《發(fā)酵工程》第6章發(fā)酵動力學(xué)

第六章發(fā)酵動力學(xué)

教學(xué)內(nèi)容：學(xué)時：1.微生物生長代謝過程中的質(zhì)量平衡3.微生物生長代謝過程中數(shù)學(xué)模型的建立2.微生物發(fā)酵的動力學(xué)6

發(fā)酵動力學(xué)是研究發(fā)酵過程中菌體生長、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物生成的動態(tài)平衡及其內(nèi)在規(guī)律的學(xué)科。

研究內(nèi)容:

微生物生長過程中的質(zhì)量和能量平衡，發(fā)酵過程中菌體生長速率、基質(zhì)消耗速率和產(chǎn)物生成速率的相互關(guān)系，環(huán)境因素對三者的影響以及影響反應(yīng)速度的條件。

為什么要學(xué)習(xí)發(fā)酵動力學(xué)？（1）優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝條件。（2）優(yōu)選發(fā)酵過程中的各種工藝參數(shù)（菌體濃度、溫、pH、溶氧、基質(zhì)濃度、CO2等）。（3）以發(fā)酵動力學(xué)模型為依據(jù)，設(shè)計合理的發(fā)酵過程，使生產(chǎn)控制最佳化。（4）為小試數(shù)據(jù)放大及分批發(fā)酵過渡到連續(xù)發(fā)酵提供理論依據(jù)。第一節(jié)微生物生長代謝中的質(zhì)量平衡二.微生物生長代謝過程中的碳平衡三.微生物代謝過程中的ATP循環(huán)與氧平衡一.發(fā)酵動力學(xué)中的得率因數(shù)一.發(fā)酵動力學(xué)中的得率因數(shù)

得率是任何反應(yīng)過程進(jìn)行物料衡算的一項重要參數(shù)。為了對微生物發(fā)酵過程進(jìn)行物料衡算，進(jìn)而實施過程優(yōu)化和成本經(jīng)濟(jì)學(xué)研究，必須建立發(fā)酵得率這樣一項參數(shù)。在化學(xué)反應(yīng)工程中，轉(zhuǎn)化率和選擇性是兩個重要的指標(biāo)。而在微生物反應(yīng)中，則更重視以微生物質(zhì)量為基準(zhǔn)的得率或收率。得率因素維持因數(shù)生長得率產(chǎn)物得率過程得率理論得率發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)通過微生物的作用后的流向：（2）部分用于合成代謝產(chǎn)物；（3）部分以化學(xué)能的形式提供微生物生命活動所必需的能量。（1）部分轉(zhuǎn)化成細(xì)胞物質(zhì)；合成代謝分解代謝微生物由于種屬、遺傳特性和個體的差異，能量代謝效率很不相同：效率高的分解代謝比例低，消耗同樣多的營養(yǎng)物質(zhì)所獲得的細(xì)胞量或產(chǎn)物量較多；效率低的分解代謝比例高，產(chǎn)生同樣多的細(xì)胞或產(chǎn)物所需的營養(yǎng)物質(zhì)較多。得率因數(shù)便是衡量這種能量代謝效率高低的重要參數(shù)。1.維持因數(shù)

維持:

活細(xì)胞群體在沒有實質(zhì)性生長和繁殖（或生長和死亡處于動態(tài)平衡狀態(tài)），也沒有胞外產(chǎn)物生成情況下的生命活動。

如細(xì)胞運動，營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，細(xì)胞物質(zhì)的更新等

僅僅為了維持細(xì)胞生存的需要。

維持因數(shù)是指單位重量的細(xì)胞（干重）在單位時間內(nèi)進(jìn)行維持代謝所消耗的基質(zhì)量（或釋放的能量），用m表示。維持因數(shù)的大小代表細(xì)胞能量代謝效率的高低：維持因數(shù)越大，表示能量效率越低；維持因數(shù)越小，則能量效率越高。對于特定的微生物菌株，在一定的培養(yǎng)條件和營養(yǎng)基質(zhì)下，維持因數(shù)是一個常數(shù)，它不因基質(zhì)濃度、細(xì)胞濃度、細(xì)胞生長速率和產(chǎn)物合成速率的不同而變化，基質(zhì)維持因數(shù)mS：以基質(zhì)消耗為基準(zhǔn)氧維持因數(shù)mO：以耗氧為基準(zhǔn)能量維持因數(shù)mkcal：以分解代謝熱表示

ATP維持因數(shù)mATP：以ATP消耗表示。……

微生物工程上最常用的是前兩種：

維持因數(shù)多種表示法：2.生長得率

生長得率表示在發(fā)酵中微生物的生長相對于基質(zhì)或能量消耗的效率。

生長得率有許多不同的表示方法。下表列出了各種表示方法的符號、定義和因次。在工程上最常用的表示方法是以基質(zhì)消耗為基準(zhǔn)的生長得率YX/S和以氧消耗為基準(zhǔn)的生長得率YX／O不同的微生物、不同的培養(yǎng)基（合成培養(yǎng)基或復(fù)合培養(yǎng)基）、相對不同的基質(zhì)、采用不同的培養(yǎng)條件（好氧或厭氧），在不同的生長速率下，所獲得的生長得率都是不同的。即使同一種微生物，在同一培養(yǎng)基和同一培養(yǎng)條件下，不同的培養(yǎng)階段生長得率也不相同。S=(S)G+

(S)m由維持的概念可知，微生物生長（假定無非細(xì)胞產(chǎn)物生成）所消耗的基質(zhì)，包括維持和純生長兩個方面，即：

對生長得率的研究，一般應(yīng)當(dāng)在發(fā)酵的生長期，即還沒有非細(xì)胞產(chǎn)物生成的階段進(jìn)行。生長的菌體量對消耗于純生長的基質(zhì)量的比值即為純生長得率，寫為：

