蛋白質(zhì)和氨基酸測定1(2學時+)資料word版本

蛋白質(zhì)和氨基酸測定1(2學時+)資料椰子汁中蛋白加熱沉淀黃酒貯藏中的沉淀大部分為蛋白質(zhì)2、影響食品色、香、味及結構面筋蛋白：面包粉≥33%；蛋糕粉:≤22%饅頭粉25%-30%（

SB/T-93

）2第一節(jié)蛋白質(zhì)的定量測定定量方法：凱氏定氮法及分光光度法。一、凱氏定氮法奶粉中測得氮含量為2.12%,蛋白質(zhì)含氮為16%，奶粉中蛋白質(zhì)含量?

換算系數(shù)通常6.25，牛乳及制品為6.38，大豆及制品為5.71等。3CHON脫水性：將H、O按2：1比例脫去，剩下C、N氧化性：2H2SO4+C＝2SO2↑+2H2O+CO2↑3SO2+2N+3H2O=3SO3↑+2NH3↑H2SO4

酸性：H2SO4+2NH3=(NH4)2SO4

丹麥化學家JohanKjeldahl（1883）發(fā)明的，當時只用H2SO4分解試樣，需長時間，后來Gunning改進，在消化時加入K2SO4使沸點上升從而加快分解速度。后來……41、原理樣品與硫酸、催化劑加熱消化，蛋白質(zhì)分解，其中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而氮轉化為氨，與硫酸結合成硫酸銨，加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后以鹽酸滴定。硫酸鉀之目的：提高沸點，加快有機物分解；硫酸銅之目的：催化劑、消化終點的指示劑（CuSO4藍綠色如果沒消化完全，則為Cu2SO4）、蒸餾前加入堿量合適否的指示劑。2CuSO4+C=Cu2SO4+SO2+CO2

Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+SO2+2H2O52、過程——消化、蒸餾、吸收、滴定（1）消化小火至泡沫消失→加大火力至透明無黑粒，搖動使瓶壁炭粒溶于硫酸中→繼續(xù)消化30min→綠色6（2）蒸餾與吸收常量凱氏定氮微量凱氏定氮改良微量凱氏定氮7A、蒸餾完全判斷

經(jīng)驗時間：常量凱氏定氮約30min，微量定氮裝置中是指示劑變色后，再蒸餾10min，提離液面，再蒸餾1min；萘氏試劑遇氨氣呈紅棕色。

配制：3.5gKI+1.3gHgCl2

溶于70ml水，加4mol/lNaOH30ml。B、吸收用2%或4%硼酸作為吸收液，應注意接收管浸沒在吸收液中。C、常量、半微量、微量概念8常量：＞0.1g，＞10mL；半微量：0.01g-0.1g，1mL-10mL；微量：0.1mg-10mg，0.01mL-1mL。

eg:稱樣0.85g,消化后，直接蒸餾，取出消化液，定容至100mL，取其中的10mL蒸餾……常量凱氏定氮改良微量凱氏定氮9（3）滴定

(NH4)2B4O7+HCl+H20→NH4Cl+H3BO3

用鹽酸標準溶液滴定吸收有氨氣的硼酸液。指示劑：0.1%甲基紅+0.1%溴甲酚綠終點判定

2%硼酸溶液，藍綠色→灰色

4%硼酸溶液，藍綠色→酒紅色主要與混合指示劑的變色范圍有關：

pH＜4.0紅色

=5.1灰色＞6.2綠色10樣品中被惡意添加硫酸銨、氯化銨，？樣品中被惡意添加硝酸銨，？樣品中被惡意添加碳酸銨，？樣品中被惡意添加尿素、三聚氰胺，？N含量66.67%11策略一：甲醛法測定樣品消化前銨鹽含量

4NH4++6HCHO=(CH2）6N4H++3H++6H2O

OH-

六次甲基四胺（弱堿，pH8.7）

(NH4+是極弱的酸，不能直接用NaOH滴定）過程：樣品+適量蒸餾水→NaOH中和游離酸（甲基紅指示劑，紅色變橙色，pH為4.4－6.2

）→加入甲醛→充分搖勻,靜置5min→用NaOH標準溶液進行滴定（酚酞指示劑，pH為8.0－9.6

）12注意：A、中和游離酸時只能用甲基紅指示劑，如果甲醛中有甲酸，宜用NaOH先中和，此時指示劑用酚酞。B、但要注意，甲醛也能和氨基酸發(fā)生反應，且能使酸性相對凸顯。C、碳酸銨不能用這種方法測定，因為生產(chǎn)的碳酸為弱酸，不能用NaOH滴定，況且CO2會揮發(fā)。D、硝酸銨中NO3-中的N不能被直接測出，但可以通過分子式中的定量關系求出。13策略二：牛奶中銨鹽的定性檢測2NH4++2I-+2ClO-=NHI2↓+NH3+2Cl-+2H2O過程：奶樣5ml，加入KI約0.25g，緩慢逐滴加入含NaClO5%的NaOH混合試劑，并同時觀察奶樣與最后所加試劑兩者界面處的顏色變化，若出現(xiàn)棕灰至黑色渾濁，表明樣品摻有銨鹽。（于琴，董文賓，趙旭博，鄭丹.鮮奶中銨鹽快速檢測新方法研究.中國乳品工業(yè).2004，32，8.）14策略三：非蛋白質(zhì)有機物物中的N，改用別的方法來測定蛋白質(zhì)或別的方法測定惡意添加物。

