Pyrosequencing技術(shù)及其應(yīng)用

Pyrosequencing?Technology

-PyroMarkTMIDDNA分析系統(tǒng)JiabingCaoApplicationDepartmentGeneCompanyLtd關(guān)于BiotagePyrosequencing這項專利技術(shù)完全由Biotage公司擁有Biotage的前身即PyrosequencingAB成立于1997年，總部位于瑞典第三大城市Uppsala2003年并購另外兩家公司后更名為BiotageAB公司通過直接銷售部門及代理商已向全世界40多個國家提供了超過600套Pyrosequencing系統(tǒng)隨著Pyrosequencing技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，近兩年來，其市場也呈現(xiàn)快速增長的趨勢作為一家高技術(shù)公司，強大的技術(shù)支持隊伍是我們引以為傲的資源超過30％的職員從事客戶與技術(shù)支持工作ANewLightonGeneticAnalysis一種全新的基于酶級聯(lián)反應(yīng)的新型遺傳定量分析技術(shù)一套完整的實驗方案；諸多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用……挑戰(zhàn)你的極限想象力Pyrosequencing遺傳分析技術(shù)PyrosequencingTMtechnologyPPiATPlighttime

C GTTCCACCT

相應(yīng)位置的峰代表該種dNTP的摻入情況峰高與摻入的核苷酸數(shù)量成正比多余的dNTP在加入下一種dNTP前就被降解Pyrogram?Pyrosequencing焦磷酸測序技術(shù)的特點唯一得到定量序列結(jié)果的技術(shù)極高的準(zhǔn)確性Built-InQC重現(xiàn)性極佳，接近100%通用型技術(shù)平臺功能多樣，應(yīng)用領(lǐng)域極廣可以用于任何遺傳多態(tài)性的分析甲基化研究的最佳平臺高通量、低成本,快速臨床微生物診斷手段實驗設(shè)計靈活自動化程度高，操作簡單AseasyasPCR，asreliableassequencing強大的技術(shù)支持ESGCTAGTAGAGC/CESGCTAGTAGAGT/TESGCTAGTAGAGC/TWhatare”InbuiltControls”?SincePyrosequencingshowspolymorphismswithsequencecontext,youcanalwaystrustthevalidityofthedata.

1分子的dNTP摻入，釋放出1分子的PPi，生成1分子的ATP，產(chǎn)生單位強度的光信號TGGCCGGGTCACGAGGCCCTA...

Triple

DoubleSingleWhyPyrosequencingisquantitative？1.00.00.50.50.01.0Expected1.090.050.550.560.021.05Average0.02n.d.0.030.03n.d.0.03CVC/CC/GG/Gn=190Pyrosequencing：QuantitativeAccuracyTestPyrosequencing：facility&convenience實驗設(shè)計方便，使用AssayDesignSW方便快速設(shè)計反應(yīng)的最佳引物。實驗快速，96個樣本，SNP反應(yīng)10分鐘左右，SQA測序反應(yīng)1小時左右，2分鐘完成數(shù)據(jù)結(jié)果分析。實驗準(zhǔn)確性好，重復(fù)性高：準(zhǔn)確性接近99％重復(fù)性接近100％高通量，一次可以完成96個不同樣本的反應(yīng)和分析。自動化程度高，準(zhǔn)備好PCR單鏈后，反應(yīng)和結(jié)果分析軟件自動進行，利于標(biāo)準(zhǔn)化。操作簡單，方便學(xué)習(xí)和使用。

AseasyasPCR，asreliableassequencingPyrosequencing的運用遺傳變異方面WhatPyrosequencingcando

inGeneticVariationAnalysis

SNPAnalysis

InsertionandDeletion

MutationAnalysis

AlleleFrenquencyDetermination

CpGMethylationEstimationGeneCopyNumberTranscriptionEstimationPyrosequencingTM

技術(shù)運用于SNP與突變的研究SNPDiscoverySNPConfirmationAlleleFrequencySNPRelevanceSNPDiagnosticsVerifySNPastrueSNPFrequencyofSNPinpopulationsValidateSNPasmarkerforphenotypeUtilizationofSNPmarkers由于PyrosequencingTM技術(shù)可以通過光信號強度來定量，所以除了可以進行雙等位點分析外，還可以用于三等位、四等位位點的分析，而且能準(zhǔn)確判斷純合與雜合軟件設(shè)計周到，具備強大的數(shù)據(jù)處理能力，可以通過一個反應(yīng)來分析多個相鄰位點準(zhǔn)確性好，重現(xiàn)性高優(yōu)勢SNP位點在不同人群中的分布頻率，是群體遺傳學(xué)研究中的一項重要內(nèi)容這些位點在正常人群與病人群體中的等位型的分布差異,更是流行病學(xué)、分子病理學(xué)乃至分子診斷的一項重要課題PyrosequencingTM