對于特定的菌株和特定的基質(zhì)，純生長得率是一常數(shù)，故又稱為生長得率常數(shù)。為區(qū)別于純生長得率，可以把生長得率稱為毛生長得率。和各種培養(yǎng)條件下的毛生長得率相比，純生長得率為生長得率中的最大值，故也稱為最大生長得率。這是一種理論生長得率，是生長得率的極限值。YGO：相對于氧消耗的純生長得率（g菌體·g-1，或者mol-1/O2）QGO：即QO2微生物生長（無非細(xì)胞產(chǎn)物生成）時的比耗氧率（g或molO2·g-1菌體·h-l）:氧的消耗比速(見P134式8-10)3.產(chǎn)物得率

產(chǎn)物得率分為過程得率和理論得率兩種。YP/S：相對于基質(zhì)總消耗的產(chǎn)物得率，即過程得率(g產(chǎn)物·g-1基質(zhì))或(mol產(chǎn)物·mol-1基質(zhì))-S：基質(zhì)總消耗量(g)或(mol)

P：產(chǎn)物生成量(g)或(mol)（1）過程得率

又稱毛產(chǎn)物得率或基質(zhì)（原料）轉(zhuǎn)化率。一般以發(fā)酵過程的產(chǎn)物生成量對基質(zhì)總消耗量的比值表示。

過程得率是考核一個生產(chǎn)菌株或一種工藝過程生產(chǎn)效率的重要參數(shù)。如美國Panlabs公司青霉素生產(chǎn)，在1972~1977年的5年間通過改良菌種，在發(fā)酵單位和過程得率（葡萄糖當(dāng)量至青霉素的轉(zhuǎn)化率）得到提高：當(dāng)時的最高過程得率是0.129青霉素G鉀／g葡萄糖當(dāng)量，近年已超過0.159青霉素G鉀／g葡萄糖當(dāng)量。

在以所消耗的葡萄糖為基準(zhǔn)計算過程得率時，應(yīng)當(dāng)把其它基質(zhì)(碳-能源)折合成葡萄糖當(dāng)量。各種碳-能源的葡萄糖當(dāng)量如下：（2）理論得率

又稱純產(chǎn)物得率或理論轉(zhuǎn)化率。由產(chǎn)物生物合成的理論推斷得到，是一種理論值。一般有兩種表示方法：相對于基質(zhì)消耗的理論得率和相對于氧消耗的理論得率，基質(zhì)和氧的消耗，不包括微生物的生長與維持，僅限于產(chǎn)物合成的消耗。

毛產(chǎn)物得率表示產(chǎn)物的生物合成效率。用于維持和生長的消耗越低，毛產(chǎn)物得率即產(chǎn)物的生物合成效率就越高。純產(chǎn)物得率是理論產(chǎn)物得率或最大產(chǎn)物得率，由產(chǎn)物的生物合成途經(jīng)所決定。對特定的微生物、特定的基質(zhì)和特定的產(chǎn)物來說，它是一個常數(shù)。二.微生物生長代謝過程中的碳平衡

碳源對于微生物生長是十分重要的，在培養(yǎng)基內(nèi)，碳源通常作為能源。根據(jù)培養(yǎng)基組成的不同，碳源有不同的用途。當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)缺少構(gòu)成細(xì)胞材料時，碳源也能作為構(gòu)成細(xì)胞的材料。1.基礎(chǔ)培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基是指由單一碳源葡萄糖和無機(jī)鹽所組成的培養(yǎng)基。

完全培養(yǎng)基是指不僅含有碳源和無機(jī)鹽，而且還含有構(gòu)成菌體所需材料的培養(yǎng)基。如酵母浸膏、牛肉浸膏等，一般天然培養(yǎng)基均系完全培養(yǎng)基。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，葡萄糖既可提供微生物生長所需的能源，又可作為構(gòu)成菌體的材料?；A(chǔ)培養(yǎng)基碳源利用完全培養(yǎng)基碳源利用2.微生物生長代謝過程中基質(zhì)與產(chǎn)物間的碳元素平衡微生物的元素成分是相對穩(wěn)定的。根據(jù)基質(zhì)（S）、菌體（X）、產(chǎn)物（P）和二氧化碳元素的數(shù)量可以寫出微生物生長代謝過程碳元素的平衡關(guān)系：υ——基質(zhì)的消耗速度，μ——微生物的生長比速，QCO2—CO2的生成比速，QP——代謝產(chǎn)物的生成比速，α1——每1mol基質(zhì)中碳的含量，α2——每1g干菌體內(nèi)碳的含量，α3——每1molCO2中碳的含量，α4——每1mol產(chǎn)物中碳的含量。υα1=μα2+QCO2α3+QPα4+…3.微生物生長過程中主要基質(zhì)——碳源平衡以糖為碳源的微生物生長代謝，碳源主要消耗在:S=(S)G+

(S)m+

(S)P+…

（1）滿足菌體生長的需要，可用(S)G表示；（2）維持菌體生存的消耗（如微生物的運動，物質(zhì)的傳遞，基中包括營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排泄），用(S)m表示；（3）代謝產(chǎn)物積累的消耗，用(S)P表示。則有:在以生產(chǎn)細(xì)胞物質(zhì)為目的的發(fā)酵過程中（如面包酵母生產(chǎn)和SCP），代謝產(chǎn)物的積累可以忽略不計,上式可簡化為：設(shè)：YG:表示用于菌體生長的碳源對菌體的得率常數(shù)，m:表示微生物的碳源維持常數(shù)，Ym:表示碳源對代謝產(chǎn)物的得率常數(shù)。則：設(shè)YX/S為發(fā)酵過程中基質(zhì)消耗的同時所生成菌體量之間的比例，則可推導(dǎo)出：4.細(xì)胞物質(zhì)生產(chǎn)過程中碳源的化學(xué)平衡對單純的細(xì)胞生產(chǎn)（面包酵母、SCP），如用葡萄糖為碳源通風(fēng)培養(yǎng)面包酵母時，可建立下列化學(xué)平衡：如果計入酵母菌體內(nèi)除碳、氫、氧三元素以外的其他元素如磷、氮以及其他灰分，則每200g葡萄糖約可得到100g干酵母，相對于葡萄糖消耗的酵母得率為Yx/s=0.5。實際上不同情況下Yx/s有很大的不同。當(dāng)限制性基質(zhì)濃度較高時，微生物的生長比速較大，這時基質(zhì)的維持消耗相對要小得多。當(dāng)用碳?xì)浠衔餅樘荚?，生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白時，同樣可以寫出相應(yīng)的化學(xué)平衡式：在酵母實際的生產(chǎn)中，為充分發(fā)揮設(shè)備生產(chǎn)潛力，在較高碳源濃度下培養(yǎng)酵母，因此Yx/s≈YG（=0.5）（g菌體／g葡萄糖）。這個結(jié)論與實際生產(chǎn)試驗的結(jié)果是一致的。同樣，在菌體內(nèi)再計入碳、氫、氧以外的其他元素如氮、磷以及其他灰分，將得到Y(jié)x/s≈1［g菌體／g基質(zhì)]。

