血片制作染色和血檢質(zhì)量控制二

一、血片制作血膜的制作用于檢查瘧原蟲的血涂片有兩種：一種是將血液涂呈薄膜狀，稱薄血膜；一種是血液涂成圓盤，稱厚血膜。薄血膜上的血細(xì)胞要求平輔在玻片上面。發(fā)熱病人血片標(biāo)本片1血膜的制作（取血時(shí)間）取血時(shí)機(jī)現(xiàn)癥病人一般可隨時(shí)取血，瘧疾普查時(shí)可不考慮取血時(shí)機(jī)。但在診斷或需要某期瘧原蟲作標(biāo)本時(shí)，則應(yīng)掌握適宜的取血時(shí)機(jī)。間日瘧在寒熱發(fā)作時(shí)，外周血液中主要可見環(huán)狀體期；發(fā)作后數(shù)小時(shí)，環(huán)狀體發(fā)育到滋養(yǎng)體期，瘧色素形成，形態(tài)較易辯認(rèn)，為診斷的有利時(shí)機(jī)；36~48小時(shí)，可檢出裂殖體；發(fā)作一、二次后，配子體出現(xiàn)較多。惡性瘧較理想的取血時(shí)間是在發(fā)作后至20小時(shí)內(nèi)取血，初發(fā)患者退熱后常查不到原蟲。2血膜的制作（取血操作）取血方法采血部位一般人為耳垂，指頭，通常在耳垂取血（現(xiàn)場取血用采血針采血，一人一針，避免血傳疾?。┫扔?5%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻動耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方，右手持消毒針迅速刺入耳垂下端1~2毫米，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕向上擠壓出血。3取血量及涂片法（涂片操作）薄血膜取潔凈的載玻片2張，1張平置在桌上，以左手拇指，食指夾持載玻片兩端（手指切勿接觸玻片表面），用另一張邊緣平滑（最好為磨口邊緣）的載玻片做推片，用推片一端邊緣的中點(diǎn)從取血部分取約1微升的血量（相當(dāng)于1/4火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，并形成25~30度夾角，待血液向兩側(cè)擴(kuò)展約2厘米長度時(shí)，均勻而迅速地輕輕向左推出（約2.5厘米長）。4（涂片操作）厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火柴頭大小），使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外或由外向里一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜，血膜厚薄均勻，過厚易于脫落，過薄達(dá)不到檢出率的要求。5血膜的制作（涂片操作）涂制厚、薄血膜的位置通常是將厚、薄血膜涂在一張載片上。方法是將載片分為6等分，第1、2格備貼標(biāo)簽及編號用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前緣至第6格中部。作為標(biāo)本的血片每張玻片涂厚、薄血膜各1個(gè)；門診和發(fā)熱病人血片涂2個(gè)厚血膜1個(gè)薄血膜，以防血膜脫落而影響檢查；瘧疾調(diào)查時(shí)，每張玻片可涂制2~3人血膜。6血膜的制作血膜編號血膜制成后，立即用特種蠟筆或水筆于玻片面上寫上受檢者的號碼，以防差錯(cuò)，待薄血膜干后再用鉛筆于薄血膜中寫上血片種類的代號和受檢者的個(gè)人編號，依次順序插入標(biāo)本盒內(nèi)。7制作血膜的注意事項(xiàng)