三聚氰胺檢測（GB/T22388-2008）HPLC（高效液相色譜法）、HPLC-MC、GC-MSHPLCA、提取超聲波及振蕩下，三氯乙酸、乙腈混合提取，三氯乙酸沉淀蛋白，離心除雜。B、凈化

陽離子固相萃取柱，用水、甲醇洗脫除雜，氨化乙醇洗脫，收集洗脫液，備用。15C、測定

C8或C18柱流動相：檸檬酸、辛烷磺酸鈉、乙腈組成流速1mL/min，柱溫40℃，進樣量20μL

波長240nm。16二、分光光度法方法原理紫外吸收法蛋白質(zhì)在280nm處有吸收。

考馬斯亮藍比色法考馬斯亮藍使蛋白質(zhì)染色，在620nm處有最大吸收（標準物質(zhì)：牛血清蛋白bovineserumalbumin）。雙縮脲法雙縮脲與堿性銅生成紫紅色配合物，在560nm處有最大吸收。（備注1）lowry法蛋白質(zhì)-銅絡合物中的酪氨酸及色氨酸殘基使磷鉬酸-磷鎢酸（Folinphenolreagent）還原成藍色物質(zhì)。（備注2）17備注1：雙縮脲法18備注2：（1）lowry法的原理色澤的變化主要緣于鉬、鎢化學價的降低，該物質(zhì)的吸收波長在550-750nm之間，當?shù)鞍踪|(zhì)濃度在1-100μg/ml時，用750nm或660nm，當?shù)鞍踪|(zhì)含量更高時，用550nm。沒有銅離子時，色澤由蛋白質(zhì)中的酪氨酸及色氨酸殘基含量決定，其次是半胱氨酸和組氨酸殘基含量決定，銅離子將肽鍵聚合在一起，從而加速了電子的傳遞。

干擾物質(zhì)較多：檸檬酸，tris，甘氨酸，組氨酸，谷氨酸，EDTA，葡萄糖，果糖，高濃度的尿素，硫酸銨等都有影響。19（2）試劑組成（/hansen/protocols/lowry.htm）LowryA:2%Na2CO3in0.1MNaOH

LowryB:1%CuSO4indiH2O

LowryC:2%sodiumpotassiumtartrate(NaKC4H4O6?4H2O)Lowrystockreagent

49mlLowryA

0.5mlLowryB

0.5mlLowryCFolin'sReagent:Phenolreagent-2N(Folin-Ciocalteaureagent)

主要成分為：3H2O?P2O5?13WO3?5MoO3?10H2O3H2OxP2O5?14WO3?4MoO3?10H2O（/wiki/Folin%E2%80%93Ciocalteu_reagent

）Folinphenol試劑還可以測定酚類物質(zhì)的含量（鄭鴻元許光輝李鳳珍等.土壤微生物分析方法手冊.中國農(nóng)業(yè)出版社，1986.）20（3）該法的歷史

吳憲博士[（1893—1959年）是國際著名生物化學家、中國近代生物化學事業(yè)的開拓者和奠基人]于1922年發(fā)現(xiàn)Folinphenolreagent能測定蛋白質(zhì)

(Wu,H.(1922)J.Biol.Chem.51,33–39)。

Lowry發(fā)現(xiàn)，在此前，先讓蛋白質(zhì)與銅發(fā)生發(fā)生絡合反應（雙縮脲法），能提高反應的靈敏度(Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,A.L.andRandall,R.J.(1951)J.Biol.Chem.193,265–275）。21第二節(jié)蛋白質(zhì)定性（略）定性蛋白質(zhì)主要是通過顯色反應完成。