技術(shù)結(jié)合Pooling方法運用于等位頻率分析準(zhǔn)確靈敏：定量范圍5%-95%甚至更高簡便：反應(yīng)結(jié)束后軟件自動給出每個樣品的等位頻率,無需人工進行統(tǒng)計快速：只需其他方法十乃至千分之一的時間低耗：降低時間消耗的同時，成本百倍下降Pyrosequencing：AccurateQuantifyingRelativepeakheight==

peak1height

peak1height+peak2heightAllelefrequency==relativepeakheightx100(%)RelativepeakheightAllelefrequency(%)0,0000,1000,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,9001,000010203040506070809010015%30%75%Pyrosequencing：

結(jié)合Pooling方法進行等位頻率分析的技術(shù)60%10%90%5%0%75%50%25%Pooling方法的優(yōu)勢——省時、省力、省錢Theoreticalexample:Associationstudywith1000SNPsin1000healthyindividualsand1000patients

2000000analyses.Poolingstrategy:

1000SNPsin2samplepools1000X2=2000analyses2.DiscardSNPsthatarenotinformative(99%)3.Analyze1%(10SNPs)in2000individuals20000analysesIntotal:22000analyses

可以把分析SNP的原理同樣運用于分析突變，插入／缺失PyrosequencingTM

技術(shù)運用于甲基化分析研究在許多基因promotor區(qū)域，有一種稱為CpGIsland的結(jié)構(gòu)，其序列的基本單元為CpG的二聚核苷酸。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶可以把S-adenosyl-methionine的甲基轉(zhuǎn)移到CpG的C上基因的甲基化往往會引起相應(yīng)的基因沉默。許多發(fā)育相關(guān)的基因，大多數(shù)情況下均處于甲基化狀態(tài)，只有在發(fā)育的特殊階段去甲基化表達。甲基化模式是可遺傳的。甲基化研究對于了解基因的調(diào)控模式以及疾病的分子生物學(xué)機制具有重要意義：它與發(fā)育、腫瘤發(fā)生、基因印跡、X染色體失活及許多遺傳性疾病相關(guān)Methylation&DiseasesHowtoanalyzeCpGmethylation

2.PCR

amplificationTCmCU

1.BisulfitetreatmentofdenaturedDNAmCmCCU

3.Analysis:sequencing,MS-PCR,primerextension,restrictionenzymedigestion,hybridization…

orbestofall:Pyrosequencing!在重硫酸鹽的作用下，所有未甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基反應(yīng)轉(zhuǎn)變成了尿嘧啶，但是5-甲基胞嘧啶不發(fā)生轉(zhuǎn)變。能夠?qū)γ恳粋€潛在甲基化位點的甲基化程度進行定量分析，無需煩瑣的克隆以及大量的測序，基于序列這黃金標(biāo)準(zhǔn)，每個反應(yīng)都有周邊序列作為正負對照Built-inQC不但能幫助判斷Pyro反應(yīng)的準(zhǔn)確性，更能判斷前處理的完全與否。一個反應(yīng)檢測多個甲基化位點，使用最新的PyroQ-CpG軟件可以在一個反應(yīng)中對連續(xù)的20多個甲基化位點進行定量分析。無須重復(fù)試驗結(jié)果準(zhǔn)確Pyrosequencing在基因甲基化研究中的優(yōu)勢WhyPyrosequencing?

ConfidentlymeasuretheindividualdegreeofmethylationinadjacentCpGsitesinoneeasyanalysisPos1Pos2Pos3Pos4Pos5%methylationatindividualCpGsitesPos2Pos1Pos3Pos4Pos5Meanvalue6replicatesCV%60.1256.8566.8555.8763.152.92.62.71.72.9WhyPyrosequencing?Built-inQCthroughsequencecontextSequence:

