應(yīng)包括：脫氫反應(yīng)、氧化反應(yīng)、脫水反應(yīng)、縮合反應(yīng)、脫羧反應(yīng)、氨化反應(yīng)、脫氨反應(yīng)和異構(gòu)化反應(yīng)等。最古老的生物轉(zhuǎn)化，就是利用菌體將乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸的醋酸發(fā)酵。生物轉(zhuǎn)化還可用于把異丙醇轉(zhuǎn)化成丙醇，甘油轉(zhuǎn)化成二羥基丙酮，葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸，還可將葡萄糖酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成2一酮基葡萄糖酸或5一酮基葡萄糖酸，將山梨醇轉(zhuǎn)變成L一山梨糖。此外，微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵還包括甾類轉(zhuǎn)化和抗生素的生物轉(zhuǎn)化等。(五)生物工程細(xì)胞的發(fā)酵生物工程細(xì)胞的發(fā)酵是指利用生物工程技術(shù)所獲得的細(xì)胞，如DNA重組的工程菌(engineeringstrain)、細(xì)胞融合所得的雜交細(xì)胞等進(jìn)行培養(yǎng)的新型發(fā)酵，其產(chǎn)物多種多樣。如用基因工程菌生產(chǎn)胰島素、干擾素、青霉素?；傅?，用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)用于治療和診斷的各種單克隆抗體等。第二節(jié)微生物工業(yè)菌種與培養(yǎng)基真核生物：細(xì)胞含有具體的細(xì)胞核，細(xì)胞核有核膜、核仁和染色體，如原生動(dòng)物、單細(xì)胞藻類、真菌等。原核生物：細(xì)胞含有不具體的細(xì)胞核，細(xì)胞核沒(méi)有核膜、核仁，遺傳物質(zhì)(DNA)不組成典型的染色體，如細(xì)菌和立克次氏藍(lán)綠藻類。非細(xì)胞微生物：病毒如噬菌體1.發(fā)酵工業(yè)對(duì)菌種的要求a.原料廉價(jià)、生長(zhǎng)迅速、代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高b.培養(yǎng)條件易于控制，所需酶活力高c.發(fā)酵周期短，生長(zhǎng)速度和反應(yīng)速度快d.菌株選擇單產(chǎn)高的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株、調(diào)節(jié)突變菌株或野生菌株e.菌株抗噬菌體能力強(qiáng)f.菌種性能穩(wěn)定，不宜變異退化g.菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素2.工業(yè)常用的微生物菌種2.1細(xì)菌2.1.1形態(tài)和大小球狀、桿狀和螺旋狀

1×10-10~1×10-9mg2.1.2屬原核生物包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)體等特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛、莢膜和芽孢2.1.3細(xì)菌的繁殖方式裂殖方式(二分裂)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，單環(huán)DNA染色質(zhì)體被復(fù)制，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等組成同時(shí)增加一倍，然后在細(xì)胞中部產(chǎn)生一橫斷間隔，染色質(zhì)體分開(kāi)，繼而間隔分裂形成細(xì)胞壁，最后形成兩個(gè)相同的子細(xì)胞。芽孢：某些細(xì)菌在其生活史的一定階段，于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)形成的一個(gè)內(nèi)生孢子一般濕熱滅菌以殺死在自然界中抗熱性最強(qiáng)的嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢為標(biāo)準(zhǔn)，

規(guī)定在121℃

滅菌15分鐘2.1.4發(fā)酵工業(yè)常用的細(xì)菌大腸桿菌、乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、醋酸桿菌等2.2放線菌2.2.1形態(tài)及構(gòu)造菌落呈放射狀屬于原核生物由菌絲體構(gòu)成，菌絲體包括基內(nèi)菌絲體（營(yíng)養(yǎng)菌絲體）和氣生菌絲體氣生菌絲體發(fā)育到一定階段形成孢子絲，然后形成孢子2.2.2放線菌的繁殖

無(wú)性孢子進(jìn)行繁殖，也可借菌絲斷裂的片斷繁殖成新的菌體其生長(zhǎng)方式是菌絲末端伸長(zhǎng)和分支，彼此交錯(cuò)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，稱為菌絲體(mycelium)。

2.2.3放線菌在微生物中的分類及地位介于細(xì)菌和絲狀真菌之間，在微生物分類位置上屬于細(xì)菌2.2.4發(fā)酵工業(yè)常用的放線菌主要用于生產(chǎn)抗生素(90%)：龜裂酶素：土霉素金霉素鏈霉菌：四環(huán)素紅霉素鏈霉菌：紅霉素其中小單胞菌屬產(chǎn)抗生素最多另外放線菌還可產(chǎn)生酶和維生素常用的放線菌主要來(lái)自以下幾個(gè)屬：鏈霉菌屬(Streptomyces)小單孢菌屬(Micromonospora)諾卡氏菌屬(Nocardia)2.3酵母2.3.1酵母的形態(tài)大小屬真菌類單細(xì)胞出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖母細(xì)胞體積長(zhǎng)大到一定程度就開(kāi)始發(fā)芽，芽長(zhǎng)大的同時(shí)母細(xì)胞縮小，在母細(xì)胞與子細(xì)胞間形成隔膜，最后形成同樣大小的母細(xì)胞與子細(xì)胞。如果子芽不與母細(xì)胞脫離就形成鏈狀細(xì)胞，稱為假菌絲(pseudomycelium)。形態(tài)：球形、橢圓形、卵圓形、檸檬形、臘腸形和菌絲狀等大小：發(fā)酵工業(yè)用酵母一般4~6μm2.3.2酵母的細(xì)胞結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞典型的細(xì)胞結(jié)構(gòu)2.3.3酵母的繁殖方式無(wú)性繁殖：芽殖和裂殖，酵母的主要繁殖方式有性繁殖：產(chǎn)生子囊和子囊孢子2.3.4工業(yè)上常用的酵母啤酒酵母卡爾斯伯酵母啤酒酵母橢圓變種德巴利氏酵母屬漢遜氏酵母畢赤氏酵母屬假絲酵母屬絲酶母屬工業(yè)主要用于釀酒、制造面包、制造低凝固點(diǎn)石油、生產(chǎn)脂肪酶，以及生產(chǎn)可食用、藥用和飼料用的酵母菌體蛋白等。

2.4霉菌2.4.1形態(tài)及構(gòu)造凡生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、網(wǎng)狀或絮狀菌絲的真菌統(tǒng)稱為霉菌(mold)。屬于真菌，亦稱絲狀真菌營(yíng)養(yǎng)體由菌絲構(gòu)成菌絲：無(wú)橫膈，整個(gè)菌絲是一個(gè)單細(xì)胞，含多個(gè)細(xì)胞核；有橫膈每一段就是一個(gè)細(xì)胞2.4.2酶菌的繁殖及生活史通過(guò)孢子繁殖,通過(guò)無(wú)性和有性方式形成孢子其生長(zhǎng)方式是菌絲末端的伸長(zhǎng)和頂端分支，彼此交錯(cuò)呈網(wǎng)狀。菌絲的長(zhǎng)度既受遺傳性的控制，又受環(huán)境的影響，其分支數(shù)量取決于環(huán)境條件。

2.4.3工業(yè)常用霉菌藻狀菌綱：根酶、毛酶、犁頭酶子囊菌綱：紅曲霉半知菌類：曲霉、青酶2.5噬菌體2.5.1特點(diǎn)、形態(tài)和化學(xué)成分形態(tài)：有頭尾之分化學(xué)成分：核酸和蛋白質(zhì)占粒子質(zhì)量90%以上，其中核酸40-50%特點(diǎn)形態(tài)微小，體積比細(xì)菌小的多

為非細(xì)胞類型，屬于病毒對(duì)寄主細(xì)胞有嚴(yán)格的專一性2.5.2生長(zhǎng)和繁殖吸附：尾部吸附侵入侵入增值成熟釋放2.5.3噬菌體的防治杜絕噬菌體生存增殖的環(huán)境條件選育和使用抗噬菌體菌株菌種輪換使用2.5.4其他微生物1．擔(dān)子菌所謂的擔(dān)子菌(basidialgerm)就是人們通常所說(shuō)的菇類微生物。擔(dān)子菌資源的利用正愈來(lái)愈引起人們的重視，如多糖、橡膠物質(zhì)和抗癌藥物的開(kāi)發(fā)。近年來(lái)，日本、美國(guó)的一些科學(xué)家對(duì)香菇的抗癌作用進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)香菇中的1，2—β—葡萄糖苷酶及兩種糖類物質(zhì)具有抗癌作用。2．藻類藻類(algae)是自然界分布極廣的一大群自養(yǎng)微生物資源，許多國(guó)家已把它用做人類保健食品和飼料。培養(yǎng)螺旋藻，按干重計(jì)算可收獲60t／hm2，而種植大豆才可獲得4t／hm2；從蛋白質(zhì)產(chǎn)率看，螺旋藻是大豆的28倍。培養(yǎng)珊列藻，從蛋白質(zhì)產(chǎn)率計(jì)算，每公頃珊列藻所得蛋白質(zhì)是小麥的20～35倍。此外，還可通過(guò)藻類將CO2轉(zhuǎn)變?yōu)槭停囵B(yǎng)單胞藻或其他藻類而獲得的石油，可占細(xì)胞干重的35％～50％，合成的油與重油相同，加工后可轉(zhuǎn)變?yōu)槠?、煤油和其他產(chǎn)品。有的國(guó)家已建立培植單胞藻的農(nóng)場(chǎng)，培植的單胞藻按35％干物質(zhì)為碳?xì)浠衔?石油)計(jì)算，每年可得石油燃料60t／hm2。此技術(shù)的應(yīng)用，還可減輕因工業(yè)生產(chǎn)而大量排放CO2造成的溫室效應(yīng),國(guó)外還有從“藻類農(nóng)場(chǎng)”獲取氫能的報(bào)道，大量培養(yǎng)藻類，利用其光合放氫作用來(lái)取得氫能。3.生物工程菌應(yīng)用基因工程技術(shù)，按照人的設(shè)計(jì)對(duì)基因或基因的部分進(jìn)行定向重組所構(gòu)建的能夠在特定的受體細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的重組微生物菌株，稱為生物工程菌(bioengineeringstrain)。如用基因工程菌生產(chǎn)胰島素、干擾素、青霉素酰化酶等，用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)用于治療和診斷的各種單克隆抗體等。3.培養(yǎng)基的制備3.1培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分及來(lái)源1.碳源：供給微生物生命活動(dòng)所需的能量和構(gòu)成菌體細(xì)胞以及代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)2.氮源：構(gòu)成微生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)和核酸的主要元素3.無(wú)機(jī)鹽和微量元素：參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成，作為酶活性中心的組成部分或維持酶的活性，調(diào)節(jié)滲透壓、PH值等4.生長(zhǎng)因子：提供微生物細(xì)胞所需要的化學(xué)物質(zhì)、輔助因子的組分和參與代謝的物質(zhì)5.水6.產(chǎn)物形成的誘導(dǎo)物、前體和促進(jìn)劑