1.玻片清洗時(shí)，避免玻片碰撞、磨損。制作血膜的載玻片必須完全清潔而毫無油漬或污垢。制片時(shí)，手指只能持載片的邊緣，不能接觸玻片表面，以免油污使薄血膜產(chǎn)生空白區(qū)以及厚血膜脫落。作為推片的玻片邊緣一定要平滑，才能使推出的血膜均勻一致。8制作血膜的注意事項(xiàng)2.剛涂制的血膜要平放在標(biāo)本盒內(nèi)，厚血膜未干前勿使標(biāo)本盒傾斜，以免血膜傾向一側(cè)，造成血膜厚薄不均，厚處不一溶血和著色而影響檢查結(jié)果；晾干血膜時(shí)應(yīng)注意防塵、防止蒼蠅、蟑螂等昆蟲吮吸血膜，干后應(yīng)及時(shí)裝入標(biāo)本盒并蓋嚴(yán)，新的木制標(biāo)本盒需敞開放置一段時(shí)間，讓木醇揮發(fā)后才能使用，以免厚血膜紅蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。9制作血膜的注意事項(xiàng)3.血膜讓其自然干燥，切忌用太陽曬或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天標(biāo)本盡可能24~48小時(shí)內(nèi)固定染色；冬天也不能超過72小時(shí)。放置時(shí)間越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及時(shí)染色，膜血膜宜先用甲醇固定（1~3分鐘）然后用過濾清水對厚血膜溶血，晾干固定后裝入盒內(nèi)蓋嚴(yán)，待以后染色。10二、血片片的染色色

（一一）染液液的種類類及染色色原理染液種類類：目前所用用的血片片染色液液，雖然然名稱很很多，但但都是從從羅門諾諾夫斯基基氏創(chuàng)造造的染液液變化過過來的。?？偟目煽煞譃樗芤汉秃途凭苋芤簝纱蟠箢悾扒罢甙ɡ_氏、、西氏（（Simon)、J.S.B氏染液等等，后者者包括利利氏(Leishman)、瑞氏和吉吉氏染液液等。這這些染液液中的主主要染劑劑都包含含美蘭、、伊紅和和由美蘭蘭氧化所所成的天天青，所所以稱多多色性染染劑。11血片的染染色（（一）染染液的種種類及染染色原理理染色原理理：伊紅是酸性水溶性鈉鈉鹽，美美蘭是堿性水溶性鹽鹽酸鹽，，當(dāng)它們們各自溶溶化水中中時(shí)，就就離解為為帶陽電電和陰電電的離子子。伊紅紅主要離離解為酸酸性的12血片的染染色（（一）染染液的種種類及染染色原理理染色原理理：美蘭與與伊紅都都不能使使原蟲和和白細(xì)胞胞的核著著色，必必須由天天青作為為媒介（（染媒））才能使使其著色色。天青青雖然也也是堿性性染劑，，但又具具有染媒媒作用，，使原蟲蟲核和白白細(xì)胞核核等原來來只能染染上極淡淡蘭色的的結(jié)構(gòu)染染上顯著著的酸性性染劑伊伊紅，這這樣，就就使白細(xì)細(xì)胞粗大大的核染染成顯著著的既蘭蘭又紅的的紫蘭色色，而較較小或菲菲薄的原原蟲核和和淋巴細(xì)細(xì)胞原漿漿中的顆顆粒染成成紫紅色色。13血片的染染色（（一）染染液的種種類及染染色原理理注意：蛋白質(zhì)質(zhì)是二性電解質(zhì)，，當(dāng)其處處于較等電點(diǎn)為酸的溶溶液中時(shí)時(shí)，便呈呈鹼的作作用，即即與酸結(jié)結(jié)合*，這就說說明為何何在染液液偏酸時(shí)時(shí)，伊紅紅的著色色力強(qiáng)，，使紅細(xì)細(xì)胞著色色鮮艷而而淋巴細(xì)細(xì)胞和原原蟲的胞胞漿著色色不著；；反之，，蛋白質(zhì)質(zhì)在偏鹼鹼的溶液液中呈酸酸的作用用而中和和鹼基，，也就說說明為何何染液偏偏鹼時(shí)，，紅細(xì)胞胞和嗜伊伊紅白細(xì)細(xì)胞的顆顆粒等被被染成紫紫蘭色。。