常用顯色劑：氨基黑10B、溴酚藍、考馬斯亮藍、酸性品紅、氨基萘酚磺酸。另外對于糖蛋白及脂蛋白都有專門的顯色劑。

22第三節(jié)氨基酸定性一、一般顯色反應

茚三酮法：藍紫色。二、個別氨基酸的顯色反應（略）精氨酸的坂口反應、胱氨酸和半胱氨酸的顯色反應等。23第四節(jié)氨基酸定量一、甲醛滴定法1、原理酸性的-COOH，堿性的-NH2，使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽，加入甲醛溶液時，-NH2與甲醛結合，其堿性消失，用堿滴定-COOH基，以間接方法測定氨基酸的量。2、大約過程加堿中和酸（pH8.2）、加入甲醛，加堿滴定。當加入甲醛后，溶液的pH值還在8.2嗎？當樣品中存在ＮＨ4+時,則測定結果偏大偏??？如何排除這種影響？24阮富升.銨鹽對甲醛法測定醬油氨基氮含量的影響.中國調(diào)味品.第8期1999年8月.甲醛不但與氨基酸的氨基起反應,同時也與ＮＨ4+起反應，增加了反應體系的酸性，這部分酸性不能代表氨基酸的羧基的酸性。因此，以氫氧化鈉標準溶液滴定時，會消耗更多的氫氧化鈉標準溶液，使氨基氮計算結果升高。4NH4++6HCHO=(CH2）6N4H++3H++6H2O25二、比色法1、茚三酮法氨基酸與茚三酮生成藍紫色化合物二酮茚胺，該物在570nm有最大吸收（但脯氨酸和羥脯氨酸由于α氨基被取代，生成物顯黃色440nm有最大吸收）。26

茚三酮反應的適宜pH為5-7

所有α-氨基酸和蛋白質(zhì)都有此反應，但有此反應的不一定都是α-氨基酸和蛋白質(zhì)，比如β-丙氨酸、氨、許多一級胺與茚三酮都呈陽性。（鄭繼平，湯華，陳銀華.現(xiàn)代生物學實驗指導.中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.）但色澤不一定一樣，比如，γ-氨基酸呈黃色，苯胺橙紅色。（楊桂法等.有機化學分析.湖南大學出版社，1996.

）27

但課本P140所談及的及GB/T8314-2002茶游離氨基酸總量測定時：α-氨基酸在pH8.0的條件下與茚三酮共熱，形成紫色絡合物，用分光光度法在特定的波長下測定其含量。茚三酮受陽光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化，使用前用活性炭吸附被氧化物而純化。282、鄰苯二甲醛法（O-Phthalicaldehyde,OPT)鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，堿性溶液中，與氨基酸產(chǎn)生熒光物質(zhì)，激發(fā)光波長為340nm，發(fā)射光波長為455nm。靈敏度比茚三酮高，但熒光強度與氨基酸種類有關，對半胱氨酸、胱氨酸和賴氨酸等的熒光值偏低，和脯氨酸和羥脯氨酸不反應，尿素、尿酸及氨等不發(fā)生類似反應。293、三硝基苯磺酸法（TriNitroBenzeneSulfonicacid

）30與茚三酮相比：靈敏度相當，且不受NH4+的影響，但不能與Pro反應，可以和Cys的-SH反應，為此，TNBS前，堿性條件下30℃保溫數(shù)小時，使-SH都氧化成-S-S-后，再測定。堿性條件下測定的優(yōu)勢是可以用420nm，在可見光范圍內(nèi)，劣勢是每種氨基酸的消光系數(shù)不同；酸性條件下的優(yōu)勢是每種氨基酸的消光系數(shù)同，但需紫外光。314、丹磺酰氯法（dansylchloride）丹磺酰氯是5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯（5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonylchloride）的簡稱。丹磺酰氯與氨基酸反應生成熒光性質(zhì)強和穩(wěn)定的磺胺衍生物(激發(fā)波長298nm，發(fā)射波長546nm），也常用于多肽鏈的N末端氨基酸的鑒定。325、2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB）法DNFB也叫做Sanger試劑，DNFB在弱堿性溶液中與氨基酸發(fā)生取代反應，生成黃色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitrophenylaminoacid,DNP氨基酸）331.0mL的0.2mol/LNaHCO3,1.0mL的1%DNFB(1.0mL溶解在100mL的1,4-dioxane)，1.0mL樣品液,黑暗處60℃，40min,加入0.5mLof1mol/LHCl終止反應，加入5mL乙酸乙酯萃取，靜置10min,420nm測定，氨基酸濃度0.02–1.00mg/mL有良好的線性關系（LinChen，etal.Anovelcolorimetricdeterminationoffreeaminoacidscontentinteainfusionswith2,4-dinitrofluorobenzene.JournalofFoodCompositionandAnalysis22(2009)137–141）。34方法靈敏度脯氨酸、羥脯氨酸受氨的影響茚三酮能反應有影響鄰苯二甲醛比茚三酮高不反應不影響三硝基苯磺酸與茚三酮同不反應不影響丹磺酰氯比茚三酮高反應未知2,4-二硝基氟苯比茚三酮高反應未知幾種比色法的比較35第五節(jié)氨基酸分離及測定一、蛋白質(zhì)的水解酸水解：5.7mol/L鹽酸，密封的水解管中，105-115℃水解20h以上。鹽酸水解后，色氨酸全部被破壞。堿水解：5mol/LNaOH，充氮氣后填充