1．碳源碳源是構(gòu)成菌體和產(chǎn)物的碳架及能量來(lái)源。常用的碳源包括各種能迅速利用的單糖(如葡萄糖、果糖)、雙糖(如蔗糖、麥芽糖)和緩慢利用的淀粉、纖維素等多糖。多糖要經(jīng)菌體分泌的水解酶分解成單糖后才能參與微生物的代謝。玉米淀粉及其水解液是抗生素、氨基酸、核苷酸、酶制劑等發(fā)酵中常用的碳源。馬鈴薯、小麥、燕麥淀粉等用于有機(jī)酸、醇等的生產(chǎn)中。霉菌和放線菌還可以利用油脂作碳源，在發(fā)酵過(guò)程中加入的油脂有消泡和補(bǔ)充碳源的雙重作用。某些有機(jī)酸、醇在單細(xì)胞蛋白、氨基酸、維生素、麥角堿和某些抗生素的發(fā)酵生產(chǎn)中也可作為碳源使用(有的是作補(bǔ)充碳源)。此外，許多石油產(chǎn)品(碳?xì)浠衔?作為微生物發(fā)酵的主要原材料正在深入研究和推廣之中，如用正十六烷作碳源發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸。2．氮源凡是構(gòu)成微生物細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮素來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，稱為氮源。它是微生物發(fā)酵中使用的主要原料之一。常用的氮源包括有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源兩大類。黃豆餅粉、花生餅粉、棉子餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、魚(yú)粉等是有機(jī)氮源，無(wú)機(jī)氮源有氨水、硫酸銨、氯化銨、硝酸鹽等。3．無(wú)機(jī)鹽和微量元素微生物的生長(zhǎng)、繁殖和產(chǎn)物形成需要各種無(wú)機(jī)鹽類(如磷酸鹽、硫酸鹽、氯化鈉、氯化鉀等)、微量元素(如鎂、鐵、鈷、鋅、錳等)。其生理功能包括構(gòu)成菌體原生質(zhì)的成分(磷、硫等)，作為酶的組成成分或維持酶的活性(鎂、鐵、錳、鋅、鈷等)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓和影響細(xì)胞膜的透性(氯化鈉、氯化鉀等)，參與產(chǎn)物的生物合成等。微生物對(duì)微量元素的需要是極微的，一般有0．1mg／L的濃度就可以滿足要求。4．生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子是一類微生物維持正常生活不可缺少，但細(xì)胞自身不能合成的某些微量有機(jī)化合物，包括維生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物以及脂肪酸等。大多數(shù)維生素是輔酶的組成結(jié)構(gòu)，沒(méi)有它們，酶就無(wú)法發(fā)揮作用。其需要量甚微，一般1～50μg/L，甚至更低。各種微生物對(duì)外源氨基酸的需要是不相同的，取決于它們自身合成氨基酸的能力。凡是微生物自身不能合成的氨基酸，一般需以游離氨基酸或小分子肽的形式供應(yīng)。而嘌呤、嘧啶及其衍生物的主要功能是構(gòu)成核酸和輔酶。5．水水是培養(yǎng)基的主要組成成分。它既是構(gòu)成菌體細(xì)胞的主要成分，又是一切營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞的介質(zhì)；而且，它還直接參與許多代謝反應(yīng)。由于水是許多化學(xué)物質(zhì)的良好溶劑，不同的水，如深井水、自來(lái)水、地表水所溶解的物質(zhì)可能不同，這些物質(zhì)將對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生影響，因此水的質(zhì)和量對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)物合成有著很重要的作用。生產(chǎn)中使用的水有深井水、自來(lái)水和地表水。6．產(chǎn)物形成的誘導(dǎo)物、前體和促進(jìn)劑許多胞外酶的合成需要適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物存在。而前體是指被菌體直接用于產(chǎn)物合成而自身結(jié)構(gòu)無(wú)顯著改變的物質(zhì)，如合成青霉素G的苯乙酸、合成紅霉素的丙酸等。當(dāng)前體物質(zhì)的合成是產(chǎn)物合成的限制因素時(shí)，添加前體能增加這些產(chǎn)物的產(chǎn)量，并在某種程度上控制生物合成的方向。在有些發(fā)酵過(guò)程中，添加某些促進(jìn)劑能刺激菌株的生長(zhǎng)，提高發(fā)酵產(chǎn)量，縮短發(fā)酵周期。如四環(huán)素發(fā)酵中加入溴化鈉和M促進(jìn)劑,能抑制金霉素的生物合成,同時(shí)增加四環(huán)素產(chǎn)量。3.2培養(yǎng)基的類型2.2.1根據(jù)營(yíng)養(yǎng)基來(lái)源劃分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基綜合培養(yǎng)基2.2.2根據(jù)培養(yǎng)基原物質(zhì)狀態(tài)液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基2.2.3

根據(jù)培養(yǎng)基的用途劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基：加入額外的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)某一類菌生長(zhǎng)選擇培養(yǎng)基：加入某種具殺菌作用的物質(zhì)活體培養(yǎng)基：活的動(dòng)植物體或離體的生活細(xì)胞2.2.4依據(jù)其在生產(chǎn)中的用途，可將培養(yǎng)基分成孢子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基3.3發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇基本原則提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分有利于減少培養(yǎng)基原料的消耗，增加產(chǎn)率有利于提高培養(yǎng)基和產(chǎn)物的濃度有利于提高產(chǎn)物合成的速度，縮短發(fā)酵周期減少副產(chǎn)物的形成原料價(jià)格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定有利于提高氧的利用率，降低成本能耗有利于產(chǎn)品的分離純化，減少三廢的出現(xiàn)3.4發(fā)酵的一般過(guò)程生物發(fā)酵工藝多種多樣，但基本上包括菌種制備、種子培養(yǎng)、發(fā)酵和提取精制等下游處理幾個(gè)過(guò)程。典型的發(fā)酵過(guò)程如圖4一l所示。以下以霉菌發(fā)酵為例加以說(shuō)明。3.4.1菌種在進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)之前，首先必須從自然界分離得到能產(chǎn)生所需產(chǎn)物的菌種，并經(jīng)分離、純化及選育后或是經(jīng)基因工程改造后的工程菌，才能供給發(fā)酵使用。為了能保持和獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，還需要定期進(jìn)行菌種純化和育種，篩選出高產(chǎn)量和高質(zhì)量的優(yōu)良菌株。篩選菌種的具體步驟可分為采樣、富集與分離、篩選、發(fā)酵與性能測(cè)定等幾個(gè)步驟。1.產(chǎn)生特殊物質(zhì)的微生物篩選從自然界尋找新的抗生素是一項(xiàng)效率極低的工作，故要篩選新的抗生素就必須在產(chǎn)生菌的分離方法和活性物質(zhì)的檢出方法上下功夫。抑菌圈法、稀釋法、擴(kuò)散法、生物自顯影法等以不同程度地廣泛應(yīng)用于抗生素的篩選。在這些方法中，試驗(yàn)菌的選擇十分重要，它直接關(guān)系到檢出的靈敏度和篩選出的抗生素的活性和抗菌譜。采用聯(lián)合試驗(yàn)菌，如枯草桿菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌或巴氏梭狀芽孢桿菌可以分離出抗菌活性低、對(duì)其他試驗(yàn)菌活性高的新抗生素，如黃色霉素族的抗生素，而單獨(dú)使用枯草桿菌作試驗(yàn)菌不能檢出。除了使用高敏感的試驗(yàn)菌以外，采用專一性很高的篩選技術(shù)也可檢出新的抗生素。如利用與抗生素作用機(jī)理有關(guān)的酶和酶的抑制劑、激活劑、抗體等建立的高靈敏、專一的檢測(cè)方法，已成為簡(jiǎn)便、快速的抗生素篩選技術(shù)。但因其專一性高，使用范圍有限。1抗生素產(chǎn)生菌的篩選2抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的篩選

在臨床上被認(rèn)為有效的抗腫瘤藥物大部分是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物質(zhì)。由于從細(xì)菌到人類的核酸結(jié)構(gòu)和生物合成有許多共同點(diǎn)，大部分抗腫瘤藥物具有抗菌和抗真菌活性。因此，利用微生物進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選，具有高敏感性和簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)。目前發(fā)展的利用微生物篩選作用于DNA的抗腫瘤藥物的方法均與微生物的“SOS機(jī)理”有關(guān)。生化誘導(dǎo)分析法(BIA)是采用測(cè)定溶原化噬菌體阻遏物支配下的啟動(dòng)子控制的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的酶活性的方法。將大腸桿菌的lacZ基因聯(lián)結(jié)在λ噬菌體的PL啟動(dòng)子下。當(dāng)DNA損傷時(shí)，誘發(fā)λ阻遏物蛋白C1分解，PL啟動(dòng)子起動(dòng)lacZ基因轉(zhuǎn)錄，測(cè)定表達(dá)的β半乳糖苷酶活性，可達(dá)到檢測(cè)能損傷DNA的抗腫瘤藥物的目的。該法又稱為λ誘導(dǎo)檢測(cè)法(λInductest)。SOS生色檢測(cè)法(SOSChromotest)是利用DNA損傷時(shí)而活化yecA蛋白，進(jìn)而分解噬菌體的阻遏蛋白，從而引起sfiA(sulA)基因啟動(dòng)子起動(dòng)lacZ基因的表達(dá)，從而達(dá)到檢測(cè)能損傷DNA的抗腫瘤藥物的目的。這兩種篩選方法的靈敏度因篩選的對(duì)象不同而互有高低，但總的來(lái)說(shuō)，SOS生色檢測(cè)法要比λ誘導(dǎo)檢測(cè)法的靈敏度高的實(shí)例較多些。同樣，也可以利用DNA修復(fù)能力變異株進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選。因?yàn)樵谏镏卸即嬖趦蓚€(gè)以上的DNA修復(fù)基因，如果有一個(gè)DNA修復(fù)基因損傷或變異，通常是能夠存活的，但對(duì)能引起DNA損傷的化合物十分敏感，易發(fā)生死亡。使用枯草芽孢桿菌或大腸桿菌的重組缺失DNA修復(fù)基因的變異株和親株為測(cè)試菌，用于篩選抗腫瘤藥物，對(duì)兩種測(cè)試菌有差異的，為陽(yáng)性。3免疫激活劑產(chǎn)生菌的篩選一般認(rèn)為能作用于細(xì)胞表面酶的物質(zhì)可能具有免疫修飾作用，因此以存在于細(xì)胞表面的氨基肽酶B、白氨酸氨基肽酶、氨基肽酶A、堿性磷酸酯酶為靶性物質(zhì)，研究了這些酶的抑制劑，發(fā)現(xiàn)抑制這些酶會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞性免疫或抗體產(chǎn)生能力。因此，可以用細(xì)胞表面酶的抑制法篩選免疫激活劑的產(chǎn)生菌。以接種腫瘤細(xì)胞后的老鼠血進(jìn)行免疫抑制處理后得到的免疫因子為此對(duì)照，在鼠肝臟細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，加入微生物培養(yǎng)液和刀豆球蛋白A，于3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷存在下培養(yǎng)，用液閃的方法篩選能影響DNA合成的物質(zhì)，它可消除腫瘤細(xì)胞血清的抑制作用，使產(chǎn)生抗體的活性恢復(fù)。