伊紅在水水溶液內(nèi)內(nèi)遇到美美蘭或天天青，時(shí)時(shí)間一長長即可互互相化合合而產(chǎn)生生沈淀從從而失去去染色力力，因此此，吉氏母液液絕對不不能進(jìn)水水。14血片的染染色（（二）吉吉氏染液液母液配配置方法法取吉氏粉粉0.5克置于研研缽中，，加少量量甘油充充分研磨磨，再加加再磨，，至25毫升加完完為止，，倒入60或100毫升帶有有玻塞的的有色玻玻瓶中。。在研缽缽中加少少量甲醇醇，洗去去甘油濃濃液混入入瓶內(nèi)，，至25毫升甲醇醇洗凈缽缽中甘油油染液為為止，塞塞緊瓶塞塞，充分分搖勻，，置于55~60℃水浴中或或溫箱內(nèi)內(nèi)24小時(shí)或室室溫內(nèi)3~5天，多加搖搖動，即成成原液。吉吉氏染液是是目前較優(yōu)優(yōu)良的血膜膜染劑，即即使在炎熱熱天氣中，，亦可經(jīng)久久不變。材料：1、吉氏粉粉0.5克克2、甘油25毫升3、甲醇25毫升15血片的染色色

（三））吉氏染液液血片染色色方法先用甲醇或或無水酒精精固定薄血血膜，待干干后進(jìn)行染染色。亦可可在固定薄薄血膜后用用清水對厚厚血膜溶脫脫血紅蛋白白，然后才才進(jìn)行染色色。成批血片染染色：將已固定定薄血膜的的血片插入入染色缸，，倒入2%吉氏染液稀稀釋液（2毫升原液加加中性蒸餾餾水98毫升稀釋均均勻即成）），同時(shí)對對厚薄血膜膜染色30分鐘（如染染液不合標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，得得酌情增減減染色時(shí)間間），然后后用清水輕輕輕將染液液沖去，再再用清水輕輕輕沖洗一一次，干凈凈后將血片片標(biāo)本（血血膜面朝下下）插于晾晾干板上，，待干鏡檢檢。16血片的染色色

（三））吉氏染液液血片染色色方法先用甲醇或或無水酒精精固定薄血血膜，待干干后進(jìn)行染染色。亦可可在固定薄薄血膜后用用清水對厚厚血膜溶脫脫血紅蛋白白，然后才才進(jìn)行染色色。單張血片染染色：薄血膜經(jīng)經(jīng)固定干燥燥后，用2%吉氏染液稀稀釋液1~2毫升，滴入入血片標(biāo)本本上染色30分鐘左右，，或用中性性蒸餾水1毫升，加吉吉氏母液1~2滴，混合均均勻后滴入入血片標(biāo)本本上，染色色10~20分鐘，然后后用清水輕輕輕將片上上的染液沖沖洗干凈，，晾干鏡檢檢。17影響染色效效果的因素素血片染色好好壞除了與與玻片是否否清潔，血血片制作質(zhì)質(zhì)量好壞等等有關(guān)外，，還受到以以下幾個(gè)因因素的影響響：（1）染料溶劑劑的質(zhì)量染染料、、甲醇和甘甘油如果不不純，常使使配制的染染液偏酸或或偏堿而影影響染色效效果。因此此必須用分分析純的甲甲醇和中性性甘油，而而且在配制制時(shí)所用的的器具必須須干凈而無無水份。18影響染色效效果的因素素（2）染液的新新舊新新配制的染染液因色素素尚未充分分溶解，染染色力較弱弱且常呈現(xiàn)現(xiàn)偏堿性。。染液存放放時(shí)間越久久，染色力力越強(qiáng)。通通常在染液液配制1~2周后才使用用，盛裝染染液的瓶子子應(yīng)加塞蓋蓋密。以防防吸潮而影影響染液質(zhì)質(zhì)量。19影響染色效效果的因素素（3）染液稀釋釋后使用時(shí)時(shí)間吉吉氏和瑞氏氏染液的主主要成份是是美藍(lán)、伊伊紅和由美美藍(lán)氧化產(chǎn)產(chǎn)生的天青青，三者能能在酒精溶溶液中溶解解，但在水水溶液中伊伊紅遇到美美藍(lán)和天青青即產(chǎn)生沉沉淀。因此此，必須在在稀釋染液液當(dāng)時(shí)使用用，一般在半小小時(shí)內(nèi)染色力最強(qiáng)強(qiáng)。