污水的生物處理理論上也屬于微生物的培養(yǎng)，當(dāng)用乳糖（C12H22O11）與酪素（C8H12N2O3）在通風(fēng)條件下培養(yǎng)活性污泥時，可建立化學(xué)平衡關(guān)系：則：Yx/s=226/（240+184）=0.53（g污泥/g基質(zhì)）所以，污泥生成量為污水中有機(jī)物含量的50％左右。

污水處理的目的不是為獲得某種產(chǎn)品，而是消耗污水中的有機(jī)物以凈化水質(zhì)。為了減少污泥的產(chǎn)量，當(dāng)有機(jī)物被消耗后繼續(xù)通風(fēng)，使菌體利用自身物質(zhì)進(jìn)行內(nèi)源呼吸，導(dǎo)致菌體自溶，最終水中的有機(jī)物全部分解為CO2和NH3放出。5.微生物生長代謝過程中碳平衡的意義（l）了解碳源在生長和代謝過程中的動向，通過實驗和理論計算得到碳源對產(chǎn)物的最大得率，為不斷提高生產(chǎn)水平提供可靠依據(jù)。（2）對于一般的發(fā)酵過程，可以用菌體生長速率(μ)、產(chǎn)物累積速率(Qp)和基質(zhì)消耗速率(υ)三個數(shù)學(xué)模型來加以描述。而8-6方程式就是其中之一。（3）對于以生產(chǎn)菌體為目的的微生物培養(yǎng)過程，由于代謝產(chǎn)物可忽略不計，而二氧化碳的生成速率可通過發(fā)酵廢氣分析得到，再根據(jù)基質(zhì)（碳源）的消耗速率，通過碳平衡，就可以計算出微生物細(xì)胞的生成速率。三.微生物代謝過程中的ATP循環(huán)與氧平衡1.ATP循環(huán)合成代謝ADP繁殖維持代謝ATP分解代謝2.生物氧化基質(zhì)產(chǎn)能主要靠生物氧化，生物氧化是微生物生長代謝的關(guān)鍵。在生物氧化過程中氧是最終的電子受體。

EMP→TCA→電子傳遞鏈

每1mol葡萄糖經(jīng)生物氧化釋放的自由能，能生成38mol的ATP。

還原型物質(zhì)所脫下的氫依次傳遞，最終與氧結(jié)合成水。

在厭氣條件下，厭氧微生物進(jìn)行的是基質(zhì)水平磷酸化。以同型乳酸發(fā)酵為例：所以，厭氣發(fā)酵時，基質(zhì)水平磷酸化所產(chǎn)生的ATP要比當(dāng)發(fā)酵過程充分供氧時氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP少的多.3.微生物生長代謝過程中的氧平衡有機(jī)物完全氧化最終會被分解成二氧化碳和水。根據(jù)單一碳源培養(yǎng)基內(nèi)微生物生長代謝的基質(zhì)和產(chǎn)物完全氧化的需氧量，可建立下列平衡式：A:基質(zhì)S完全氧化的需氧量；B:菌體X完全氧化的需氧量；C:代謝產(chǎn)物P完全氧化的需氧量；上式中

O2是指微生物生長代謝過程的耗氧量。包括兩部分：（1）維持生命活動的耗氧：若以X為菌體的濃度，mO為氧的維持常數(shù)，由在t時間內(nèi)維持耗氧量應(yīng)為：mOXt；（2）菌體生長的耗氧：若用YGO表示相對于氧消耗的菌體生長得率常數(shù)，則生長X菌體相應(yīng)的耗氧量為X／YGO。若過程沒有代謝產(chǎn)物，則有：υ、μ：分別表示基質(zhì)消耗比速和菌體生長比速；QO2：表示氧的消耗比速。即：將該式與碳源平衡式比較可得到碳源維持常數(shù)m與氧的維持常數(shù)mO的關(guān)系是：m=mO/A；可推導(dǎo)出：碳源對菌體的得率常數(shù)YG與氧對菌體的得率常數(shù)YGO的關(guān)系為：4.ATP消耗對菌體得率YATP與ATP平衡在微生物生長過程中，需要ATP，同時必須有合成細(xì)胞的材料。可能兩種情況：（1）當(dāng)合成細(xì)胞的材料大量存在，ATP為限制因素：——生物合成取決于ATP的數(shù)量——能量偶聯(lián)型生長過程。若用YATP表示每消耗1molATP所生成菌體的質(zhì)量（g），則稱為ATP消耗對菌體的得率。對于能量偶聯(lián)型生長YATP約等于10[g菌體／molATP]。（2）ATP過量，合成細(xì)胞材料為限制因素，或存在其他阻遏物質(zhì)使生物合成不能順利進(jìn)行——ATP不能充分有效用于生物合成，被酶所分解以熱形式釋放——能量非偶聯(lián)型生長，

