堿性磷酸酶值測定

關(guān)于堿性磷酸酶值測定第一頁，共十八頁，2022年，8月28日實驗目的學習環(huán)境因素對酶促反應(yīng)速度的影響；學習米氏方程及Km值得測定；測量堿性磷酸酶km值；實驗原理

E的反應(yīng)速度受到環(huán)境因素的影響，這些因素包括底物濃度、E濃度、PH、溫度、激活劑、抑止劑等第二頁，共十八頁，2022年，8月28日（一）米－曼氏方程式中間產(chǎn)物

酶促反應(yīng)模式——中間產(chǎn)物學說E+Sk1k2k3ESE+P相關(guān)E學原理第三頁，共十八頁，2022年，8月28日※1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學方程式，即米－曼氏方程式，簡稱米氏方程式(Michaelisequation)。[S]：底物濃度V：不同[S]時的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常數(shù)(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]

Km+[S]

＝──第四頁，共十八頁，2022年，8月28日當反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時Km值的推導Km＝[S]∴Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2第五頁，共十八頁，2022年，8月28日（二）Km與Vmax的意義

Km值①Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度。②意義：a)

Km是酶的特征性常數(shù)之一；b)

Km可近似表示酶對底物的親和力；c)

同一酶對于不同底物有不同的Km值。

第六頁，共十八頁，2022年，8月28日

Vmax定義：Vm是酶完全被底物飽和時的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。第七頁，共十八頁，2022年，8月28日（三）Ｋm值與Ｖmax值的測定1.雙倒數(shù)作圖法(doublereciprocalplot)，又稱為林-貝氏(Lineweaver-Burk)作圖法-1/Km1/Vmax1/[S]1/VVmax[S]Km+[S]V=（林－貝氏方程）+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]兩邊同取倒數(shù)第八頁，共十八頁，2022年，8月28日2.Hanes作圖法[S][S]/V-KmKm/Vm在林－貝氏方程基礎(chǔ)上，兩邊同乘[S][S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax第九頁，共十八頁，2022年，8月28日酶濃度對反應(yīng)速度的影響當[S]＞＞[E]，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比。關(guān)系式為：V=K3[E]0V

[E]

當[S]>>[E]時，Vmax=k3[E]

酶濃度對反應(yīng)速度的影響

第十頁，共十八頁，2022年，8月28日雙重影響溫度升高，酶促反應(yīng)速度升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速度降低。溫度對反應(yīng)速度的影響最適溫度(optimumtemperature)：酶促反應(yīng)速度最快時的環(huán)境溫度。*低溫的應(yīng)用酶活性0.51.02.01.50102030405060

溫度oC

溫度對淀粉酶活性的影響

第十一頁，共十八頁，2022年，8月28日pH對反應(yīng)速度的影響最適pH(optimumpH)：酶催化活性最大時的環(huán)境pH。0酶活性pH

pH對某些酶活性的影響

胃蛋白酶淀粉酶膽堿酯酶246810第十二頁，共十八頁，2022年，8月28日堿性磷酸酶km值的測定第十三頁，共十八頁，2022年，8月28日操作試劑（ml）1234562.5mM磷酸苯二鈉0.20.40.60.81.01.0蒸餾水0.80.60.40.2－－堿性緩沖液1.01.01.01.01.01.0混勻后，37℃水浴5min堿性磷酸酶0.10.10.10.10.1－混勻后，37℃水浴15min(準確計時）酚試劑1.01.01.01.01.01.0堿性磷酸酶－－－－－0.110%碳酸鈉3.03.03.03.03.03.0混勻后，37℃水浴15min,以第6管調(diào)0與650nm比色，讀取各管A值。第十四頁，共十八頁，2022年，8月28日實驗數(shù)據(jù)及結(jié)果管號A6501/A650[s]1/[s]123456以上述數(shù)據(jù)雙倒數(shù)作圖，求出堿性磷酸酶的Km值。第十五頁，共十八頁，2022年，8月28日實驗討論Km值的定義和意義是什么？米氏方程度表達式是什么，如何求出Vmax和Km？第十六頁，共十八頁，2022年，8月28日現(xiàn)有某待測樣品液5ml，將其稀釋到100ml，取其稀釋液1ml加入測定管按酚試劑法測其蛋白質(zhì)含量，另取已知濃度的牛血清白蛋白溶液（250微克/ml）1ml加入標