4酶產(chǎn)生菌的篩選

特定酶產(chǎn)生菌的篩選方法主要是依靠酶催化的反應(yīng)性質(zhì)和作用的底物特異性、底物和產(chǎn)物的特性及酶在細(xì)胞中所處的位置進(jìn)行設(shè)計(jì)。對(duì)于許多分泌在細(xì)胞外的水解酶，常常使待檢測(cè)的微生物在含有酶作用的不溶性底物，如淀粉、纖維素、酪素、細(xì)胞壁等培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)后，根據(jù)菌落周圍產(chǎn)生的透明圈的大小可以篩選到產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、溶菌酶等的高活性菌株。也可以根據(jù)酶催化反應(yīng)產(chǎn)酸或堿，在培養(yǎng)基中加入底物和酸堿pH指示劑，培養(yǎng)后，菌體生長(zhǎng)產(chǎn)酶使底物分解，依據(jù)菌落周圍的變色圈的大小和顏色深淺進(jìn)行判斷，篩選到產(chǎn)目標(biāo)酶微生物。為了篩選某種酶，可以合成特定的底物，在酶的催化作用下，生成產(chǎn)物與底物有顏色變化。在培養(yǎng)基中加入底物進(jìn)行微生物培養(yǎng)，產(chǎn)生的酶催化底物發(fā)生反應(yīng)，則在菌落四周形成色圈，根據(jù)色圈的大小和顏色深淺，即可篩選到產(chǎn)酶的菌株。利用這樣的方法也可直接作為分離培養(yǎng)基，將待分離的菌懸液涂布在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，根據(jù)菌落四周的透明圈和色圈的大小直接分離得到產(chǎn)酶的微生物。對(duì)于胞內(nèi)酶產(chǎn)生菌的篩選，如果酶作用的底物分子量較小，能透過(guò)細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，可以使用合成的在酶催化反應(yīng)后產(chǎn)生的產(chǎn)物有顏色變化的底物，加在培養(yǎng)基中，微生物在這樣培養(yǎng)基上生長(zhǎng)后，如果產(chǎn)酶，則菌落會(huì)產(chǎn)生顏色，而不產(chǎn)酶的微生物菌落不會(huì)產(chǎn)生顏色。如以2，4一二硝基苯氧基半乳糖為底物加在分離培養(yǎng)基中，篩選產(chǎn)半乳糖苷酶的產(chǎn)生菌是很成功的。對(duì)于更多的胞內(nèi)酶產(chǎn)生菌的篩選，是采用培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞破碎物作酶源，經(jīng)酶反應(yīng)后，根據(jù)酶反應(yīng)產(chǎn)物的特點(diǎn)，利用產(chǎn)物對(duì)紫外光的吸收，如輔酶NAD，直接用紫外分光光度法測(cè)定；通過(guò)對(duì)產(chǎn)物的顯色反應(yīng)，用可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定。5自然選育不經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過(guò)程稱為自然選育。自然突變一般有兩種原因，一是在自然環(huán)境中存在的低劑量的宇宙射線、各種短波輻射、低濃度的誘變物質(zhì)和微生物自身代謝產(chǎn)生的誘變物質(zhì)的作用，引起的突變；另一種是四種堿基：胸腺嘧啶(T)和鳥(niǎo)嘌呤(G)的六位酮基的烯醇式互變異構(gòu)和胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)的六位氨基的亞氨式互變異構(gòu)作用，在DNA復(fù)制過(guò)程中，如果瞬間的互變異構(gòu)，將使本應(yīng)為AT和GC堿基對(duì)為主的正確復(fù)制發(fā)生錯(cuò)誤。當(dāng)T以烯醇式存在時(shí)，合成的DNA單鏈的相對(duì)位置上將是G而不是A；若C以稀有的亞氨式出現(xiàn)，新合成的DNA單鏈的相應(yīng)位置上將是A而不是G，在DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的這種錯(cuò)誤有可能引起自然突變。這種互變異構(gòu)無(wú)法預(yù)測(cè)，因此基因的自然突變也難于預(yù)知。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，這種自然突變的機(jī)率大約為10-８～10-9。

6誘變育種誘變育種:是人為的利用物理化學(xué)等因素，使誘變的細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)染色體或DNA的片段發(fā)生缺失、易位、倒位、重復(fù)等畸變，或DNA的某一部位發(fā)生改變(又稱點(diǎn)突變)，從而使微生物的遺傳物質(zhì)DNA和RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起微生物的遺傳變異的方法。1誘變育種的基本方法用來(lái)進(jìn)行誘變的出發(fā)菌株的性能對(duì)提高誘變效果和育種效率有著極為重要的意義，選擇時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：1)誘變出發(fā)菌株要有一定的目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)能力，2)對(duì)誘變劑敏感的菌株變異幅度較大，3)生產(chǎn)性能好的菌株，如生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)要求低、產(chǎn)孢子多且早的菌株，最好為生產(chǎn)上自然選育的菌株，4)可選擇已經(jīng)過(guò)誘變的菌株，因有時(shí)經(jīng)誘變后菌株對(duì)誘變劑的敏感性提高。誘變處理的方法有單一誘變劑處理和復(fù)合處理。復(fù)合處理是指用兩種以上的誘變方法處理菌種，一般說(shuō)來(lái)，復(fù)合處理要比單一處理的效果好。復(fù)合處理包括：一類是用同一誘變劑多次重復(fù)處理；二類是兩種或多種誘變劑先后分別處理；三類是用兩種或多種誘變劑同時(shí)使用或多次進(jìn)行處理。進(jìn)行誘變處理的細(xì)胞懸浮液要求為生理狀態(tài)一致、分散均勻的單細(xì)胞或單孢子懸浮液。為了達(dá)到生理狀態(tài)一致的目的，可采取調(diào)整生理?xiàng)l件或分離細(xì)胞的方法實(shí)現(xiàn)同步生長(zhǎng)，并在誘變之前進(jìn)行前培養(yǎng)，保證細(xì)胞菌齡在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，孢子處于活躍狀態(tài)。制備的細(xì)胞或孢子懸浮液，一般真菌孢子酵母細(xì)胞的濃度大約以106個(gè)／mL，放線菌或細(xì)菌為108個(gè)/mL左右為宜誘變處理后，應(yīng)及時(shí)地在較豐富的培養(yǎng)基上進(jìn)行后培養(yǎng)，以穩(wěn)定變異，獲得高的突變頻率。誘變處理后，提高產(chǎn)量的變異株為少數(shù)，還需大量的篩選，才能獲得所需的高產(chǎn)菌種。其篩選的方法與前面所述的方法和步驟基本相同。經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩獲得的高產(chǎn)菌株還需經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化研究，確定最佳的發(fā)酵條件才可使高產(chǎn)突變菌株得到充分表現(xiàn)。7產(chǎn)量變異和篩選在發(fā)酵工業(yè)上，高產(chǎn)優(yōu)良菌種的選育不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且在國(guó)際激烈的競(jìng)爭(zhēng)中具有一定的戰(zhàn)略意義。目前，發(fā)酵工業(yè)中所用的高產(chǎn)優(yōu)良菌種大部分是首先從自然界篩選得到有一定的生產(chǎn)能力的菌種，然后通過(guò)反復(fù)地持之以恒地自然選育和誘變育種，使菌種的生產(chǎn)能力和性能獲得大幅度的提高，以滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需要。產(chǎn)量誘變育種的基本環(huán)節(jié)和需控制的參數(shù)如圖4-3：經(jīng)誘變、初篩和復(fù)篩選育的高產(chǎn)突變株，還需進(jìn)行菌株性能和生產(chǎn)性能的檢驗(yàn)。因?yàn)榻?jīng)誘變后菌株性能可能發(fā)生變化，如有可能成為營(yíng)養(yǎng)缺欠型、抗性缺欠型、代謝缺欠型，生長(zhǎng)特性、菌體形態(tài)、代謝途徑等也會(huì)發(fā)生變化。只有生長(zhǎng)快、發(fā)酵周期短，對(duì)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)要求低，孢子多、易培養(yǎng)繁殖，無(wú)色素、無(wú)毒素、無(wú)或少干擾產(chǎn)物分離的其它代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，有較高的培養(yǎng)發(fā)酵溫度，抗污染等等優(yōu)良性能的高產(chǎn)菌株才適合工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。再經(jīng)充分地發(fā)酵條件和營(yíng)養(yǎng)條件的優(yōu)化研究，才可能使高產(chǎn)突變基因得到充分的表現(xiàn)，使誘變育種獲得成功。

