名師課件：高中生物人教版 選擇性必修三第三章第二節(jié)基因工程的基本操作程序

第2節(jié)基因工程的基本操作程序（第二課時(shí)）第3章基因工程2023/1/132023/1/13四、目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測(cè)與鑒定才能知道。1.分子水平的檢測(cè)（1）PCR等技術(shù)檢測(cè)受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA

在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標(biāo)記，以此作為探針，使探針與基因組DNA或mRNA雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因插入成功或轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。2023/1/13（2）抗原—抗體雜交技術(shù)檢測(cè)目的基因是否翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。

從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質(zhì)。2.個(gè)體生物學(xué)水平的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實(shí)驗(yàn)）害蟲死亡病毒（菌）感染（抗病接種實(shí)驗(yàn)）未出現(xiàn)病斑鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常2023/1/131.在實(shí)際種植過程中，棉鈴蟲是否對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性？證據(jù)是什么？到社會(huì)中去

科研人員對(duì)長(zhǎng)江流域種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護(hù)所，靶標(biāo)害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國(guó)、澳大利亞、印度等國(guó)的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，通過毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個(gè)高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。2023/1/132.科研工作者在沒有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對(duì)。他們想出的延緩棉鈴蟲對(duì)Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？到社會(huì)中去

科研人員想出的延緩棉鈴蟲對(duì)Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個(gè)方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個(gè)殺蟲基因、構(gòu)建組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子、提高殺蟲基因的表達(dá)量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉(zhuǎn)入了一種Bt基因，抗性比較單一；現(xiàn)在經(jīng)常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同時(shí)轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產(chǎn)生和發(fā)展，還可以通過不同基因間的互補(bǔ)作用擴(kuò)大抗蟲范圍。（2）田間策略。這是在種植時(shí)采取的措施，如提供庇護(hù)所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國(guó)等地普遍采取的措施是在轉(zhuǎn)基2023/1/13到社會(huì)中去因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲劑的非轉(zhuǎn)基因棉花，或在轉(zhuǎn)基因棉田周圍種植20%～30%面積的可使用化學(xué)殺蟲劑的非轉(zhuǎn)基因棉花；在印度，一些地區(qū)要求，在轉(zhuǎn)基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉(zhuǎn)基因棉花。我國(guó)除新疆棉區(qū)及大型農(nóng)場(chǎng)需設(shè)計(jì)專門的庇護(hù)所外，其他棉區(qū)如長(zhǎng)江、黃河流域棉區(qū)多采用多種作物混作的耕作制度(如將轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉鈴蟲寄主作物混作)，這些作物可以構(gòu)成天然的庇護(hù)所，一般無須種植非轉(zhuǎn)基因棉花作為庇護(hù)所。這樣做的原理是為少部分害蟲提供一個(gè)正常的取食環(huán)境，始終保持一定的敏感目標(biāo)害蟲種群。這樣，即使目標(biāo)害蟲對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉產(chǎn)生了抗性，但是因?yàn)槠渑c敏感目標(biāo)害蟲交配，后代抗性基因會(huì)發(fā)生分離，所以抗性目標(biāo)害蟲的種群也不至于迅速增加。（3）國(guó)家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實(shí)施分區(qū)種植管理、加強(qiáng)抗性監(jiān)測(cè)、進(jìn)行嚴(yán)格的安全生評(píng)價(jià)等。2023/1/13探究·實(shí)踐·DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（一）實(shí)驗(yàn)原理1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理：（1）PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。（2）PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了DNA半保留復(fù)制的原理。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。2.DNA片段電泳鑒定的原理：（1）DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。（2）PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象（遷移速率與之呈負(fù)相關(guān)）等有關(guān)。（3）凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來。10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL2023/1/13（二）材料用具1.試劑：（1）無菌水、瓊脂糖；（2）電泳緩沖液（TAE或TBE）；（3）凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑——溴酚藍(lán)）；（4）核酸染料（常用核酸染料為EB即溴化乙錠）。（5）PCR反應(yīng)體系的配方2023/1/132.用具：（1）PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）；（2）微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）；（3）微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）；（4）一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）；（5）電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）1.DNA片段的擴(kuò)增移液用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分離心待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）反應(yīng)參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min可根據(jù)目的片段長(zhǎng)度適當(dāng)調(diào)整延伸時(shí)間2023/1/13（三）方法步驟預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻制備凝膠將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜加樣將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物電泳接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相2023/1/132.DNA片段的電泳鑒定2023/1/13（四）注意1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。2023/1/13結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？2.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因。

