SDS-PAGE法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量

SDS電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私?口5^八6￡垂直板型電泳法的基本原理及操作技術(shù)學(xué)習(xí)SDS法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理SDS即十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis）：.在混合樣品中各蛋白質(zhì)組分的遷移率主要取決于分子大小和形狀以及所帶電荷量。.在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入適量SDS（陰離子表面活性劑），使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上（一定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與之結(jié)合比為1.4gSDS/1gprotein），使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)之間原有的電荷差別。此時(shí)特定蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于其分子量大小，而其它因素對(duì)電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計(jì)。.蛋白質(zhì)分子量在15,000?200,000之間時(shí)，其電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)值線性相關(guān)：若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可以獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，而從未知蛋白質(zhì)在相同電泳條件下的遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其分子量。SD6電端分離蛋白SW處劃的樣品SD6電端分離蛋白SW處劃的樣品：LL較怕淡木蛔受白實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑垂直板型電泳槽直流穩(wěn)壓電源微量注射器移液器水浴鍋染色槽燒杯試管滴管分離膠緩沖液(1.5mol/LTris-HCl,pH8.8)：稱取Tris18.15g，加約80ml無(wú)離子水，用1mol/LHCl調(diào)pH至8.8,無(wú)離子水定容至100ml，4℃保存濃縮膠緩沖液(0.5mol/LTris-HCl液，pH6.8)：稱取Tris6g，加約60ml無(wú)離子水，用1mol/LHCl調(diào)pH至6.8,無(wú)離子水定容至100ml，4℃保存凝膠貯液：稱取丙烯酰胺(Acr)29.2g及N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0.8g，重蒸水定容至100ml，過(guò)濾后置棕色試劑瓶于4℃保存10%濃縮膠貯液：稱Acr10g及Bis0.5g，溶于重蒸水中并定容至100ml，過(guò)濾后置棕色試劑瓶于4℃保存

10%SDS溶液：10gSDS加重蒸水定容至100ml，室溫保存（低溫下易析出結(jié)晶，用前微熱，使其完全溶解）1%TEMED（四甲基二乙胺）10%過(guò)硫酸銨（AP）：配制后分裝，-20℃保存電泳緩沖液（Tris-Gly緩沖液PH8.3）：稱取Tris6.0g，甘氨酸28.8g,SDS1.0g,用無(wú)離子水溶解后定容至1L染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)G-250,加入454ml50%甲醇溶液和46ml冰乙酸即可脫色液：75ml冰乙酸，875ml重蒸水與50ml甲醇混勻?qū)嶒?yàn)步驟安裝夾心式垂直板電泳槽：夾心式垂直板電泳槽有很多型號(hào)，主要結(jié)構(gòu)相同，且操作簡(jiǎn)單，不易泄漏。可根據(jù)具體不同型號(hào)要求進(jìn)行操作。主要注意事項(xiàng)：安裝前，膠條、玻板、槽子都要潔凈干燥；勿用手接觸灌膠面的玻璃。配膠：根據(jù)待測(cè)蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠和濃縮膠濃度，按下表配制：試劑12%分離膠3%濃縮膠去離子水ml3.353.121.5mol/LTris-HClml2.50.5mol/LTris-HClml1.2510%SDSml0.10.05凝膠貯液ml4.00.610%APl50251%TEMEDl55制備凝膠板：①分離膠制備：按表配制12%分離膠。由于AP和TEMED相遇后凝膠即開(kāi)始聚合，所以應(yīng)立即混勻混合液?；靹蚝笥靡埔簶尦槿?.2?3.5ml凝膠液，加至長(zhǎng)、短玻璃板間的縫隙內(nèi)。再用滴管取少許蒸餾水，沿長(zhǎng)玻璃板壁緩慢注入約3?4mm高，以進(jìn)行水封。30?60min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。②濃縮膠的制備：按表配制3%濃縮膠（待分離膠聚合后再加AP/TEMED），混勻后用移液槍加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處。輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，避免帶入氣泡。約30min后凝膠聚合。待凝膠凝固后，小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將Tris-Gly電泳緩沖液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒(méi)過(guò)短板約0.5cm以上，即可準(zhǔn)備加樣。樣品處理及加樣蛋白質(zhì)標(biāo)樣及待測(cè)蛋白都用樣品溶解液溶解，使?jié)舛葹?.5?1mg/ml，沸水浴加熱3分鐘，冷卻至室溫備用（處理好的樣品液如經(jīng)長(zhǎng)期存放，使用前應(yīng)在沸水浴中加熱1min，以消除亞穩(wěn)態(tài)聚合）。一般加樣體積為10?151。如樣品較稀可適量增加加樣體積。用微量注射器小心將樣品通過(guò)緩沖液加到凝膠凹形樣品槽底部（雙手操作，避免傷及凝膠），待所有樣品槽內(nèi)都加完樣品后即可開(kāi)始電泳。電泳將直流穩(wěn)壓電泳儀開(kāi)關(guān)打開(kāi)，將電流調(diào)至10?20mA（穩(wěn)流）開(kāi)始電泳。待藍(lán)色染料（溴酚藍(lán)）遷移至距凝膠底部約1cm時(shí)關(guān)閉電源。染色及脫色取出玻璃板，在適當(dāng)水流下用取膠板輕輕將短玻璃板撬開(kāi)移去，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色。將染色液倒入培養(yǎng)皿中，染色出左右，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白區(qū)帶清晰。相對(duì)分子量計(jì)算用直尺分別量取各蛋白質(zhì)條帶中心以及溴酚藍(lán)條帶中心距分離膠頂端的距離，按下式計(jì)算：相對(duì)遷移率=樣品遷移距離（cm）/染料遷移距離（cm）以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)對(duì)相對(duì)遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量。注意事項(xiàng)并非所有蛋白質(zhì)都能用此法測(cè)定其分子量。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測(cè)出的分子量是不可靠的，包括電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。例如組蛋白F1本身帶有大量正電荷，盡管結(jié)合有正常比例的SDS,仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響：其分子量是21,000，但用本法測(cè)定的結(jié)果卻是35,000。因此有必要至少用兩種方法來(lái)測(cè)定未知樣品的分子量，以便互相驗(yàn)證。有許多蛋白質(zhì)是由多個(gè)亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)赟DS和巰基乙醇的作用下解離成亞基或單條肽鏈。因此，對(duì)于這一類