營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株因具有顯著的遺傳標(biāo)記，在雜交育種中有利于對(duì)雜交重組的分析。另外，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株因基因突變致使某一合成途徑中斷，喪失合成其生長(zhǎng)中必需的某種物質(zhì)的能力，使末端產(chǎn)物減少，解除了末端產(chǎn)物參與的反饋抑制或調(diào)節(jié)，可使代謝途徑中的某一中間產(chǎn)物過(guò)量積累；也可使分枝代謝的中間產(chǎn)物和另一分枝途徑中的末端產(chǎn)物積累。因此，使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵時(shí)，只須添加少量的必需物質(zhì)使生長(zhǎng)，即可大量生產(chǎn)所需的產(chǎn)物。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出只能達(dá)到是某一類營(yíng)養(yǎng)缺陷，如氨基酸類、維生素類、堿基類。還需進(jìn)一步的具體的鑒定是什么氨基酸、維生素和堿基，這就是營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定。一般采用生長(zhǎng)譜法確定，即營(yíng)養(yǎng)組合紙片法，觀察在培養(yǎng)基(一)上的生長(zhǎng)情況，加以確定。營(yíng)養(yǎng)缺陷型有可能是單缺陷型或雙缺陷型。一般單缺陷型的穩(wěn)定性較差，易發(fā)生回復(fù)突變，而雙缺陷型的回復(fù)突變的機(jī)率較小。一種不完全的營(yíng)養(yǎng)缺陷型又稱為滲漏缺陷型，它因不會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的末端產(chǎn)物，而可避免反饋調(diào)節(jié)；但合成的少量末端產(chǎn)物可進(jìn)行生物合成，在不添加相應(yīng)的物質(zhì)情況下，即可積累產(chǎn)物。在生物合成途徑中普遍存在末端產(chǎn)物的反饋抑制調(diào)節(jié)，在發(fā)酵過(guò)程中為了獲得高產(chǎn)，采用降低末端產(chǎn)物濃度或除去阻遏物一樣比較困難，而較有效的方法是選育對(duì)末端產(chǎn)物有抗反饋的突變株。由于抗反饋突變株的基因突變，使酶或無(wú)活性的原阻遏物不再與末端產(chǎn)物結(jié)合而活化，或活性阻遏物不能與發(fā)生突變的操縱基因結(jié)合，打破了反饋調(diào)節(jié)，即使在末端產(chǎn)物過(guò)量的情況下，也可照樣積累高濃度的末端產(chǎn)物?？狗答佉种谱儺愔甑暮Y選通常抗反饋突變株是用添加末端產(chǎn)物類似物或結(jié)構(gòu)類似物的方法篩選。因這些類似物能引起反饋調(diào)節(jié)，但不參與生物合成，未突變的細(xì)胞因代謝途徑受阻不能得到合成生物所需的末端產(chǎn)物而死亡。對(duì)于類似物不敏感的突變株，即使在類似物存在下也可合成未端產(chǎn)物而長(zhǎng)成菌落。為了穩(wěn)定抗結(jié)構(gòu)類似物的突變株，可在培養(yǎng)基中加入適量的結(jié)構(gòu)類似物或抗生素，防止回復(fù)突變。另外也可從營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株獲得抗反饋突變株。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株是因?yàn)閷?duì)反饋敏感的酶鈍化或缺失而致，發(fā)生回復(fù)突變后，雖然酶的催化活性恢復(fù)了，但酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而對(duì)反饋不敏感，因此可以過(guò)量積累末端產(chǎn)物?？狗纸獯x阻遏突變株的篩選

從遺傳學(xué)角度考慮，調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變會(huì)使阻遏蛋白失活，不能與分解代謝末端產(chǎn)物結(jié)合，或因操縱基因發(fā)生突變不能與阻遏蛋白結(jié)合，均會(huì)使分解代謝受到阻遏。從而獲得抗分解代謝阻遏的突變株。由此可導(dǎo)致相應(yīng)的酶及生物合成產(chǎn)物的積累。抗分解代謝阻遏突變株的篩選可以直接以分解代謝末端產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類似物為底物，篩選抗性菌株。通常使用結(jié)構(gòu)類似物時(shí)，因與阻遏蛋白的結(jié)合不可逆，在細(xì)胞中的濃度較高，較之使用分解代謝末端產(chǎn)物更有效。

抗性突變株的篩選這包括對(duì)抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體等的抗性突變株的篩選?？梢愿鶕?jù)具體的抗性要求選擇不同的篩選條件和方法，獲得所需的突變株，并應(yīng)用于某些產(chǎn)物的生產(chǎn)。3

.4.2菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)目的：為生產(chǎn)提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子，以縮短發(fā)酵周期，提高發(fā)酵罐利用率，有利于減少雜菌污染的機(jī)會(huì)。對(duì)種子要求：純、壯、活力旺盛、接種數(shù)量足夠3.4.3發(fā)酵發(fā)酵(fermentation)是微生物合成大量產(chǎn)物的過(guò)程，是整個(gè)發(fā)酵工程的中心環(huán)節(jié)。它是在無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行純種培養(yǎng)的過(guò)程。因此，所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)設(shè)備都必須經(jīng)過(guò)滅菌，通入的空氣或中途的補(bǔ)料都是無(wú)菌的，轉(zhuǎn)移種子也要采用無(wú)菌接種技術(shù)。通常利用飽和蒸汽對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，滅菌條件是在121℃(約0．1MPa表壓)維持20～30min?？諝獬鷦t采用介質(zhì)過(guò)濾的方法，可用定期滅菌的干燥介質(zhì)來(lái)阻截流過(guò)的空氣中所含的微生物，從而制得無(wú)菌空氣。發(fā)酵罐內(nèi)部的代謝變化(菌絲形態(tài)、菌含量、糖、氮含量、pH、溶氧濃度和產(chǎn)物濃度等)是比較復(fù)雜的，特別是次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵就更為復(fù)雜，它受許多因素控制。3.4.4下游處理發(fā)酵結(jié)束后，要對(duì)發(fā)酵液或生物細(xì)胞進(jìn)行分離和提取精制，將發(fā)酵產(chǎn)物制成合乎要求的成品。3.5.1種子擴(kuò)大培養(yǎng)階段液體培養(yǎng)法：液體試管、三角瓶搖床震蕩或回旋培養(yǎng)。通氣量大小可控。表面培養(yǎng)法：茄子瓶、克氏瓶、瓷盤培養(yǎng)固體培養(yǎng)法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶和培養(yǎng)皿等3.5工業(yè)微生物菌種培養(yǎng)的類型3.5.2大規(guī)模生產(chǎn)階段：淺盤固體培養(yǎng)、深層固體培養(yǎng)、淺盤液體培養(yǎng)、深層液體通氣培養(yǎng)固體培養(yǎng)培養(yǎng)基原料：小麥麩皮等設(shè)備：較淺的曲盤、較深的大池、能旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)鼓和通風(fēng)曲槽等特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量較高，耗費(fèi)勞動(dòng)力較多，占地面積達(dá)，PH、溶解氧、溫度等不易控制，易污染，生產(chǎn)規(guī)模難以擴(kuò)大液體培養(yǎng)按是否需氧靜置培養(yǎng)：厭氧菌發(fā)酵通氣培養(yǎng)：好氧菌發(fā)酵按培養(yǎng)罐類型淺盤培養(yǎng)：沒(méi)有通氣攪拌設(shè)備，勞動(dòng)強(qiáng)度大，生產(chǎn)效率低，易污染液體深層培養(yǎng)：發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行，發(fā)酵罐內(nèi)有攪拌器，通入空氣。大型發(fā)酵罐的發(fā)酵一般也分幾級(jí)，進(jìn)行多級(jí)培養(yǎng)，谷氨酸發(fā)酵二級(jí)培養(yǎng)，青霉素和鏈霉素等需三級(jí)培養(yǎng)第三節(jié)發(fā)酵操作方法和工藝控制1.發(fā)酵操作方法2影響發(fā)酵的主要因素3.發(fā)酵設(shè)備1.發(fā)酵操作方法發(fā)酵的一些指標(biāo)：底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品的比率：控制原料對(duì)產(chǎn)品成本影響產(chǎn)率：?jiǎn)挝粫r(shí)間，單位體積生產(chǎn)的成品半成品數(shù)量發(fā)酵產(chǎn)物濃度：確定下一步提取和精制方法及費(fèi)用殘留底物量：實(shí)際轉(zhuǎn)化率，防止雜菌1.1分批發(fā)酵又稱間歇發(fā)酵法。在一個(gè)密閉系統(tǒng)內(nèi)一次性加入營(yíng)養(yǎng)物和菌種進(jìn)行培養(yǎng)，直到結(jié)束放出，中間除了空氣進(jìn)入和尾氣排出，與外界沒(méi)有物料交換。全過(guò)程包括空罐滅菌、加入滅過(guò)菌的培養(yǎng)基、接種、培養(yǎng)的誘導(dǎo)期、發(fā)酵過(guò)程、放罐和洗罐，所需時(shí)間的總和為一個(gè)發(fā)酵周期。遲滯期

(1agphase)

：細(xì)胞不分裂（不生長(zhǎng)），但細(xì)胞變大，細(xì)胞內(nèi)RNA含量增高，原生質(zhì)呈堿性，合成代謝活躍，易合成新的誘導(dǎo)酶，對(duì)外界環(huán)境變化敏感。接種物中死細(xì)胞較多或培養(yǎng)基不豐富時(shí)延滯期較長(zhǎng)。指數(shù)生長(zhǎng)期

：細(xì)胞分裂（生長(zhǎng)）最快，細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)，酶系活躍，代謝旺盛。生長(zhǎng)速率由營(yíng)養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件決定。靜止期或

穩(wěn)定期：新繁殖的細(xì)胞與死亡細(xì)胞數(shù)目相等，菌體產(chǎn)量達(dá)到最高，細(xì)胞開(kāi)始儲(chǔ)藏糖原、脂肪等儲(chǔ)藏物，產(chǎn)芽孢的開(kāi)始形成芽孢，開(kāi)始合成次生代謝產(chǎn)物?？赡苡捎跔I(yíng)養(yǎng)物的消耗或抑制生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物積累，細(xì)胞停止增殖，但仍存活。

衰亡期：死亡細(xì)胞數(shù)目超過(guò)新生細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)多樣，細(xì)胞開(kāi)始自溶，開(kāi)始釋放次生代謝產(chǎn)物。

分批發(fā)酵過(guò)程微生物的生長(zhǎng)可分為四個(gè)不同的階段1.2連續(xù)發(fā)酵法向發(fā)酵罐中連續(xù)供給新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)，將含有微生物和產(chǎn)物的培養(yǎng)液以相同的速度連續(xù)放出，從而使發(fā)酵液中的液量維持恒定，微生物在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)。優(yōu)點(diǎn)：提高設(shè)備利用率、原料利用率和便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化缺點(diǎn)：1）開(kāi)放系統(tǒng)，容易雜菌污染