YATP將大大低于10[g菌體／molATP]，有時只有l(wèi)~2。此時，細(xì)胞的生長速度表現(xiàn)為與菌體內(nèi)ATP數(shù)量無關(guān)

從表6-2可見，當(dāng)培養(yǎng)基缺少合成細(xì)胞的材料（如氨基酸、維生素等）時，YATP較低，而當(dāng)加入生物合成的阻遏物（如EDTA或檸檬酸）時，盡管ATP生成量沒有太大變化，但YATP將大大降低。

從表6-3可見，生物合成所必須的泛酸成為限制因素，菌體生長的比速取決于泛酸的含量

微生物的非偶聯(lián)型生長，使ATP在細(xì)胞內(nèi)積累并最終被相應(yīng)的酶分解，釋放出能量，這種情況對細(xì)胞物質(zhì)生產(chǎn)不利，但對污水生物處理很有價值，減少污泥的產(chǎn)量。微生物生長代謝過程的ATP平衡可以用氧平衡和碳平衡相似的形式表示：(ATP)S=(ATP)m+

(ATP)G(ATP)S：基質(zhì)分解所生成的ATP數(shù)量；(ATP)m：微生物維持分解所消耗ATP的數(shù)量，設(shè)mA為ATP的維持常數(shù)，則菌體X在t時間內(nèi)ATP的維持消耗應(yīng)為mAXt；(ATP)G：菌體生長所消耗的ATP。

在通風(fēng)培養(yǎng)微生物時，耗氧量與基質(zhì)氧化生成的(ATP)S數(shù)量之間存在一定的關(guān)系。5.通風(fēng)培養(yǎng)時耗氧量與ATP生成量間的關(guān)系設(shè)氧消耗對ATP得率為YA/O=(ATP)S/O2(molATP／mol氧)，氧消耗與生成的ATP的關(guān)系也常用P／O(molATP／g原子氧)表示。從示意圖可見，一個氧原子接受兩個電子與兩個質(zhì)子結(jié)合生成lmol水的同時，形成3molATP，因此P／O=3，這在哺乳動物肝臟細(xì)胞中才能達(dá)到。酵母菌的P／O=1，而一般微生物P／O=0.5~l。這兩種得率之間的關(guān)系為：

P／O比值不僅在發(fā)酵動力學(xué)研究工作中有用，在微生物的生物化學(xué)研究方面也很有用。它是一個特征常數(shù)，目前還沒有直接測定的方法，但可以通過推導(dǎo)計算。若用表示微生物生長能量偶聯(lián)型ATP對菌體的最大得率常數(shù)，即：則：式中：QATP：基質(zhì)分解生成ATP的比速數(shù)量。第二節(jié)微生物發(fā)酵的動力學(xué)一.分批培養(yǎng)二.補(bǔ)料分批培養(yǎng)三.連續(xù)培養(yǎng)一.分批培養(yǎng)

分批培養(yǎng)：又稱分批發(fā)酵，是指在一個密閉系統(tǒng)內(nèi)一次性投入有限數(shù)量營養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)的方法。目前最常用的培養(yǎng)方法，廣泛用于各種發(fā)酵生產(chǎn)過程。在分批培養(yǎng)過程中，除氧氣、消泡劑及控制pH值的酸、堿外，不再加入任何其他物質(zhì)。伴隨著培養(yǎng)基成分的減少，微生物經(jīng)歷了從生長繁殖到衰亡過程。

一種非恒態(tài)的培養(yǎng)法。1.細(xì)菌的生長曲線在分批培養(yǎng)條件下，微生物的生長過程可分為四個不同的生長階段，即：遲滯期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期tlgN0遲滯期

當(dāng)微生物細(xì)胞由一個培養(yǎng)基轉(zhuǎn)到另一個培養(yǎng)基后，細(xì)胞有一個適應(yīng)新環(huán)境的過程，細(xì)胞數(shù)目基本不增加。接種物的生理狀態(tài)是遲滯期長短的關(guān)鍵。如果接種物處于對數(shù)期，遲滯期可能很短或不存在遲滯期。如果所用的接種物已經(jīng)停止生長，那么，就需要更長的時間，以適應(yīng)新環(huán)境。適當(dāng)提高接種物濃度，可縮短遲滯期。對數(shù)期

單位時間內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目或重量的增加維持恒定，并達(dá)到最大值。此時期的培養(yǎng)基成分雖然發(fā)生了改變，但細(xì)胞的生長速度維持恒定。當(dāng)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物過量時，生長速度與營養(yǎng)物濃度無關(guān)。如以細(xì)胞重量的增加表示生長速度，則：積分得：如以微生物細(xì)胞濃度的自然對數(shù)值對時間作圖則為一條直線，其斜率等于μ。如果t=td，即X2=2X1所需要的時間。

td即為代時，是細(xì)胞數(shù)量增加一倍所需的時間。

細(xì)菌的td為15~60min，酵母為45~120min，霉菌為2~8h。則：穩(wěn)定期

微生物大量生長→營養(yǎng)物的消耗和代謝產(chǎn)物的分泌→營養(yǎng)物消耗殆盡或有毒物質(zhì)形成→微生物的生長速度開始下降直至生長停止。當(dāng)所有細(xì)胞停止分裂，或細(xì)胞增加速度與死亡速度達(dá)到平衡，即進(jìn)入了穩(wěn)定期。穩(wěn)定期的細(xì)胞數(shù)量基本保持恒定，但活細(xì)胞數(shù)目可能下降。細(xì)胞自溶二次生長（隱性生長）：其產(chǎn)物主要是次級代謝產(chǎn)物。衰亡期

營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，細(xì)胞的能量貯備已經(jīng)耗完，有毒代謝廢物大量積累，細(xì)胞開始死亡。穩(wěn)定期和衰亡期之間時間的長短，取決于微生物的種類和所用的培養(yǎng)基。在工業(yè)生產(chǎn)上，通常在對數(shù)期的末期或衰亡期開始之前，結(jié)束發(fā)酵過程，收獲產(chǎn)物。2.微生物生長速度的動力學(xué)方程