C/TGGGGC/TGAGATTATC/TGTC/TGATAGC/TGGGGGWhyPyrosequencing?Nature-BornQCforcompletionofthebisulfitetreatmentBeforebisulfitetreatment:AfterbisulfitetreatmentandPCR:GCGGTCAGTGACGCGATGGAGCGGGCGYGGTTAGTGAYGYGATGGAGYGGGTAnyCnotfollowedbyaGgivesbisulfiteQCPyroQ-CpG軟件專門用于甲基化研究的軟件結(jié)合PyroGoldSQA試劑盒，可以對>100bp序列內(nèi)的20多個甲基化位點進行定量分析。實驗設(shè)計更方便，特別對多個連續(xù)的甲基化位點檢測具體巨大優(yōu)勢。需要的PCR引物盒測序引物更少，更加節(jié)約試劑，降低實驗成本。骨髓增生異常綜合征髓系白血病

PyrosequencingTM

技術(shù)運用于臨床輔助診斷Pyrosequencing：臨床檢驗的未來載脂蛋白E（APOE）與脂類轉(zhuǎn)運及脂蛋白代謝密切相關(guān)APOE的編碼基因有3種最常見的等位基因型：e2，e3和e4三者之間的主要區(qū)別在于2個位點的多態(tài)性所導(dǎo)致APOE蛋白112位及158位氨基酸替換3種等位基因在不同的人群中有不同的分布

e3是在人群中分布最為普遍的e4

會提高總膽固醇濃度，增加晚發(fā)性家族型及散發(fā)性AD的發(fā)病風(fēng)險，提早發(fā)病年齡；是胎兒期因碘缺乏引起的智力缺陷的風(fēng)險因子；還與腎病及糖尿病的發(fā)病有關(guān)e2則能夠降低總膽固醇及AD的發(fā)病幾率，同時可能與長壽相關(guān)Pyrosequencing：臨床檢驗的未來SPSNP112

SPSNP158FPRPB-----GGACGTG-----CCTGCACRCGCCGG----------TGCAGAA-----ACGTCTTCRCGGAC-----Pyrosequencing：臨床檢驗的未來通過一個Duplex反應(yīng)，對一段276bp的PCR產(chǎn)物內(nèi)的這兩個SNP位點同時進行分析，以確定受試者的apoe基因型，達到預(yù)警及輔助診斷的目的。Pyrosequencing：臨床檢驗的未來e4/e4e2/e2e3/e4e2/e3Pyrosequencing：檢測試劑盒Pyrosequencing：臨床檢驗的未來

用Pyrosequencing技術(shù)分析RET基因Exon10、11、13、14、16中的共9個突變位點對217個MEN2陰性及230個MEN2陽性患者進行檢測陰性符合率100%，陽性符合率99.6%Conclusion：Pyrosequencingtechnologyoffersanaccurate,nonisotopic,simple,andrapidmethodfortheanalysisofDNAfrompatientssuspectedofhavingMEN2.多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病

Pyrosequencing與HLA分型PyrosequencingTM

技術(shù)運用于藥物基因組學(xué)研究DifferentallelesVariabilityinenzymeactivityIndividualizeddrugs/dose?PyrosequencingApplication：

CYP450Variation&PharmacogeneticsCYP是一個超基因家族目前已知的基因數(shù)目超過2400個所有基因均源于同一個ancestorgene(beforeeuc/procdiv.)其產(chǎn)物通常都包含一個Hemegroup,催化多種代謝反應(yīng)CYP與絕大多數(shù)臨床使用的藥物的代謝均密切相關(guān)，尤其是CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19

Application：

CYP450Variation&PharmacogeneticsMajorallelescovered,moreinpipelineGCAC[A]GG....A2549del(allele3)TGC/TG....C2850T(allele2)ACA/CTCCGG…A2935C(allele7)ThereticaloutcomeNormalNormalHeterozygousallele3A/-Heterozygousallele2C/TApplication：

CYP2D6Multiplexassay(alleles2,3,7)CAG[T]GGGTG...T1707del(allele6)TCCG/TGT...G1758T(allele8)AG/AGACGCCC...G1846A(allele4)TheoreticaloutcomeNormalNormalHomozygousallele4A/AHeterozygousallele6T/-Application：

CYP2D6Multiplexassay(alleles4,6,8)TCCC/TGGG...G681A(allele2)ATC/TCAGGGGG...G636A(allele3)GCTTCAA/GTGG...A1G(allele4)Normal*1*2C/T*1*4G/ATheoreticaloutcomeforNormalApplication：

CYP2C19Multiplexassay(alleles2,3,4)基因印記與遺傳性疾病西拉綜合癥，貝-威，普-威/安格爾曼綜合癥癌癥基細胞及鱗狀上皮細胞癌，腺瘤型息肉，乳癌，結(jié)腸/直腸癌，皮膚癌，白血病，前列腺癌，惡性黑色素瘤，纖維神經(jīng)瘤，vulvarcancer，再生障礙性貧血，何杰金病，肺癌，宮頸癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌心血管疾病，冠心病阿爾海默茲綜合癥自體免疫失調(diào)愛迪生氏病，即腎上腺性青銅性皮膚病，關(guān)節(jié)銀屑病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，重癥肌無力