2）對(duì)設(shè)備、儀器要求高優(yōu)點(diǎn)：①可以維持穩(wěn)定的操作條件，有剩予微生物的生長(zhǎng)代謝，從而使產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量也相應(yīng)保持穩(wěn)定；②能夠更有效地實(shí)現(xiàn)機(jī)械化和自動(dòng)化，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，減少操作人員與病原微生物和毒性產(chǎn)物接觸的機(jī)會(huì)；③減少設(shè)備清洗、準(zhǔn)備和滅菌等非生產(chǎn)占用時(shí)間，提高設(shè)備利用率，節(jié)省勞動(dòng)力和工時(shí)；④由于滅菌次數(shù)減少，使測(cè)量?jī)x器探頭的壽囪_得以延長(zhǎng)；⑤容易對(duì)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，有效地提高發(fā)酵產(chǎn)率。缺點(diǎn)：①由于是開(kāi)放系統(tǒng)，加上發(fā)酵周期長(zhǎng)。容易造成雜菌污染；②在長(zhǎng)周期連續(xù)發(fā)酵中，微生物容易發(fā)生變異；③對(duì)設(shè)備、儀器及控制元器件的技術(shù)要求較高；④黏性絲狀菌菌體容易附著在器壁上生長(zhǎng)和發(fā)酵液內(nèi)結(jié)團(tuán)，給連續(xù)發(fā)酵操作帶來(lái)困難。1.3補(bǔ)料分批發(fā)酵法指在分批培養(yǎng)過(guò)程中，間歇的或連續(xù)的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，但所需產(chǎn)物不到一定時(shí)刻不放出的培養(yǎng)方法。又稱半連續(xù)發(fā)酵，是分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種過(guò)渡培養(yǎng)方法。優(yōu)點(diǎn)：1）與連續(xù)發(fā)酵相比,不需要嚴(yán)格的無(wú)菌條件，不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異問(wèn)題，以及適用范圍廣

2）與分批發(fā)酵比較：可以解除底物的抑制，產(chǎn)物反饋抑制和葡萄糖分解阻遏根據(jù)流加方式不同，分為單一補(bǔ)料反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵：發(fā)酵過(guò)程中每隔一定時(shí)間按一定比例放出一部分發(fā)酵液，直至發(fā)酵產(chǎn)率明顯下降。目前應(yīng)用十分廣泛，面包酵母、氨基酸、抗生素、單細(xì)胞蛋白質(zhì)等發(fā)酵工業(yè)補(bǔ)料分批發(fā)酵可以分為單一補(bǔ)料分批發(fā)酵和反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵兩種類型。在開(kāi)始時(shí)投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，到發(fā)酵過(guò)程的適當(dāng)時(shí)期，開(kāi)始連續(xù)補(bǔ)加碳源或(和)氮源或(和)其他必需基質(zhì)，直到發(fā)酵液體積到達(dá)發(fā)酵罐最大操作容積后，停止補(bǔ)料，最后將發(fā)酵液一次全部放出。這種操作方式稱為單一補(bǔ)料分批發(fā)酵。該操作方式受發(fā)酵罐操作容積的限制，發(fā)酵周期只能控制在較短的范圍內(nèi)。反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵是在單一補(bǔ)料分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上，每隔一定時(shí)間按一定比例放出一部分發(fā)酵液，使發(fā)酵液體積始終不超過(guò)發(fā)酵罐的最大操作容積，從而在理論上可以延長(zhǎng)發(fā)酵周期，直至發(fā)酵產(chǎn)率明顯下降，才最終將發(fā)酵液全部放出。這種操作類型既保留了單一補(bǔ)料分批發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)，又避免了它的缺點(diǎn)。補(bǔ)料分批發(fā)酵作為分批發(fā)酵向連續(xù)發(fā)酵的過(guò)渡，兼有兩者之優(yōu)點(diǎn)，而且克服了兩者之缺點(diǎn)。同傳統(tǒng)的分批發(fā)酵相比，它的優(yōu)越性是明顯的。首先它可以解除營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的抑制、產(chǎn)物反饋抑制和葡萄糖分解阻遏效應(yīng)(葡萄糖效應(yīng)，指葡萄糖被快速分解代謝所積累的產(chǎn)物在抑制所需產(chǎn)物合成的同時(shí)，也抑制其他一些碳源、氮源的分解利用)。對(duì)于好氧發(fā)酵，它可以避免在分批發(fā)酵中因一次性投入糖過(guò)多造成細(xì)胞大量生長(zhǎng)，耗氧過(guò)多，以至通風(fēng)攪拌設(shè)備不能匹配的狀況，還可以在某些情況下減少菌體生成量，提高有用產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。在真菌培養(yǎng)中，菌絲的減少可以降低發(fā)酵液的黏度，便于物料輸送及后處理。與連續(xù)發(fā)酵相比，它不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異問(wèn)題，其適用范圍也比連續(xù)發(fā)酵廣。目前，運(yùn)用補(bǔ)料分批發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)和研究的范圍十分廣泛，包括單細(xì)胞蛋白、氨基酸、生長(zhǎng)激素、抗生素、維生素、酶制劑、有機(jī)溶劑、有機(jī)酸、核苷酸、高聚物等，幾乎遍及整個(gè)發(fā)酵行業(yè)。它不僅被廣泛用于液體發(fā)酵中，在固體發(fā)酵及混合培養(yǎng)中也有應(yīng)用。隨著研究工作的深入及電腦在發(fā)酵過(guò)程自動(dòng)控制中的應(yīng)用，補(bǔ)料分批發(fā)酵技術(shù)將日益發(fā)揮出其巨大的優(yōu)勢(shì)。1.4固體發(fā)酵某些微生物生長(zhǎng)需水很少，可利用疏松而含有必需營(yíng)養(yǎng)物的固體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，稱為固體發(fā)酵(solidfermentation)。我國(guó)傳統(tǒng)的釀酒、制醬及天培(大豆發(fā)酵食品)的生產(chǎn)等均為固體發(fā)酵。另外，固體發(fā)酵還用于蘑菇的生產(chǎn)、奶酪和泡菜的制作以及動(dòng)植物廢料的堆肥等例子原料所用微生物蘑菇生產(chǎn)泡菜醬油大豆發(fā)酵食品千酪堆肥花生餅素金屬浸提有機(jī)酸酶污水處理麥稈、糞肥結(jié)球甘藍(lán)等大豆、小麥大豆凝乳混合有機(jī)材料花生餅低級(jí)礦石蔗糖、廢糖蜜麥麩等污水成分雙孢蘑菇、埃杜香菇等乳酸菌米曲霉寡孢根霉婁格法爾特氏青霉真菌、細(xì)菌、放線菌嗜食鏈孢霉硫芽孢桿菌黑曲霉黑曲霉細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物固體發(fā)酵一般都是開(kāi)放式，因而不是純培養(yǎng)，無(wú)菌要求不高，它的一般過(guò)程為：將原料預(yù)加工后再經(jīng)蒸煮滅菌，然后制成含一定水分的固體物料，接入預(yù)先培養(yǎng)好的菌種，進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵成熟后要適時(shí)出料，并進(jìn)行適當(dāng)處理，或進(jìn)行產(chǎn)物的提取。根據(jù)培養(yǎng)基的厚薄可分為薄層發(fā)酵和厚層發(fā)酵，用到的設(shè)備有簾子、曲盤和曲箱等。薄層固體發(fā)酵是利用木盤或葦簾，在上面鋪1～2鋤厚的物料，接種后在曲室內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵；厚層固體發(fā)酵是利用深槽(或池)，在其上部架設(shè)竹簾，簾上鋪厚30cm以上的物料，接種后在深槽下部給以通氣進(jìn)行發(fā)酵。2.影響發(fā)酵的主要因素溫度：根據(jù)發(fā)酵不同階段，確定最適溫度。發(fā)酵中釋放發(fā)酵熱，一般需要進(jìn)行冷卻操作PH：PH不同產(chǎn)物不同，基質(zhì)加緩沖性物質(zhì)，生產(chǎn)過(guò)程中加入無(wú)機(jī)酸、堿等通風(fēng)和攪拌：可以生長(zhǎng)和最適生長(zhǎng)氧濃度染菌的控制：1）設(shè)備、管道、閥門漏損

