重視碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌的檢測(孫長貴-蘭州)word版本

重視碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌的檢測(孫長貴-蘭州)一、碳青霉烯類抗生素碳青霉烯類抗生素是抗菌譜最廣，抗菌活性最強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺類抗生素，因其具有對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定以及毒性低等特點(diǎn)，已經(jīng)成為治療嚴(yán)重細(xì)菌感染最主要的抗菌藥物之一。其結(jié)構(gòu)與青霉素類的青霉環(huán)相似，不同之處在于噻唑環(huán)上的硫原子為碳所替代，且C2與C3之間存在不飽和雙鍵；另外，其6位羥乙基側(cè)鏈為反式構(gòu)象。研究證明，正是這個(gè)構(gòu)型特殊的基團(tuán)，使該類化合物具有超廣譜的、極強(qiáng)的抗菌活性，以及對β-內(nèi)酰胺酶高度的穩(wěn)定性。2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科22023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科3藥物研制公司上市年份亞胺培南美國默沙東1985年美羅培南日本住友，英國I-IC1995年厄他培南多利培南美國默沙東日本鹽也義公司2002年2005年帕尼培南比阿培南日本三共株式會社Wyeth-lederle實(shí)驗(yàn)室1994年2002年碳青霉烯類-種類目前中國上市的碳青霉烯類2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科4國內(nèi)已經(jīng)上市的品種有：亞胺培南，美洛培南，帕尼培南，法羅培南，厄他培南，比阿培南。碳青霉烯類作用機(jī)制碳青霉烯類抗生素作用方式都是抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素結(jié)合蛋白（PBPs），從而阻礙細(xì)胞壁粘肽合成，使細(xì)菌胞壁缺損，菌體膨脹致使細(xì)菌胞漿滲透壓改變和細(xì)胞溶解而殺滅細(xì)菌。2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科5碳青霉烯類抗菌譜藥物鏈球菌&MSSA腸桿菌科非發(fā)酵菌厭氧菌亞胺培南++++美羅培南++++厄他培南++活性有限+多利培南++++2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科6

腸桿菌科細(xì)菌對三種碳青霉烯的敏感性中國抗感染化療雜志2002年3月30日第二卷第一期(3051)(357)(2118)(208)(1143)(22)

非發(fā)酵革蘭陰性桿菌對三種碳青霉烯的敏感性中國抗感染化療雜志2002年3月30日第二卷第一期(1790)(169)(1365)(142)(323)如何使用碳青霉烯類?據(jù)臨床癥狀使用細(xì)菌性腦膜炎醫(yī)院相關(guān)鼻竇炎未知原因敗血癥醫(yī)院相關(guān)肺炎據(jù)臨床分離菌株使用不動桿菌銅綠假單胞菌產(chǎn)堿桿菌屬腸桿菌科摩根菌.沙雷菌.腸桿菌屬.檸檬酸桿菌屬.ESBL或AmpC大腸桿菌和克雷伯菌.2023/1/139解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科二、碳青霉烯類耐藥機(jī)制2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科10二、碳青霉烯類耐藥機(jī)制2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科11腸桿菌科ESBL或頭孢菌素酶+孔蛋白丟失碳青霉烯酶銅綠假單胞菌孔蛋白丟失上調(diào)外排泵碳青霉烯酶不動桿菌ESBL或頭孢菌素酶+孔蛋白丟失碳青霉烯酶綠膿桿菌的耐藥機(jī)制

2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科12OprD2OprMMexAMexBPBPsβ-內(nèi)酰胺酶肽聚糖層細(xì)胞膜外膜堿性氨基酸美平美平

亞胺培南帕尼培南?＜菌體外膜通透性模式圖＞OprD缺失對碳青霉烯類的影響D2通道缺失所導(dǎo)致的MIC變化（綠膿桿菌）綠膿桿菌外膜通透性示意圖對碳青霉烯敏感的綠膿桿菌美平D2通道對碳青霉烯敏感的綠膿菌（PAo2152株）D2通道缺失的綠膿桿菌A（PAo2152株）D2通道缺失的綠膿桿菌B（PAo2152株）帕尼培南亞胺培南美平0.781.563.136.2512.5(mg/ml)SumitaYetal.：Chemotherapy,42,47-56,1996JosephP.Laconisetal.：ClinicalInfectiousDiseases,24（Suppl2）,S191-196,1997AdaptedwithpermissionfromLivermoreDM.ClinInfectDis2002;34:634-640.亞胺培南和美羅培南由此進(jìn)入美羅培南被泵出細(xì)胞外，但亞胺培南不受影響主動泵出系統(tǒng)流出通道(OprM)外膜胞漿周圍間隙連接脂蛋白(MexA)胞漿膜流出泵系統(tǒng)(MexB)膜孔蛋白美羅培南被泵出細(xì)胞外，但亞胺培南不受影響碳青霉烯酶-內(nèi)酰胺酶家族中最重要的成員Twomajorgroupsbasedonthehydrolyticmechanismattheactivesite活性部位-絲氨酸:

classA和D活性部位-鋅離子:

classB碳青霉烯酶水解青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類15解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶金屬β-內(nèi)酰胺酶HNOCCHCH2OHH2OZnZnOHH平松啓一編：耐性菌感染癥的理論與実際,1998碳青霉烯酶分類2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科17分類

代表酶最常見細(xì)菌ClassAKPC,SME,IMI,NMC,GES腸桿菌科(銅綠假單胞菌罕見報(bào)告)ClassB(金屬-b-內(nèi)酰胺酶)IMP,VIM,GIM,SPM，NDM-1銅綠假單胞菌腸桿菌科不動桿菌ClassDOXA23,-40,-51,-58不動桿菌KPC

酶

位于質(zhì)粒上；接合和

非接合blaKPC

可水平傳播blaKPC

可與介導(dǎo)其他耐藥的基因共同存在:廣譜b-內(nèi)酰胺酶超廣譜b-內(nèi)酰胺酶氨基糖苷類耐藥氟喹諾酮類耐藥leadstoextensive-drugresistance(XDR)亞型：KPC-1~KPC-122023/1/1318解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科NDM-1酶已有研究結(jié)果表明編碼NDM-1酶基因主要位于質(zhì)粒上，質(zhì)粒大小可不同（肺炎克雷伯菌180kb質(zhì)粒，大腸埃希菌140kb質(zhì)粒），提示blaNDM-1基因可在菌株間轉(zhuǎn)移和傳播。少數(shù)分離菌blaNDM-1基因位于染色體上。blaNDM-1基因編碼區(qū)GC含量（57%）比周圍DNA序列（62%~65%）低，表明其是外源轉(zhuǎn)移獲得的新DNA片段?；蛉L826bp。NDM-1酶分子量為28kDa，等電點(diǎn)（pI）6.9。解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科2023/1/1319三、產(chǎn)碳青霉烯酶菌株流行與分布2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科20碳青霉烯酶在臨床菌株中流行2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科21酶類細(xì)菌KPC腸桿菌科金屬-b-內(nèi)酰胺酶(IMP,VIM)銅綠假單胞菌OXA不動桿菌SME粘質(zhì)沙雷菌肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)KPC是A類

b-內(nèi)酰胺酶賦予細(xì)菌對所有b-內(nèi)酰胺類包括超廣譜頭孢菌素類和碳青霉烯類

耐藥。出現(xiàn)于腸桿菌科菌最常見于肺炎克雷伯菌。1996年在美國發(fā)現(xiàn)，2001年報(bào)道。也在下列菌中發(fā)現(xiàn):產(chǎn)酸克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌、腸桿菌屬、大腸埃希菌、沙門菌和沙雷菌。

在銅綠假單胞菌中也有報(bào)道(南美)2023/1/1322解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌敏感譜抗菌藥物結(jié)果解釋抗菌藥物結(jié)果解釋阿米卡星I氯霉素R阿莫西林/clavR環(huán)丙沙星R氨芐西林R厄他培南R氨曲南R慶大霉素R頭孢唑啉R亞胺培南R頭孢泊肟R美羅培南R頭孢噻肟R哌拉西林/TazoR頭孢替坦R妥布霉素R頭孢西丁R復(fù)方新諾明R頭孢他啶R多粘菌素BMIC>4mg/ml頭孢曲松R黏菌素MIC>4mg/ml頭孢吡肟R替甲環(huán)素S美國產(chǎn)KPC菌株地理分布經(jīng)常發(fā)生散發(fā)的2023/1/1324解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科美國以外KPC分布法國