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶，該片段大小約為750bp。

如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取Ｈ绻麛U(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。1.下列屬于PCR技術(shù)所需條件的是（） ①單鏈的核苷酸序列引物②目的基因所在的DNA片段③脫氧核苷酸④核糖核苷酸⑤DNA連接酶⑥D(zhuǎn)NA聚合酶⑦限制酶A.①②③⑤ B.①②③⑥C.①②③⑤⑦ D.①②④⑤⑦2.質(zhì)粒上的抗性基因在基因工程中的主要作用是()A.使目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)易于表達(dá)B.使受體細(xì)胞具有抗藥性C.有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)D.促進(jìn)目的基因與導(dǎo)入的外源基因相連接，提高轉(zhuǎn)基因操作的成功率B2023/1/13課堂練習(xí)C3.科學(xué)家已能運(yùn)用基因工程技術(shù)，讓羊合成并由乳腺分泌抗體，相關(guān)敘述中正確的是()①該技術(shù)將導(dǎo)致定向變異；②DNA連接酶能把目的基因與載體黏性末端的堿基對(duì)連接起來；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí)采用顯微注射技術(shù)；④受精卵是理想的受體。A.①②④B.①③④C.②③④D.①②③④4.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的方法正確的是（）①將毒素蛋白注射到棉受精卵中；②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入農(nóng)桿菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)；④將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，借助花粉管通道進(jìn)入受精卵。A.①②B.③④C.②③D.①④B2023/1/13課堂練習(xí)B5.利用人胰島B細(xì)胞構(gòu)建cDNA文庫(kù)，然后通過核酸分子雜交技術(shù)從中篩選目的基因，篩選過程如下圖所示。下列說法不正確的是()A.cDNA文庫(kù)的構(gòu)建需要用到逆轉(zhuǎn)錄酶B.圖中的菌落是通過稀釋涂布平板法獲得的C.核酸分子雜交的原理是堿基互補(bǔ)配對(duì)D.從該文庫(kù)中可以篩選到胰高血糖素基因6.下列有關(guān)基因工程中目的基因的檢測(cè)與鑒定的說法錯(cuò)誤的是()A.通過PCR等技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因B.通過PCR等技術(shù)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄C.檢測(cè)目的基因是否表達(dá)用抗原——抗體雜交的方法D.目的基因的檢測(cè)與鑒定是基因工程的核心步驟D2023/1/13課堂練習(xí)D拓展應(yīng)用2023/1/131.外源基因插入基因組中可能為單位點(diǎn)插入，或者同一染色體多位點(diǎn)插入，或者不同染色體多位點(diǎn)插入。大多數(shù)情況下，插入的位點(diǎn)難以做到定點(diǎn)插入；插入的拷貝數(shù)也是隨機(jī)的。因此，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳是很復(fù)雜的。例如，科研人員在對(duì)轉(zhuǎn)GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的煙草進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株的染色體DNA中整合了多個(gè)拷貝的基因，從而導(dǎo)致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩(wěn)定性。2.（1）crtⅠ基因和psy基因pmi基因?qū)⒛康幕蛩腿胨炯?xì)胞。（2）不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的識(shí)別序列，限制酶可能將它切斷。（3）維生素A在人體內(nèi)具有非常重要的生理功能，對(duì)視力、骨骼生長(zhǎng)