2）設(shè)備及管道滅菌不徹底存在死角3）空氣凈化不徹底4）菌種不純或培養(yǎng)基滅菌不徹底

5）無(wú)菌操作不嚴(yán)格，生產(chǎn)操作出錯(cuò)發(fā)酵工藝控制發(fā)酵過(guò)程中，為了能對(duì)生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行必要的控制，需要對(duì)有關(guān)工藝參數(shù)進(jìn)行定期取樣測(cè)定或進(jìn)行連續(xù)測(cè)量。有關(guān)的參數(shù)如表4—2所示。反映發(fā)酵過(guò)程變化的參數(shù)可以分為兩類：一類是可以直接采用特定的傳感器檢測(cè)的參數(shù)，它們包括反映物理環(huán)境和化學(xué)環(huán)境變化的參數(shù)，如溫度、壓力、攪拌功率、轉(zhuǎn)速、泡沫、發(fā)酵液黏度、濁度、pH、離子濃度、溶解氧、基質(zhì)濃度等，稱為直接參數(shù)。另一類是至今尚難于用傳感器來(lái)檢測(cè)的參數(shù)，包括細(xì)胞生長(zhǎng)速率、產(chǎn)物合成速率和呼吸商等。后一類參數(shù)需要根據(jù)一些直接檢測(cè)出來(lái)的參數(shù)，借助于電腦計(jì)算和特定的數(shù)學(xué)模型才能得到。因此這類參數(shù)被稱為間接參數(shù)。上述參數(shù)中。對(duì)發(fā)酵過(guò)程影響較大的有溫度、pH、溶解氧濃度等。物理、工程參數(shù)參數(shù)名稱單位檢測(cè)方法意義、主要作用溫度罐壓空氣流量攪拌轉(zhuǎn)速攪拌功率黏度密度裝量濁度泡沫傳質(zhì)系數(shù)KLa加糖速率加消泡荊速率加中間體或前體速率加其他基質(zhì)速率℃：KPavvm；ln3／hr／nmkWPa·8kg／m3m3；L透光度％ghkg／hkgfhkg／h劃h傳感器壓力表傳感器傳感器傳感器黏度計(jì)傳感器傳感器傳感器傳感器間接計(jì)算；在線監(jiān)測(cè)．傳感器傳感器傳感器傳感器維持生長(zhǎng)、合成維持正壓、增加IX)供氧、排泄廢氣、提高KLa物料混合、提高KLa反映攪拌情況、KLa反映菌生長(zhǎng)、KLa反映發(fā)酵液性質(zhì)反映發(fā)酵液數(shù)量反映菌生長(zhǎng)情況反映發(fā)酵代謝情況反映供氧效率反映耗氧情況反映泡沫情況反映前體、基質(zhì)利用情況反映基質(zhì)利用情況(一)溫度溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響是多方面的，它會(huì)影響各種酶反應(yīng)的速率，改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向，影響微生物的代謝調(diào)控機(jī)制。除這些直接影響外，溫度還對(duì)發(fā)酵液的理化性質(zhì)產(chǎn)生影響實(shí)際生產(chǎn)中，由于發(fā)酵液的體積很大，升降溫度都比較困難，所以在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，往往采用一個(gè)比較適合的培養(yǎng)溫度，使得到的產(chǎn)物產(chǎn)量最高，或者在可能的條件下進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)調(diào)整。發(fā)酵溫度可通過(guò)溫度計(jì)或自動(dòng)記錄儀表進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)向發(fā)酵罐的夾套或蛇形管中通人冷水、熱水或蒸汽進(jìn)行調(diào)節(jié)。(二)pHpH對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)物合成的影響有以下幾個(gè)方面：①影響酶的活性，當(dāng)pH抑制菌體中某些酶的活性時(shí)，會(huì)阻礙菌體的新陳代謝。②影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細(xì)胞膜的通透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的排泄。③影響培養(yǎng)基中某些組分和中間代謝產(chǎn)物的離解，從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的利用。④pH不同，往往引起菌體代謝過(guò)程不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。另外，pH還會(huì)影響某些霉菌的形態(tài)。首先需要考慮和試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方，使它們有個(gè)適當(dāng)?shù)呐浔?，使發(fā)酵過(guò)程中的pH在合適的范圍內(nèi)。現(xiàn)在常用的是以生理酸性物質(zhì)(NH4)2S04和生理堿性物質(zhì)氨水來(lái)控制，它們不僅可以調(diào)節(jié)pH，還可以補(bǔ)充氮源。當(dāng)發(fā)酵液的pH和銨態(tài)氮含量都偏低時(shí)，補(bǔ)加氨水，就可以達(dá)到調(diào)節(jié)pH和補(bǔ)充氨氮的目的；反之，pH較高，銨態(tài)氮含量又低時(shí)，就補(bǔ)加(NH4)2S04。(三)溶解氧對(duì)于好氧發(fā)酵，溶解氧濃度是最重要的參數(shù)之一。好氧性微生物深層培養(yǎng)時(shí)，需要適量的溶解氧以維持其呼吸代謝和某些產(chǎn)物的合成，氧的不足會(huì)造成代謝異常，產(chǎn)量降低。微生物發(fā)酵的最適氧濃度與臨界氧濃度是不同的。前者是指溶解氧濃度對(duì)生長(zhǎng)或合成有一最適的濃度范圍，后者一般指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度。為了避免生物合成處在氧限制的條件下，需要考察每一發(fā)酵過(guò)程的臨界氧濃度和最適氧濃度，并使其保持在最適氧濃度范圍。已知發(fā)酵液的需氧量，受菌體濃度、基質(zhì)的種類和濃度以及培養(yǎng)條件等因素的影響，其中以菌體濃度的影響最為明顯。發(fā)酵液的攝氧率隨菌體濃度增大而增大，但氧的傳遞速率隨菌體濃度的對(duì)數(shù)關(guān)系減少。

現(xiàn)在已可采用復(fù)膜氧電極來(lái)檢測(cè)發(fā)酵液中的溶解氧濃度。要維持一定的溶氧水平，需從供氧和需氧兩方面著手。在供氧方面，主要是設(shè)法提高氧傳遞的推動(dòng)力和氧傳遞系數(shù)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速或通氣速率來(lái)控制。同時(shí)要有適當(dāng)?shù)墓に嚄l件來(lái)控制需氧量，使菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成對(duì)氧的需求量不超過(guò)設(shè)備的供氧能力。還可采用調(diào)節(jié)溫度(降低培養(yǎng)溫度可提高溶氧濃度)、液化培養(yǎng)基、中間補(bǔ)水、添加表面活性劑等工藝措施，從而改善溶氧水平。3.發(fā)酵設(shè)備3.1厭氧發(fā)酵罐設(shè)備簡(jiǎn)單主要用于酒精、乳酸及啤酒等厭氧發(fā)酵3.2好氧發(fā)酵罐3.2.1機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐（通用式發(fā)酵罐）：大部分采用通風(fēng)發(fā)酵。特點(diǎn):溶氧速率高，氣液混合效果好,結(jié)構(gòu)嚴(yán)密，有利于避免雜菌污染缺點(diǎn)：結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，動(dòng)力消耗大3.2.1通風(fēng)攪拌式發(fā)酵罐通風(fēng)目的：a)供給微生物所需要的氧b）代替攪拌器使發(fā)酵液均勻混合1）循環(huán)式通風(fēng)發(fā)酵罐2）高位塔式發(fā)酵罐第四節(jié)

發(fā)酵下游加工過(guò)程

1.發(fā)酵產(chǎn)物的分離和純化的目的及基本要求2.發(fā)酵液下游處理的流程和方法1.目的及基本要求.目的：發(fā)酵液中雜質(zhì)含量較多，代謝產(chǎn)物的濃度較低，低濃度的發(fā)酵產(chǎn)品不能直接作為工業(yè)生產(chǎn)的原料或?yàn)槲宜?/p>

基本要求（1）操作簡(jiǎn)單費(fèi)用低（2）提取率高，能夠達(dá)到要求純度，廢液中最終產(chǎn)品含量低（3）不影響產(chǎn)品質(zhì)量（4）提取所用試劑對(duì)設(shè)備腐蝕性?。?）產(chǎn)生廢物能夠處理，對(duì)環(huán)境污染少

2.流程和方法下游技術(shù)兩個(gè)階段：（1）發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離（2）純化

a提取（初步純化）

b精制（高度純化）

c成品加工一、提取常用方法1．沉淀提取法沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過(guò)程。主要是為了通過(guò)沉淀達(dá)到濃縮的目的，或通過(guò)沉淀除去非必要的成分，其次將已純化的產(chǎn)物轉(zhuǎn)為固體便于保存。2．色譜分離法色譜分離法按分離機(jī)制的不同，可分為吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法、凝膠過(guò)濾(或分子篩)色譜法和親和色譜法等。3．萃取法提取萃取常指制備物與細(xì)胞固體成分或其他結(jié)合成分的分離。如果被提取物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)呈固相或與固體結(jié)合存在，提取時(shí)由固相轉(zhuǎn)入液相，常稱為固一液萃取。如被提取物原來(lái)已呈液相存在，提取時(shí)由一液相轉(zhuǎn)入另一互不相溶的液相，這種提取方法稱之為液一液萃取。4．膜分離技術(shù)膜分離的原理，主要是利用溶液中溶質(zhì)分子的大小、形狀、性質(zhì)等差別，對(duì)于各種薄膜表現(xiàn)出不同的可透性而達(dá)到分離的目的。選擇薄膜在膜分離法中很重要。薄膜的作用是有選擇地讓小分子通過(guò)，而把較大的分子擋除。分子透過(guò)膜，可由簡(jiǎn)單的擴(kuò)散作用引起，或由膜兩邊外加的流體靜壓差或電場(chǎng)作用所推動(dòng)。由上述原理衍生出的分離法有透析、超濾、電滲析、反滲透等。二、精制經(jīng)提取過(guò)程初步純化后，濾液體積大大縮小，但純度提高不多，需要進(jìn)一步精制。初步純化中的某些操作，如沉淀、超濾等也可應(yīng)用于精制中。大分子(如蛋白質(zhì))的精制依賴于層析分離。層析分離是利用物質(zhì)在固定相和移動(dòng)相間分配情況的不同，進(jìn)而在層析柱中的運(yùn)動(dòng)速度不同，從而達(dá)到分離的目的。根據(jù)分配機(jī)理的不同，分為凝膠層析、離子交換層析、聚焦層析：疏水層析、親和層析等幾種類型。色層分離中的主要困難之一是層析介質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度差，研究并生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)層析介質(zhì)是下游加工的重要任務(wù)之一。小分子物質(zhì)的精制常利用結(jié)晶操作。三、成品加工經(jīng)提取和精制后，一般根據(jù)產(chǎn)品應(yīng)用要求，最后還需要經(jīng)過(guò)濃縮、無(wú)菌過(guò)濾和去熱原、干燥、加穩(wěn)定劑等步驟。隨著膜質(zhì)量的改進(jìn)和膜裝置性能的改善，下游加工過(guò)程的各個(gè)階段，將會(huì)越來(lái)越多地使用膜技術(shù)。濃縮可采用升膜式和降膜式的薄膜蒸發(fā)，對(duì)熱敏性物質(zhì)可用離心薄膜蒸發(fā)，對(duì)大分子溶液的濃縮可用超濾膜，小分子溶液的濃縮可用反滲透膜。用截?cái)喾肿恿繛?0000的超濾膜可除去分子量在1000以內(nèi)的產(chǎn)品中的熱原，同時(shí)也達(dá)到了過(guò)濾除菌的目的。如果最后要求的是結(jié)晶性產(chǎn)品，則上述濃縮、無(wú)菌過(guò)濾等步驟應(yīng)放于結(jié)晶之前，而干燥則通常是固體產(chǎn)品加工的最后一道工序。干燥方法根據(jù)物料性質(zhì)、物料狀況及生產(chǎn)具體條件而定，可選用真空干燥、紅外線干燥、沸騰干燥、氣流干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等方法。純化方法（1）提?。撼ヅc目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)有很大差別的物質(zhì)，濾液體積減小但純度不高