(Nassetal.2005.AAC49:4423-4424)新加坡

(reportfromsurvey)波多黎各

(ICAAC2007)哥倫比亞

(Villegasetal.2006.AAC50:2880-2882&ICAAC07)巴西

(ICAAC2007)以色列(Navon-Veneziaetal.2006.AAC50:3098-3101)中國

(WeiZ,etal.2007.AAC51:763-765)其他國家和地區(qū)2023/1/1325解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科26美國以外KPC分布NormanPetal.LID2009K.Pneumoniaewithcarbapenemase-producingclones27Dr.T.V.RaoMD其他型碳青霉烯酶分布2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科28四、實(shí)驗(yàn)室檢測2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科29四、實(shí)驗(yàn)室檢測由碳青霉烯酶介導(dǎo)的耐藥，在臨床實(shí)驗(yàn)室可通過常規(guī)表型試驗(yàn)方法來檢測，包括紙片擴(kuò)散法和改良Hodge試驗(yàn)。最終鑒定需檢測耐藥基因來進(jìn)行確認(rèn)。2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科30表型檢測－紙片擴(kuò)散、

MIC

&Etest2023/1/1331解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科CLSI推薦解釋標(biāo)準(zhǔn)M100文件表型檢測－紙片擴(kuò)散法

藥物CLSIM100-S19CLSIM100-S23SIRSIR多利培南－－－≥2320-22≤19厄他培南≥1916-18≤15≥2320-22≤19亞胺培南≥1614-15≤13≥2320-22≤19美羅培南≥1614-15≤13≥2320-22≤19解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科表型檢測－MIC法2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科33藥物CLSIM100-S19CLSIM100-S23SIRSIR多利培南－－－≤12≥4厄他培南≤24≥8≤0.250.5≥1亞胺培南≤48≥16≤12≥4美羅培南≤48≥16≤12≥4耐藥酶表型檢測2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科34KPC-產(chǎn)生菌實(shí)驗(yàn)室檢測：問題:1、某些分離菌株被證明低水平對碳青霉烯類耐藥2、某些自動化系統(tǒng)缺泛檢測低水平碳青霉烯類耐藥的能力。碳青霉烯酶表型試驗(yàn)改良Hodge試驗(yàn)（ModifiedHodgeTest）100%sensitivityindetectingKPC;alsopositivewhenothercarbapenemasesarepresent100%specificityProceduredescribedbyLeeetal.CMI,7,88-102.2001.2023/1/1335解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科ModifiedHodgeTestLawnofE.coliATCC259221:10dilutionofa0.5McFarlandsuspensionImipenemdiskTestisolatesDescribedbyLeeetal.CMI,7,88-102.2001.36解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科37雙紙片協(xié)同試驗(yàn)－金屬酶解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科2023/1/1338雙紙片增效試驗(yàn)解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科2023/1/1339KPC、NDM-1等酶產(chǎn)生菌最終確定PCR檢測耐藥基因確認(rèn)方法402023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科412023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科42測序結(jié)果判讀測序彩圖：峰體清晰、無套峰2023/1/1343序列比對2023/1/13解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科44測序結(jié)果經(jīng)BLAST與基因數(shù)據(jù)為中已知序列比對分析，最終確定基因型。/nuccore產(chǎn)KPC菌株治療替加環(huán)素(100.0%有效)黏菌素(88.1%有效)SENTRYreport.AAC.2008.Feb;52(2):570-3米諾環(huán)素

根據(jù)藥敏試驗(yàn)選擇解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科45新德里金屬-?-內(nèi)酰胺酶（NDM-1)2023/1/1346解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科Firstreportedin2009frompatientwho

traveledtoIndiaAdditional183isolatesreportedin2010fromIndia,Pakistan,U.K.,andU.S.-K.pneumoniae,E.coli,Enterobacter,

Proteus,CitrobacterNDM-1carriedonplasmidsofvarious

sizesYong,AAC53:5046,2009;Kumarasamy,Lancet3099,2010;Patel,2010NDM-1實(shí)驗(yàn)室檢測：常規(guī)藥敏試驗(yàn)方法分子生物學(xué)方法2023/1/1347解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科NDM-1基因確證

采用blaNDM-1基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測序，確定菌株是否攜帶blaNDM-1基因。引物一：上游5′-ACCGCCTGGACCGATGACCA-3′

下游5′-GCCAAAGTTGGGCGCGGTTG-3′引物二：上游5′-GGCGGAATGGCTCATCACGA-3′下游5′-CGCAACACAGCCTGACTTTC-3′解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科2023/1/1348引物引物序列（5＇→3＇）產(chǎn)物大?。╞p）退火溫度(℃)引物117U-191CAGCAC