1942年始，許多描述微生物生長過程中比生長速率和營養(yǎng)物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)模型。在大多數(shù)分批培養(yǎng)中，在特定溫度、PH值、營養(yǎng)物類型、營養(yǎng)物濃度條件下，比生長速率μ是個常數(shù)。1942年，Monod最先發(fā)現(xiàn)比生長速率與限制性營養(yǎng)物濃度關(guān)系符合以下方程：

Monod方程是一個經(jīng)驗公式，在純培養(yǎng)中，只有當(dāng)微生物細(xì)胞生長只受一種限制性營養(yǎng)物制約時，該方程才與實驗數(shù)據(jù)一致。

當(dāng)培養(yǎng)基存在抑制劑，或存在多種營養(yǎng)物時，Monod方程必須加以修改才能與實驗數(shù)據(jù)一致。當(dāng)存在多種限制性營養(yǎng)物時，方程可改寫為：

如果所有營養(yǎng)物過量（對數(shù)生長期），μ=μmax，生長速度達(dá)到最大值。3.營養(yǎng)物的利用和產(chǎn)物的形式

在分批培養(yǎng)中，常用得率因數(shù)來描述微生物生長過程的特征常用的生長得率因數(shù)有三類：（1）與實際生產(chǎn)過程的效率、成本有關(guān)：如YX/S，YX/O2，YX/kJ（2）與代謝過程有關(guān)：如YX/C，YX/P，YX/N，YX/Ave-（3）與能量代謝有關(guān)，如YX/ATP4.分批培養(yǎng)過程的生產(chǎn)率

在評價發(fā)酵過程的成本、效率時，應(yīng)利用生產(chǎn)率這個概念。發(fā)酵過程中的生產(chǎn)率可定義為:

生產(chǎn)率是一個綜合指標(biāo)，在計算時間時應(yīng)包括發(fā)酵時間、放罐、清洗、裝料和消毒時間以及遲滯期所經(jīng)過的時間。參見圖８-９。tc為放罐清洗時間tf為消毒時間tl為遲滯時間X0和Xf分別為最初和最終的細(xì)胞濃度發(fā)酵總時間為：

tL=tc+

tf+

tl則平均生產(chǎn)率P可表示為：如果：通過方程可以估算發(fā)酵過程中各種因素的變化對平均生產(chǎn)率的影響。接種量大，X0大，發(fā)酵過程縮短；減少tc和tf，也能縮短周期。對于短周期發(fā)酵（18~70h），如谷氨酸發(fā)酵，tc和tf非常重要；而對長周期發(fā)酵（3d以上），如抗生素生產(chǎn)，tc和tf就不太重要了。二.補(bǔ)料分批培養(yǎng)

補(bǔ)料分批培養(yǎng)又稱半連續(xù)培養(yǎng)或半連續(xù)發(fā)酵，是指在分批培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。

是分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的一種過渡培養(yǎng)方式。

補(bǔ)料在發(fā)酵過程中的應(yīng)用，是發(fā)酵技術(shù)上一個劃時代的進(jìn)步。補(bǔ)料技術(shù)本身也由少次多量、少量多次，逐步改為流加，近年又實現(xiàn)了流加補(bǔ)料的微機(jī)控制。

發(fā)酵過程中的補(bǔ)料量或補(bǔ)料率，目前在生產(chǎn)中還只是憑經(jīng)驗確定，或根據(jù)一、兩個一次檢測的靜態(tài)參數(shù)（如基質(zhì)殘留量、ｐＨ、溶解氧濃度等）設(shè)定控制點，帶有一定的盲目性，很難同步地滿足微生物生長和產(chǎn)物合成的需要，因而現(xiàn)在的研究重點在于如何實現(xiàn)補(bǔ)料的優(yōu)化控制。

1.補(bǔ)料分批培養(yǎng)的類型隨著補(bǔ)料分批培養(yǎng)研究和應(yīng)用的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了許多類型的補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法（參見圖８-1０）。２.補(bǔ)料分批培養(yǎng)的動力學(xué)單一補(bǔ)料分批培養(yǎng)

假定S0為開始培養(yǎng)時培養(yǎng)基中限制性營養(yǎng)物的濃度，則在某一瞬間培養(yǎng)液細(xì)胞濃度X可表示為：X0為剛接種時培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度（g/L）其中：YX/S為細(xì)胞生長的得率因數(shù)（g/g）

在開始時投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，到發(fā)酵過程的適當(dāng)時期，開始連續(xù)補(bǔ)加碳源或（和）氮源或（和）其他必需基質(zhì)，直到發(fā)酵液體積達(dá)到發(fā)酵罐最大操作容積后，停止補(bǔ)料，最后將發(fā)酵液一次全部放出。

當(dāng)S≈0時，細(xì)胞最終濃度為Xmax，假定Xmax>>X0，則：

如果在X=Xmax時開始以恒定速度補(bǔ)加培養(yǎng)基，這時，稀釋率D小于μmax。實際上當(dāng)?shù)孜镆贿M(jìn)入培養(yǎng)液，所有限制性營養(yǎng)物都很快被消耗。F為流加的培養(yǎng)基流速（L/h）X′為培養(yǎng)液中細(xì)胞總量（g），X′=XVV為時間t時培養(yǎng)液的體積其中：Xmax=YX/SS0

如流加入的營養(yǎng)物與細(xì)胞消耗掉的營養(yǎng)物相等，則dS/dt=0。盡管隨著時間的延長，培養(yǎng)液中總菌體量X’增加，但實際上細(xì)胞濃度X保持不變，即dX/dt=0，因而μ≈D。這種dS/dt=0，dX/dt=0，μ≈D的狀態(tài)，稱為“準(zhǔn)恒定狀態(tài)”。在準(zhǔn)恒定狀態(tài)下，同樣有：X’0為開始培養(yǎng)時的總菌體量。