吸附法、離心分離、萃取、沉淀、超濾（2）精制:除去有類似化學(xué)功能和物理性質(zhì)的不純物

沉淀、超濾、層析、電泳、高效液相（3）精制：進(jìn)一步濃縮、無(wú)菌過(guò)濾、干燥、加穩(wěn)定劑等等

結(jié)晶、干燥等第五節(jié)發(fā)酵工程的應(yīng)用一、抗生素發(fā)酵生產(chǎn)抗生素是生物體在生命活動(dòng)中產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物。這類有機(jī)物質(zhì)能在低濃度下抑制或殺滅活細(xì)胞，這種作用又有很強(qiáng)的選擇性，例如醫(yī)用的抗生素僅對(duì)造成人類疾病的細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制或殺滅作用，而對(duì)人體正常細(xì)胞損害很小，這是抗生素為什么能用于醫(yī)藥的道理。在生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的6000多種抗生素中，約60％來(lái)自放線菌。抗生素主要用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，少數(shù)抗生素也可用化學(xué)方法合成。人們還對(duì)天然得到的抗生素進(jìn)行生化或化學(xué)改造，使其具有更優(yōu)越的性能，這樣得到的抗生素叫半合成抗生素，其數(shù)目已達(dá)到兩萬(wàn)多種?？股夭粌H廣泛用于臨床醫(yī)療，而且已經(jīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧及環(huán)保等領(lǐng)域中。(一)青霉素發(fā)酵生產(chǎn)菌株最初由弗萊明分離的點(diǎn)青酶，只能生產(chǎn)2IU／mL的青霉素。目前全世界用于生產(chǎn)青霉素的高產(chǎn)菌株，大都由菌株WisQ176(一種產(chǎn)黃青霉)經(jīng)不同改良途徑得到；20世紀(jì)70年代前育種采用誘變和隨機(jī)篩選方法，后來(lái)由于原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因克隆技術(shù)等現(xiàn)代育種技術(shù)的應(yīng)用，青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)水平已達(dá)85000IU／mL以上。青霉素生產(chǎn)菌株一般在真空冷凍干燥狀態(tài)下保存其分生孢子，也可以用甘油或乳糖溶劑作懸浮劑，在-70℃冰箱或液氮中保存孢子懸浮液和營(yíng)養(yǎng)菌絲體。(二)青霉素發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)1．碳源目前普遍采用淀粉經(jīng)酶水解的葡萄糖化液進(jìn)行流加。2．氮源可選用玉米漿、花生餅粉、精制棉子餅粉或麩質(zhì)粉，并補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源。3．前體苯乙酸或苯乙酰胺為青霉素的前體，由于它們對(duì)青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0．1％，并采用多次加入方式。4．無(wú)機(jī)鹽青霉素生產(chǎn)所用的無(wú)機(jī)鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類，鐵離子對(duì)青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵液中鐵含量在30μg／mL以下。(三)青霉素發(fā)酵工藝1．種子制備種子制備階段以生產(chǎn)豐富的孢子(斜面和米孢子培養(yǎng))或大量健壯的菌絲體(種子罐)為目的。為達(dá)到這一目的，在培養(yǎng)基中加入比較豐富的容易代謝的碳源(如葡萄糖或蔗糖)、氮源(如玉米漿)、緩沖pH的碳酸鈣以及生長(zhǎng)所必需的無(wú)機(jī)鹽，并保持最適生長(zhǎng)溫度(25～26℃)和充分通氣、攪拌。在最適生長(zhǎng)條件下，到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)菌體量的倍增時(shí)間為6～7h。在工業(yè)生產(chǎn)中，種子制備的培養(yǎng)條件及原材料質(zhì)量均應(yīng)嚴(yán)格控制以保持種子質(zhì)量的穩(wěn)定性。2．發(fā)酵培養(yǎng)影響青霉素發(fā)酵產(chǎn)率的因素有環(huán)境因素(如pH、溫度、溶氧飽和度、碳氮組分含量等，有生理變量因素(包括菌絲濃度、菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲形態(tài)等)對(duì)它們都要進(jìn)行嚴(yán)格控制。發(fā)酵中pH一般控制在6．4～6．6，發(fā)酵溫度前期25～26℃，后期23℃，以減少后期發(fā)酵液中青霉素的降解破壞。此外，還要求發(fā)酵液中溶氧量不低于飽和溶解氧的30％，通氣比一般為1：0.8vvm(單位培養(yǎng)液體積在單位時(shí)間內(nèi)通入的空氣量)。3．發(fā)酵后處理(1)過(guò)濾采用鼓式真空過(guò)濾器，過(guò)濾前加去乳化劑并降溫。(2)提煉用溶媒萃取法。將發(fā)酵濾液酸化至pH2，加1／3體積的醋酸丁酯(BA)，混合后以碟片式離心機(jī)分離，得一次BA提取液。然后以1．3％～1．9％的NaHCO3在pH6．8～7．1條件下將青霉素從BA中提取到緩沖液中。再調(diào)pH至2.0，將青霉素從緩沖液再次轉(zhuǎn)人到BA中，方法同上，得二次BA提取液。(3)脫色在二次BA提取液中加活性炭150～300g／109IU，脫色、過(guò)濾。(4)結(jié)晶用丁醇共沸結(jié)晶法。將二次BA萃取液以0．5mol／LNaOH液萃取，調(diào)pH至6．4～6．8，得青霉素鈉鹽水濃縮液。加3～4倍體積的丁醇，在16～26℃，666．61～1333．22Pa(5～10mmHg)下真空蒸餾，將水與丁醇共沸物蒸出，并隨時(shí)補(bǔ)加丁醇。當(dāng)濃縮到原來(lái)水濃縮液體積，蒸出餾分中含水達(dá)2％～4％時(shí)，即停止蒸餾。青霉素鈉鹽結(jié)晶析出，過(guò)濾，將晶體洗滌后進(jìn)行干燥得成品?？稍?0℃，2666．44Pa(20mmHg)真空中烘16h，然后磨粉、裝桶。二、氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸(aminoacid)是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是人體及動(dòng)物的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，氨基酸產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、化學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。以前氨基酸主要是用酸水解蛋白質(zhì)來(lái)制得，現(xiàn)在氨基酸生產(chǎn)方法有發(fā)酵法、提取法、合成法、酶法等，其中最主要的是發(fā)酵法生產(chǎn)，用發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸已有20多種。谷氨酸是一種重要的氨基酸。我們吃的味精是以谷氨酸為原料生成的谷氨酸單鈉，谷氨酸還可以制成對(duì)皮膚無(wú)刺激性的洗滌劑——十二烷?；劝彼徕c肥皂、能保持皮膚濕潤(rùn)的潤(rùn)膚劑——焦谷氨酸鈉、質(zhì)量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革以及人造纖維和涂料等。谷氨酸是目前氨基酸生產(chǎn)中產(chǎn)量最大的一種，同時(shí)，谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝也是氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)中最典型、最成熟的。下面以谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)為例簡(jiǎn)單介紹一下氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)。(一)谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的菌種谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)菌種主要有棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬的細(xì)菌。除節(jié)桿菌外，其他三屬中有許多菌種適用于糖質(zhì)原料的谷氨酸發(fā)酵。這些細(xì)菌都是需氧微生物，都需要以生物素為生長(zhǎng)因子。我國(guó)谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)所用菌種有北京棒狀桿菌ASl299、鈍齒棒狀桿菌ASl542、HU7251及7338、B9等。這些菌株的斜面培養(yǎng)一般采用由蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉等組成，pH為7．0～7．2的瓊脂培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)24h，冰箱保存?zhèn)溆谩?二)谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的原料制備谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)以淀粉水解糖為原料。淀粉水解糖的制備一般有酸水解法和酶水解法兩種。國(guó)內(nèi)常用的是淀粉酸水解工藝：干淀粉用水調(diào)成波美10～11度的淀粉乳，用鹽酸調(diào)至pHl．5左右；然后直接用蒸汽加熱，水解壓力30×104Pa，時(shí)間25min左右；冷卻糖化液至80℃，用NaOH調(diào)節(jié)pH至4．0～5．0使糖化液中的蛋白質(zhì)和其他膠體物質(zhì)沉淀析出；然后用粉末狀活性炭脫色，活性炭用量約為淀粉量的0．6％～0．8％，70℃，酸性環(huán)境下攪拌；最后在45～60℃下過(guò)濾得到淀粉水解液。(四)谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵初期，菌體生產(chǎn)遲滯，約2～4h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，代謝旺盛，糖耗快，這時(shí)必須流加尿素以供給氮源并調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH至7．5～8．0，同時(shí)保持溫度為30～32℃。本階段主要是菌體生長(zhǎng)，幾乎不產(chǎn)酸，菌體內(nèi)生物素含量由豐富轉(zhuǎn)為貧乏，時(shí)間約12h。隨后轉(zhuǎn)入谷氨酸合成階段，此時(shí)菌體濃度基本不變，糖與尿素分解后產(chǎn)生的α-酮戊二酸和氨主要用來(lái)合成谷氨酸。這一階段應(yīng)及時(shí)流加尿素以提供氮源及維持谷氨酸合成最適pH7．2～7．4，需大量通氣，并將溫度提高到谷氨酸合成最適溫度34～37℃。發(fā)酵后期，菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑?，需減少流加尿素量。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡、谷氨酸濃度不再增加時(shí)，及時(shí)放罐，發(fā)酵周期約為30h。(五)谷氨酸提取谷氨酸提取有等電點(diǎn)法、離子交換法、金屬鹽沉淀法、鹽酸鹽析法和電滲析法以及將上述方法結(jié)合使用的方法。國(guó)內(nèi)多采用的是等電點(diǎn)―離子交換法。谷氨酸的等電點(diǎn)為pH3．22，這時(shí)它的溶解度最小，所以將發(fā)酵液用鹽酸調(diào)節(jié)到pH3．22，谷氨酸就可結(jié)晶析出。晶核形成的溫度一般為25～30℃，為促進(jìn)結(jié)晶，需加入A型晶種育晶2h。等電點(diǎn)攪拌之后靜置沉降，再用離心法分離得到谷氨酸結(jié)晶。等電點(diǎn)法提取了發(fā)酵液中的大部分谷氨酸，剩余的谷氨酸可用離子交換法，進(jìn)一步進(jìn)行分離、提純和濃縮回收。谷氨酸是兩性電解質(zhì)，故與陽(yáng)性或陰性樹(shù)脂均能交換。當(dāng)溶液pH低于3．2時(shí)，谷氨酸帶正電，能與陽(yáng)離子樹(shù)脂交換。目前國(guó)內(nèi)多用國(guó)產(chǎn)732型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂來(lái)提取谷氨酸，然后在65℃左右，用6％NaOH溶液洗脫，pH3～7的洗脫液作為高流液，返回等電點(diǎn)法提取。三、維生素發(fā)酵生產(chǎn)維生素是人體生命活動(dòng)必需的物質(zhì)，主要以輔酶或輔基的形式參與生物體的各種生化反應(yīng)。維生素在醫(yī)療中發(fā)揮了重要作用，如維生素B族用于治療神經(jīng)炎、角膜炎等多種炎癥，維生素D是治療佝僂病的重要藥物等。維生素還應(yīng)用于畜牧業(yè)及飼料工業(yè)中。維生素的生產(chǎn)多采用化學(xué)合成法，后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)某些微生物可以完成維生素合成中的某些重要步驟；在此基礎(chǔ)上，化學(xué)合成與生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合的半合成法在維生素生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。目前，可以用發(fā)酵法結(jié)合的半合成法生產(chǎn)的維生素有維生素C、維生素B2、維生素B12、維生素D以及β胡蘿卜素等。維生素C又稱抗壞血酸(ascorbicacid)，能參與人體內(nèi)多種代謝過(guò)程，使組織產(chǎn)生膠原質(zhì)，影響毛細(xì)血管的滲透性及血漿的凝固，刺激人體造血功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。另外，由于它具有較強(qiáng)的還原能力，可作為抗氧化劑，已在醫(yī)藥、食品工業(yè)等方面獲得廣泛應(yīng)用。維生素C的化學(xué)合成方法一般指萊氏法，后來(lái)人們改用微生物脫氫代替化學(xué)合成中L一山梨糖中間產(chǎn)物的生成，使山梨糖的得率提高一倍；我國(guó)進(jìn)一步利用另一種微生物將L一山梨糖轉(zhuǎn)化為2一酮基一L一古龍酸，再經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)維生素C，稱為兩步法發(fā)酵工藝。兩步發(fā)酵法使產(chǎn)品產(chǎn)量得到了大幅度提高，其主要過(guò)程簡(jiǎn)述于下。第一步發(fā)酵是生黑葡萄糖桿菌(或弱氧化醋桿菌)經(jīng)過(guò)二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，種子液質(zhì)量達(dá)到轉(zhuǎn)種液標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至含有山梨醇、玉米粉、磷酸鹽、碳酸鈣等組分的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28～34℃下進(jìn)行發(fā)酵，收率達(dá)95％，培養(yǎng)基山梨醇濃度達(dá)到25％時(shí)也能繼續(xù)發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液經(jīng)低溫滅菌，得到無(wú)菌的含有山梨糖的發(fā)酵液，作為第二步發(fā)酵的原料。第二步發(fā)酵是氧化葡糖桿菌(或假單胞桿菌)經(jīng)過(guò)二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，種子液達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后，轉(zhuǎn)移至含有第一步發(fā)酵液的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28～34℃下培養(yǎng)60～72h。最后發(fā)酵液濃縮，經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化和精制獲得維生素C。１.代謝調(diào)控和代謝工程的概念為了達(dá)到上述目的，在生產(chǎn)實(shí)踐中基本采用兩種方法，一種是如上所述的通過(guò)誘變選育基因突變株，從根本上控制微生物的代謝；另一種是控制微生物的培養(yǎng)和生長(zhǎng)環(huán)境條件，影響其代謝過(guò)程。這種運(yùn)用代謝調(diào)節(jié)理論指導(dǎo)的生產(chǎn)實(shí)踐稱為代謝調(diào)控。近年隨著基因工程的飛速進(jìn)步，利用基因工程方法改變代謝流，擴(kuò)展和構(gòu)建新的代謝途徑，或?qū)蓚€(gè)相關(guān)的代謝途徑通過(guò)關(guān)聯(lián)酶使之連接形成新的代謝流，這些已取得令人矚目的發(fā)展。人們稱這種涉及多個(gè)基因的基因工程為代謝工程，也稱之為途徑工程。微生物代謝產(chǎn)物可分為初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物。初級(jí)代謝產(chǎn)物是指一類低分子量的終點(diǎn)產(chǎn)物，包括那些用于構(gòu)造大分子的基礎(chǔ)物質(zhì)和能轉(zhuǎn)化為輔酶的物質(zhì)，以及合成這些物質(zhì)的代謝合成中間物。其中最為重要的是氨基酸、核苷酸和維生素，以及EM途徑、PP途徑和三羧酸循環(huán)的中間體，如一些有機(jī)酸等。微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物是指某些微生物生長(zhǎng)后期合成的產(chǎn)物。它們并不是微生物生長(zhǎng)所必需的，但可能對(duì)產(chǎn)生菌的生存有一定價(jià)值。次級(jí)代謝產(chǎn)物可分為糖苷類、多肽類、酰胺類、核苷類及混雜類。它們均是初級(jí)代謝產(chǎn)物的衍生物，或分子結(jié)構(gòu)的修飾物，或進(jìn)一步裝配、聚合而成的產(chǎn)物，其合成過(guò)程要比初級(jí)代謝產(chǎn)物更復(fù)雜。第六節(jié)代謝調(diào)控和代謝工程

