實(shí)驗(yàn)七-微生物板直接計(jì)數(shù)法和測微技術(shù)

1．明確顯微鏡計(jì)數(shù)的原理并學(xué)習(xí)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。2．學(xué)習(xí)并掌握用測微尺測定微生物大小的方法，增強(qiáng)對微生物細(xì)胞大小的感性認(rèn)識(shí)。

一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)七微生物直接計(jì)數(shù)法

和測微技術(shù)

二、基本原理

1．血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)原理

血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)，中間較寬的又被一短的橫槽隔成兩半，每邊平臺(tái)上刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。每個(gè)大方格邊長為1mm，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3（1×10-4ml）。每個(gè)大方格由25個(gè)中方格或16個(gè)中方格組成。計(jì)數(shù)時(shí)通常統(tǒng)計(jì)5個(gè)（或4個(gè)）中方格的細(xì)菌數(shù)，再換算成1ml樣品中的細(xì)菌數(shù)。1ml樣品中的總菌數(shù)=［A/5(4)］×25(16)×104×BA：5個(gè)（或4個(gè)）中方格中的總菌數(shù)B：菌液稀釋倍數(shù)（本實(shí)驗(yàn)為100倍）2．測微尺的使用原理

目鏡測微尺是一塊可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，分50和100兩種，通過鏡臺(tái)測微尺校正后，可用于測量細(xì)菌的大小。測微尺包括目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺。鏡臺(tái)測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般是將1mm分為100格，每格0.01mm（即10μm），用于校正目鏡測微尺每格的相對長度。目鏡測微尺每格長度(μm)=（鏡臺(tái)測微尺格數(shù)×10μm

）/目鏡測微尺格數(shù)，如：(10×10μm

/60)三、實(shí)驗(yàn)材料1．菌種

啤酒酵母、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。2．儀器或其它用具

血球計(jì)數(shù)板、顯微鏡、蓋玻片、載玻片、目鏡測微尺、鏡臺(tái)測微尺、無菌毛細(xì)滴管等。1.啤酒酵母菌顯微計(jì)數(shù)①取清潔無油的血球計(jì)數(shù)板，在計(jì)數(shù)室上面加蓋血蓋片。（血球計(jì)數(shù)板不可刷洗也不可擦水）。②取酵母菌液，搖勻。用滴管在蓋玻片邊緣滴一小滴，使菌液自行滲入，計(jì)數(shù)室內(nèi)不得有氣泡。③用10×鏡觀察并將計(jì)數(shù)室移至視野中央。④在10×或40×鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)（或4個(gè)）中格的菌數(shù)。⑤然后求得5個(gè)（或4個(gè)）中格的總菌數(shù)，再按公式計(jì)算求得每ml菌液中的含菌數(shù)。

注意事項(xiàng)：計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右。出芽計(jì)半。四、操作步驟①目鏡測微尺的校正校正并計(jì)算10×、40×、100×鏡目鏡測微尺每小格的實(shí)際長度。②酵母菌體大小的測定用于計(jì)數(shù)的啤酒酵母菌的制片（可用計(jì)數(shù)的血球計(jì)數(shù)板）置于載物臺(tái)上，在40×鏡下用目鏡測微尺測量并計(jì)算菌體的長和寬。③金黃色葡萄球菌和枯草桿菌大小的測定將金黃色葡萄球菌和枯草桿菌分別進(jìn)行簡單染色后，選取5個(gè)菌體在100×鏡下分別測定單個(gè)細(xì)胞直徑和長度、寬度，分別計(jì)算其平均大小。2.微生物大小的測定五、預(yù)期結(jié)果1.目鏡測微尺標(biāo)定結(jié)果10×鏡下目鏡測微尺每格長度是

10

μm。40×鏡下目鏡測微尺每格長度是

2.5μm。100×鏡下目鏡測微尺每格長度是

1

μm。注意：保留小數(shù)點(diǎn)后二位。2.微生物大小測定結(jié)果序號(hào)酵母菌金黃色葡萄球菌枯草桿菌目鏡尺格數(shù)實(shí)際大小目鏡尺格數(shù)實(shí)際直徑/μm目鏡尺格數(shù)實(shí)際大小短軸長軸短軸/μm

長軸/μm寬長寬/μm長/μm12345均值4~67~100.8-11-.1.52~4計(jì)數(shù)室5個(gè)中格的菌數(shù)A二室平均值?每毫升酵母菌液的總菌數(shù)（個(gè)/mL)第一室第二室3.顯微計(jì)數(shù)結(jié)果

記錄于下表中。A表示五個(gè)中方格中的總菌數(shù)。

每毫升酵母菌液中的總菌數(shù)（個(gè)）=(?/5)×25×104×100下次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容微生物的接種技術(shù)及分離純化問題與討論

1、為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)測微尺重新對目鏡測微尺進(jìn)行效正？P48,(1)

2、某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請?jiān)O(shè)計(jì)1-2中可行的檢測方法。P92,(2)上次試驗(yàn)習(xí)題解答1、你主要根據(jù)哪些形態(tài)特征來區(qū)分上述四種霉菌？P46,（1）

四種霉菌的異同如下：曲霉，外生孢子（分生孢子），有足細(xì)胞，菌絲有隔；青霉：外生孢子（分生孢子），為掃帚狀，菌絲有隔，相對較細(xì)；根霉：內(nèi)生孢子（孢囊孢子），菌絲無隔，有匍匐枝和假根；毛霉：內(nèi)生孢子（孢囊孢子），菌絲無隔。2、你認(rèn)為在顯微鏡下，細(xì)菌，放線菌，酵母菌和霉菌的主要區(qū)別是什么？P46,（2）

細(xì)菌較小，一般球狀、桿狀