在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的準(zhǔn)恒定狀態(tài)下，雖然存在μ=D，但與連續(xù)培養(yǎng)中恒定狀態(tài)下的μ=D不同。在連續(xù)培養(yǎng)中D是常數(shù)，而在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，隨著時間的延長，由于體積增加，稀釋率D和比生長速率μ以相同速度降低，D可由下式表示：V0為開始培養(yǎng)時的培養(yǎng)液體積。重復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)在培養(yǎng)過程中每間隔一定時間，取出一定體積的培養(yǎng)液，同時在同一時間間隔內(nèi)加入相等體積的培養(yǎng)基，如此反復(fù)使發(fā)酵液體積始終不超過發(fā)酵罐的最大操作容積，從而在理論上可以延長發(fā)酵周期，直至發(fā)酵產(chǎn)率明顯下降，才最終將發(fā)酵液全部放出。

3.補(bǔ)料分批培養(yǎng)的優(yōu)點和應(yīng)用兼具分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點，而且克服了兩者之缺點。與分批培養(yǎng)相比：（1）可解除底物的抑制、產(chǎn)物反饋抑制和葡萄糖分解阻遏效應(yīng)?！痉纸獯x物阻遏】指細(xì)胞內(nèi)同時有兩種分解底物存在時，利用快的那種底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶系合成的現(xiàn)象。Eg:將大腸桿菌培養(yǎng)在含乳糖和葡萄糖的培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)該菌可優(yōu)先利用葡萄糖，并于葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖。（葡萄糖效應(yīng)）

∴產(chǎn)生了兩個對數(shù)生長期中間隔開一個生長延滯期的“二次生長現(xiàn)象”葡萄糖效應(yīng)并不是由葡萄糖直接造成，而是葡萄糖某種分解代謝物引起。

分解代謝物阻遏涉及一種激活蛋白對轉(zhuǎn)錄作用的調(diào)控。分解代謝物阻遏中，只有當(dāng)一種稱為分解物激活蛋白(CAP)首先結(jié)合到啟動子上游后，RNA聚合酶才能與啟動基因結(jié)合。這種激活蛋白是一種變構(gòu)蛋白，當(dāng)它與cAMP結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生變化，這時才能與DNA結(jié)合并促進(jìn)RNA聚合酶的結(jié)合。無論在原核生物或高等生物中cAMP都是多種調(diào)控系統(tǒng)的重要因素。cAMP由腺苷酸環(huán)化酶催化ATP而產(chǎn)生，葡萄糖能抑制cAMP形成并促進(jìn)cAMP分泌到胞外。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后，胞內(nèi)的cAMP水平下降，RNA聚合酶不能與啟動子結(jié)合。因此，分解代謝物阻遏實際上是cAMP缺少的結(jié)果。（2）對好氧發(fā)酵，它可以避免在分批發(fā)酵中一次性投糖過多造成細(xì)胞大量生長，耗氧過多，以至通風(fēng)攪拌設(shè)備不能匹配的狀況。（3）可以減少菌體生成量，提高有用產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。（4）在真菌培養(yǎng)中，菌絲的減少可以降低發(fā)酵液的粘度，便于物料輸送及后處理

補(bǔ)料分批培養(yǎng)的優(yōu)點和應(yīng)用與連續(xù)培養(yǎng)相比：（1）不需要嚴(yán)格的無菌條件；（2）不會產(chǎn)生菌種老化和變異問題；（3）適用范圍也比連續(xù)培養(yǎng)廣?！锬壳?，運用補(bǔ)料分批發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行牛產(chǎn)和研究的范圍十分廣泛，包括單細(xì)胞蛋白、氨基酸、生長激素、抗生素、維生素、酶制劑、有機(jī)溶劑、有機(jī)酸、核苷酸、高聚物等，幾乎遍及整個發(fā)酵行業(yè)。它不僅被廣泛用于液體發(fā)酵中，在固體發(fā)酵及混合培養(yǎng)中也有應(yīng)用。

三.連續(xù)培養(yǎng)

以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同的速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定，使培養(yǎng)物在穩(wěn)定狀態(tài)下生長的培養(yǎng)方法。分批發(fā)酵是密閉系統(tǒng)，連續(xù)培養(yǎng)是開放系統(tǒng)。穩(wěn)定狀態(tài)可以有效地延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)期。在穩(wěn)定的狀態(tài)下，微生物所處的環(huán)境條件，如營養(yǎng)物濃度、產(chǎn)物濃度、ｐＨ值等都能保持恒定，微生物細(xì)胞的濃度及其比生長速率也可維持不變，甚至還可以根據(jù)需要來調(diào)節(jié)生長速度。

◆連續(xù)發(fā)酵使用的反應(yīng)器可以是攪拌罐式反應(yīng)器，也可以是管式反應(yīng)器（如活塞流式反應(yīng)器）?！粼诠奘椒磻?yīng)器中，即使加人的物料中不含有菌體，只要反應(yīng)器內(nèi)含有一定量的菌體，在一定進(jìn)料流量范圍內(nèi)，就可實現(xiàn)穩(wěn)態(tài)操作?！艄奘竭B續(xù)發(fā)酵的設(shè)備與分批發(fā)酵設(shè)備無根本差別，一般可采用原有發(fā)酵罐改裝。◆根據(jù)所用罐數(shù)，罐式連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)又可分單罐連續(xù)發(fā)酵和多罐連續(xù)發(fā)酵

帶攪拌管式反應(yīng)器入口;1.連續(xù)培養(yǎng)的設(shè)備類型設(shè)