初級(jí)代謝產(chǎn)物的形成一般只需要簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)條件，在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中即可生成。而次級(jí)產(chǎn)物合成需要復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)條件，往往需要供給成分復(fù)雜的天然物質(zhì)。在分批培養(yǎng)條件下，初級(jí)代謝產(chǎn)物的合成基本與產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)同步，而次級(jí)代謝產(chǎn)物一般都是在產(chǎn)生菌比生長(zhǎng)速率降低時(shí)才大量合成，這時(shí)培養(yǎng)基中可利用的碳、氮、磷和硫等主要元素已基本耗完，與這些原料的利用有關(guān)的酶活力趨于下降，與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成有關(guān)的酶類逐漸出現(xiàn)，產(chǎn)物開(kāi)始大量合成，但是因菌體逐漸衰老，產(chǎn)物難于長(zhǎng)期持續(xù)合成。因此，通過(guò)控制培養(yǎng)條件以盡量維持次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成期，以獲得產(chǎn)物的過(guò)量生產(chǎn)。由于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成遠(yuǎn)離初級(jí)代謝的主要途徑，微生物細(xì)胞對(duì)其合成控制較弱，因此，改變環(huán)境條件易于影響其表達(dá)，基因型改變后的產(chǎn)量變異幅度較大，而初級(jí)代謝產(chǎn)物則與此相反。要想獲得發(fā)酵產(chǎn)物的過(guò)量生產(chǎn)的方法也不同。6．1代謝調(diào)控6．1．1代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控可分為兩種：一是控制培養(yǎng)和發(fā)酵條件，另一個(gè)更重要的是通過(guò)誘變選育突變株，控制代謝途徑。1．發(fā)酵條件控制(1)控制培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分組成和濃度配比：大量的工業(yè)發(fā)酵實(shí)踐證明，同一微生物在同樣的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，只是發(fā)酵條件的不同，發(fā)酵產(chǎn)物就可能不同。如啤酒酵母在中性和酸性發(fā)酵條件下，可將葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，而在培養(yǎng)基中加入亞硫酸氫鈉，或于堿性條件下發(fā)酵，產(chǎn)物不再是乙醇，而是甘油；在谷氨酸發(fā)酵中，控制發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，可改變代謝方向，產(chǎn)生不同的發(fā)酵產(chǎn)物。由此可以看出，在谷氨酸發(fā)酵中仔細(xì)地控制發(fā)酵條件，供給適量的空氣、銨鹽和磷酸，適量的生物素，保持發(fā)酵液于中性或微堿性條件下可獲得較高的谷氨酸產(chǎn)量?？刂瓢l(fā)酵條件，實(shí)質(zhì)上是利用微生物本身固有的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)來(lái)改變它的代謝方向，使之朝著人們希望的方向進(jìn)行。為了達(dá)到目的，需要正確的代謝調(diào)控理論作指導(dǎo)。

(2)使用誘導(dǎo)物：許多與蛋白質(zhì)、糖類和其它物質(zhì)降解有關(guān)的水解酶類都屬于誘導(dǎo)酶，在培養(yǎng)和發(fā)酵過(guò)程中加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物可以增加酶的產(chǎn)量。如用木霉發(fā)酵纖維素酶，加槐糖可誘導(dǎo)纖維素酶的產(chǎn)生，木糖可誘導(dǎo)半纖維素酶的葡萄糖異構(gòu)酶的生成，青霉素酰化酶需要苯乙酸作為誘導(dǎo)劑，海因酶(又稱乙內(nèi)酰胺酶)發(fā)酵時(shí)加入底物類似物作誘導(dǎo)劑，可提高酶的產(chǎn)量。有時(shí)因誘導(dǎo)物比較昂貴，發(fā)酵時(shí)使用未必經(jīng)濟(jì)，可以使用廉價(jià)的不含有害物質(zhì)的粗制原料。對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)說(shuō)，其合成的代謝過(guò)程所涉及的某些酶也是誘導(dǎo)酶，需要適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物。色氨酸是麥角生物堿合成的一個(gè)前體，本身也是生物堿合成酶的誘導(dǎo)劑，色氨酸的結(jié)構(gòu)類似物也有促進(jìn)作用。但必須在生長(zhǎng)的后期加入。誘導(dǎo)物的用量應(yīng)適當(dāng)，在一定濃度范圍內(nèi)，產(chǎn)酶量與誘導(dǎo)物的用量成正比關(guān)系，當(dāng)誘導(dǎo)物過(guò)量時(shí)，可能被微生物利用，產(chǎn)生對(duì)酶合成的阻遏。也可以采用首先進(jìn)行微生物培養(yǎng)，使菌體大量生長(zhǎng)，然后加入誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生，達(dá)到節(jié)約誘導(dǎo)物的目的。(3)改變細(xì)胞通透性：在使用缺失a一酮戊二酸脫氫酶的棒狀桿菌突變株于葡萄糖培養(yǎng)基中發(fā)酵谷氨酸時(shí)，在細(xì)胞中谷氨酸積累到50毫克／克干重時(shí)，已達(dá)到飽和，由于反饋調(diào)節(jié)作用，谷氨酸的積累終止，產(chǎn)酸難于提高。若將細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸釋放出細(xì)胞，降低胞內(nèi)谷氨酸的濃度，可以解除反饋抑制。在工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，同時(shí)采用三種措施控制細(xì)胞的通透性。首先是限制培養(yǎng)基中的生物素濃度在1-5毫克／升，控制細(xì)胞壁中的脂質(zhì)合成；在細(xì)胞生長(zhǎng)期加入青霉素，抑制細(xì)胞壁肽聚糖合成中的肽鏈交聯(lián)；另外是加入表面活性劑吐溫80或陽(yáng)離子表面活性劑，將脂類從細(xì)胞壁中溶解，達(dá)到使細(xì)胞壁疏松，增加細(xì)胞壁的通透性。同樣采用增加細(xì)胞壁通透性的措施對(duì)某些胞外酶的外泌也有一定作用，如發(fā)酵過(guò)程中在培養(yǎng)基