血液學(xué)血色素紊亂，血小板凝集增強，某些因子的缺陷，May-Hegglinanomaly（一種血小板減少性疾?。?Fechtnersyndrome，慢性骨髓性白血病，移植后的排斥

，HLA分型神經(jīng)病學(xué)及神經(jīng)病遺傳學(xué)癲癇，肌強直性營養(yǎng)不良，多樣性硬化，良性（家族）新生兒（初期）癲癇，腦梗塞，帕金森，神經(jīng)管缺陷，肌萎縮性脊索側(cè)索硬化，進行性核上眼神經(jīng)麻痹癥，神經(jīng)退行性共濟失調(diào)，精神分裂癥，皮克癥，孤獨癥頻譜異常，驚恐障礙，癡呆癥，憂郁癥其它：WhatPyrosequencingcando

inGeneticVariationAnalysisMicrobiologyAnalysis

微生物分析

DNAsequencefromtheP3regionofthernpBgeneinStreptococcuspneumoniaePyrosequencing在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用細菌綜合鑒定分型病毒的鑒定分型真菌的鑒定分型微生物抗藥性分析ConventionalvsMolecularmethods傳統(tǒng)方法——表型測試需要培養(yǎng)耗時長受環(huán)境的影響，變數(shù)多判斷困難，有時需倚仗經(jīng)驗，有主觀性有一些微生物培養(yǎng)上很復(fù)雜，難以鑒定分子方法無需培養(yǎng)快速準(zhǔn)確即便是死樣本也可以進行分型PyroMarkID：Approach確定研究對象及相關(guān)種群尋找特征?差異基因16SrRNA,18S,23SrnpBrpoBinlBAssayDesignSoftware：在目標(biāo)基因的保守區(qū)設(shè)計PCR及測序引物焦磷酸法測定可變區(qū)序列IdentiFireSoftware：與數(shù)據(jù)庫比對，確定分型結(jié)果WorkflowDNA制備樣品收集/培養(yǎng)鑒定與分型結(jié)果PCR擴增單鏈模板制備Pyrosequencing數(shù)據(jù)庫搜索/結(jié)果比對15min40min

1min/sample10min30min–2hrsAntibioticresistance

抗藥性研究AntibioticresistanceinMycobacteriaRifampicin（利福平）——mutationsintherpoBgeneIsoniazide（異煙肼）——mutationsinthekatGgeneFluoroquinolones（對苯二酚）——gyrALinezolide(利奈唑胺

)resistancemutationsin23SEthambutol

（乙胺丁醇）——embBPyroMarkTMIDCompletesolutionforClinicalMicrobiologyPyrosequencing

系統(tǒng)平臺AssayDesignSW

SamplePrep

PyrosequencingFeaturingPyroGoldchemistryIdentiFireTMSWPyrosequencing技術(shù)的流程PCR試樣預(yù)處理，獲得單鏈模板Pyrosequencing序列分析15min/96samperSQA:35min/96samperSNP:10min/96samper1-2h/96samper結(jié)果分析C/T

T/T實驗設(shè)計PyrosequencingisworldwidelyusedGenomicsCollaborativeNIHUCDavisHarvardCenterforCancerPreventionYaleUniversityHowardUniversityHospitalforSickChildrenMaxPlanckInstituteBaylorCollegeofMedicineRIKENKarolinskaInstituteNCIGermanArmedForcesNASA

AstraZeneca

GlaxoSmithKlineMerckSchering-PloughAbbottJanssenPharmaceutica,NVBayerAG

Biogen

CuraGenCorporationDuPontAgriculture

LynxTherapeutics

Genzyme

第四軍醫(yī)大學(xué)全軍基因診斷中心中科院健康中心上海仁濟醫(yī)院，上海肺科醫(yī)院上海CDC，江蘇省CDC

南京第二人民醫(yī)院上海晶泰生物技術(shù)有限公司全球>600customers25accountswith2ormoresystemsPyrosequencingisworldwidelyusedThanksforYourAttention!PyroMarkPlatformInstrumentationReagentKitsVacuumprepworkstationIdentiFireSoftwareAssayDesignSoftwareSoftware實驗流程單鏈的分離純化Pyrosequ