備

類

型均勻混合的生物反應(yīng)器活塞流反應(yīng)器恒化器恒濁器使培養(yǎng)液中限制性營

養(yǎng)物濃度保持恒定使培養(yǎng)液中

細(xì)胞保持恒定（攪拌罐式反應(yīng)器）（管式反應(yīng)器）◆恒濁器（turbidostat）：即利用濁度來檢測細(xì)胞的濃度，通過自控儀表調(diào)節(jié)輸入料液的流量，以控制培養(yǎng)液中的菌體濃度達(dá)到恒定值；◆恒化器（chemostat）：與前者的相似之處是維持一定的體積，不同之處是菌體濃度不是直接控制的，而是通過恒定流速輸入的養(yǎng)料中某一種生長限制基質(zhì)的濃度（如碳、氮源；生長因子；無機(jī)鹽等）來控制菌體濃度的生長速度。1、恒濁培養(yǎng)原理：維持菌濃度不變。菌液濃度大小通過光電系統(tǒng)調(diào)節(jié)稀釋率來維持菌數(shù)恒定特點：基質(zhì)過量，菌以最高速率生長；但工藝復(fù)雜，煩瑣。

2、恒化培養(yǎng)原理：恒化器中動態(tài)平衡的穩(wěn)定性，是以某種生長限制因子（如碳、氮源；生長因子；無機(jī)鹽等）的濃度來控制菌的生長速度。特點：維持營養(yǎng)成分的低濃度，控制微生物生長速率。恒化結(jié)構(gòu)示意圖

1．培養(yǎng)液瓶，上裝過濾器（a）和培養(yǎng)基進(jìn)口（b）；2.蠕動泵3.恒化器，上有培養(yǎng)液進(jìn)口(c)、攪拌器(d)空氣過濾器(e)和進(jìn)樣器(f)，4.收集瓶，上有過濾器(g)恒化器◆在管式反應(yīng)器中，培養(yǎng)液通過一個返混程度較低的管狀反應(yīng)器向前流動（返混——反應(yīng)器內(nèi)停留時間不同的料液之間的混合），其理想型式為活塞流反應(yīng)器（ＰＦＲ，沒有返混）。在反應(yīng)器內(nèi)沿流動方向的不同部位，營養(yǎng)物濃度、細(xì)胞濃度、氧和生產(chǎn)率等都不相同。在反應(yīng)器的入口，微生物細(xì)胞必須和營養(yǎng)液一起加到反應(yīng)器內(nèi)。通常在反應(yīng)器的出口，裝一支路使細(xì)胞返回，或者來自另一個連續(xù)培養(yǎng)罐?！镞@種微生物反應(yīng)器的運轉(zhuǎn)存在許多困難，故目前主要用于理論研究，基本上還未進(jìn)行實際應(yīng)用。帶攪拌管式反應(yīng)器入口;2.單級恒化器連續(xù)培養(yǎng)的動力學(xué)（1）細(xì)胞的物料平衡

為描述恒定狀態(tài)下恒化器的特性，必須求出細(xì)胞和限制性營養(yǎng)物濃度與培養(yǎng)基流速之間關(guān)系的方程。在發(fā)酵罐中，細(xì)胞的物料平衡可表示為：X0和X——分別為流入和流出發(fā)酵罐的細(xì)胞濃度（g／L）F——培養(yǎng)基流速（L／h）V——發(fā)酵罐內(nèi)液體體積（L）μ和a——分別為比生長速率和比死亡速率（h-1）t——時間（h）對于單級恒化器，X0=0，在多數(shù)情況下，方程簡化：定義：在恒化狀態(tài)下：則：即在恒定狀態(tài)時，比生長速率等于稀釋率：μ=D（2）限制性營養(yǎng)物的物料平衡流入的營養(yǎng)物流出的營養(yǎng)物生長消耗的營養(yǎng)物維持生命需要的營養(yǎng)物形成產(chǎn)物消耗的營養(yǎng)物積累的營養(yǎng)物=式中：S0、S分別為流入和流出發(fā)酵罐的營養(yǎng)物的濃度YX/S為細(xì)胞生長的得率系數(shù)qp為產(chǎn)物形成的比速率[g產(chǎn)物/（g細(xì)胞·h）]YP/S為由營養(yǎng)物生成的產(chǎn)物得率系數(shù)在發(fā)酵罐中，營養(yǎng)物的物料平衡可表示如下：在一般條件下，，而形成的產(chǎn)物很少，可忽

略不計。在恒定狀態(tài)下，，則：因為μ=D，故：流出的細(xì)胞濃度=生長得率（流入營養(yǎng)物濃度-流出營養(yǎng)物濃度）（3）細(xì)胞濃度與稀釋率的關(guān)系細(xì)胞濃度、營養(yǎng)物濃度與稀釋率的關(guān)系可用Monod方程來表示。在連續(xù)培養(yǎng)時，Monod方程變?yōu)椋撼龢O少數(shù)例外，Dc相當(dāng)于分批培養(yǎng)中的μmax，由上式得到：式中：Dc為臨界稀釋率，即在恒化器中可能達(dá)到的最大的稀釋率這兩個方程分別表示了S和X對培養(yǎng)基流速（也就是D）的依賴關(guān)系。當(dāng)流速低時，即D小時，營養(yǎng)物全部被細(xì)胞利用，S0，細(xì)胞濃度X=S0YX／S。如果D增加，開始X呈線性慢慢下降，然后，當(dāng)D=D0=μmax

時，X下降到0。開始時，S隨D的增加而緩慢增加，當(dāng)D=μmax時，SS0。當(dāng)X=0時，達(dá)到了“清洗點”，則：當(dāng)D在μmax以上，不可能達(dá)到恒定狀態(tài)。如果D只略低于μmax，那么，整個系統(tǒng)對外界環(huán)境的變化非常敏感。隨D的微小變化，X將發(fā)生巨大的變化。下圖顯示了稀釋率對S、X、td（倍增時間）和細(xì)胞生產(chǎn)率的影響。由于，所以。3.連續(xù)培養(yǎng)和分批培養(yǎng)生產(chǎn)率的比較連續(xù)培養(yǎng)的生產(chǎn)率可表示為：則：可推導(dǎo)出連續(xù)培養(yǎng)與分批培養(yǎng)生產(chǎn)率之比為：由于，所以，，則上式可簡化為：由式中可見，μmax越大，連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)率與分批培養(yǎng)生產(chǎn)率之比越大，采用連續(xù)培養(yǎng)越有利，如μmax過小，則不宜采用連續(xù)培養(yǎng)。4.帶有細(xì)胞再循環(huán)的單級恒化器將單級恒化器的流出液用離心機(jī)離心，將流出液中的微生物細(xì)胞再部分地回加到發(fā)酵罐內(nèi)，形成再循環(huán)系統(tǒng)。這樣可以增加系統(tǒng)的穩(wěn)定性，而且可使恒化器內(nèi)細(xì)胞的濃度增加。X1和X2分別代表從發(fā)酵罐和離心機(jī)流出的細(xì)胞濃度，F(xiàn)和F1分別代表流入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基流速和流出離心機(jī)的培養(yǎng)液的流速。如果引入再循環(huán)比率α和濃縮因子C兩個參數(shù)，在恒定狀態(tài)下可推導(dǎo)出：

當(dāng)存在細(xì)胞再循環(huán)時，μ不再等于D0，因為C＞1，所以1＋α-αC永遠(yuǎn)小于1，則μ永遠(yuǎn)小于D。這就表明，在帶有細(xì)胞再循環(huán)的單級恒化器中，有可能達(dá)到很高的稀釋率，而細(xì)胞沒有被“清洗”的危險。同樣，在恒定狀態(tài)下細(xì)胞濃度比不帶再循環(huán)的恒化器大一個因子：代入Monod方程：則：5.多級連續(xù)培養(yǎng)

這是一種簡單的多級連續(xù)培養(yǎng)示意圖。F為由第一個發(fā)酵罐流出的培養(yǎng)液的流速（以L/h表示），V1和V2分別為第一和第二個發(fā)酵罐的體積（以L表示），F(xiàn)’是補(bǔ)加到第二個發(fā)酵罐的新鮮培養(yǎng)基的流速（以L/h表示），F(xiàn)2=F1+F’，S0和S0’分別為加到第一和第二個發(fā)酵罐內(nèi)的限制性營養(yǎng)物濃度，S0和S0’分別為剩余限制性營養(yǎng)物的濃度，X1和X2分別為第一和第二個發(fā)酵罐內(nèi)的細(xì)胞濃度。這樣可以推導(dǎo)出在恒定狀態(tài)下，兩級串聯(lián)恒化器中每個發(fā)酵罐內(nèi)物料平衡的結(jié)果，如下表所示。由表可見，在第2個發(fā)酵罐內(nèi)，μ2≠D2，如果不向第二個發(fā)酵罐補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，則第二個發(fā)酵罐內(nèi)的凈生長速度就會很小；如果向第二個發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，不僅可以促進(jìn)細(xì)胞的生長，而且可以使D選定在比μmax更大的數(shù)值。6.連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點、缺點（1）優(yōu)點

恒定狀態(tài)下高速生長的環(huán)境，可用于代謝、生理生化和遺傳特性的研究。減少清洗裝料、消毒、接種、放罐等時間，提高生產(chǎn)效率。

發(fā)酵產(chǎn)品，質(zhì)量比較穩(wěn)定。（2）缺點①

由于是開放系統(tǒng)，加上發(fā)酵周期長，容易造成雜菌污染

②在長周期連續(xù)發(fā)酵中，微生物容易發(fā)生變異

③對設(shè)備、儀器及控制元器件的技術(shù)要求較高

④粘性絲狀菌菌體容易附著在器壁上生長和在發(fā)酵液內(nèi)結(jié)團(tuán)，給連續(xù)發(fā)酵操作帶來困難

◆由于上述情況，連續(xù)發(fā)酵目前主要用于研究工作中，如發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)的測定，過程條件的優(yōu)化試驗等等，在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用還不多?！艄I(yè)上生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白(SCP)通常采用連續(xù)發(fā)酵的方法，其底物通常為農(nóng)產(chǎn)品、林產(chǎn)品及工業(yè)副產(chǎn)物。連續(xù)發(fā)酵在工業(yè)上用于大量生產(chǎn)微生物代謝產(chǎn)物的實例較少。◆可用于面包酵母和飼料酵母的生產(chǎn)，以及有機(jī)廢水的活性污泥處理。新近發(fā)展的一種培養(yǎng)方法則是把固定化細(xì)胞技術(shù)和連續(xù)培養(yǎng)方法結(jié)合起來，用于生產(chǎn)丙酮、丁醇、正丁醇、異丙醇等重要工業(yè)溶劑。

第三節(jié)微生物生長代謝過程數(shù)學(xué)模型的建立

微生物反應(yīng)是很多種物質(zhì)參與的復(fù)雜代謝過程的綜合結(jié)果，因此，微生物反應(yīng)的動力學(xué)方程只能通過數(shù)學(xué)模擬得到。而建立動力學(xué)模型的難點在于菌株的變異和天然培養(yǎng)基組成的不確定性。一.連續(xù)培養(yǎng)時微生物生長的數(shù)學(xué)模型二.分批培養(yǎng)時微生物生長的數(shù)學(xué)模型一.連續(xù)培養(yǎng)時微生物生長的數(shù)學(xué)模型

在溫度和pH值恒定時,μ隨著培養(yǎng)基成分濃度的變化而變化。若某一培養(yǎng)基成分的濃度為S，并且其它成分的濃度不變，則：μ=f(S)1942年，Monod根據(jù)微生物細(xì)胞生長比速與限制性基質(zhì)濃度有關(guān)的事實提出了微生物生長與限制性基質(zhì)濃度之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型——莫諾方程：

當(dāng)同一種微生物在不同濃度的限制性基質(zhì)下時，測定其比生長速度，在[S]濃度低時，μ隨[S]的增加而增