20影響染色效效果的因素素（4）染液的稀稀釋濃度染染液的的濃度高其其著色就快快而深，從從而瘧原蟲蟲寄生紅細(xì)細(xì)胞的薛氏氏點(diǎn)粗大顯顯著，但顏顏色常偏堿堿；染液濃濃度過低則則染色時(shí)間間久，顏色色偏酸，薛薛氏點(diǎn)不明明顯或消失失。21影響染色效效果的因素素（5）染色時(shí)間間染色色時(shí)間長染染色效果好好，反之較較差。室溫溫高則著色色快，染色色時(shí)間可略略縮短，氣氣溫低可適適當(dāng)延長。。因此染色色時(shí)間應(yīng)根根據(jù)染液的的質(zhì)量、新新舊、稀釋釋濃度和氣氣溫而適當(dāng)當(dāng)增減。22影響染色效效果的因素素（6）染色用水水染液液的稀釋用用水和染色色后沖洗用用水應(yīng)選擇擇Ph7.0~7.2清潔水，通通常使用的的新鮮的蒸蒸餾水或過過濾的冷開開水，以及及自來水、、井水、河河水、泉水水和雨水等等。如果偏偏酸或偏堿堿，可用緩緩沖蒸餾水水調(diào)整。染染色后發(fā)現(xiàn)現(xiàn)血膜顏色色偏藍(lán)（偏偏堿）或偏偏紅（偏酸酸）時(shí)，可可用與之相相反的酸、、堿度水沖沖洗血片予予以糾正。。23影響染色效效果的因素素（7）染色后不不要直接將將染液倒掉掉，應(yīng)沿玻玻片或染色色缸邊緣加加水使染液液表面一層層溢出，并并輕輕沖洗洗，以免染染液色素顆顆粒沾污血血膜。24三、發(fā)熱病病人血檢的的質(zhì)量控制制19世紀(jì)后后期，顯微微鏡的出現(xiàn)現(xiàn)使人們不不斷發(fā)現(xiàn)了了傳染病的的病因，1880年年法國軍醫(yī)醫(yī)拉韋朗（（Laveran）第一次見到到并描述了了人紅細(xì)胞胞內(nèi)的瘧原原蟲，至此此才解開了了困擾人們們數(shù)千年的的瘧疾的病病因之謎。。25三、發(fā)熱病病人血檢的的質(zhì)量控制制此后，隨著著顯微鏡的的不斷改進(jìn)進(jìn)和血膜上上瘧原蟲染染色方法的的出現(xiàn)，使使顯微鏡檢檢查瘧原蟲蟲的方法成成為瘧疾病病原學(xué)診斷斷的重要手手段。盡管管這種方法法存在著操操作復(fù)雜、、技術(shù)難于于掌握等缺缺點(diǎn)，但以以其高特異異性一直被被作為確診診病例主要要依據(jù)。時(shí)時(shí)止今日，，由于技術(shù)術(shù)的、經(jīng)濟(jì)濟(jì)的等原因因，鏡檢瘧瘧原蟲仍是是我國瘧疾疾病例確診診的金標(biāo)。。26三、發(fā)熱病病人血檢的的質(zhì)量控制制在瘧疾診斷斷標(biāo)準(zhǔn)中把把瘧疾病例例分為疑似似病例、臨臨床病例、、確診病例例和帶蟲者者，前兩者者依據(jù)流行行病學(xué)史和和臨床表現(xiàn)現(xiàn)即可做出出診斷，而而后兩者需需通過發(fā)現(xiàn)現(xiàn)病原方能能做出診斷斷。另外，，除帶蟲者者外，病例例的最基本本臨床表現(xiàn)現(xiàn)為發(fā)熱。。1、目的的與意義27三、發(fā)熱病病人血檢的的質(zhì)量控制制因此血檢的的目的在于于通過對發(fā)發(fā)熱病人血血檢達(dá)到確確診瘧疾病病例。它的意義在在于及時(shí)發(fā)發(fā)現(xiàn)傳染源源和明確感感染的瘧原原蟲種類，，以能針對對蟲種選擇擇正確的治治療方案。。1、目的的與意義28三、發(fā)熱病病人血檢的的質(zhì)量控制制在瘧疾嚴(yán)重重流行時(shí)期期，衛(wèi)生部部有關(guān)文件件中提出，，瘧區(qū)的各各級醫(yī)療衛(wèi)衛(wèi)生單位，，都要把發(fā)發(fā)熱病人血血檢瘧原蟲蟲列為常規(guī)規(guī)。2、血檢檢對象29三、發(fā)熱病病人血檢的的質(zhì)量控制制2、血檢檢對象但根據(jù)20世紀(jì)80年代各地地的觀察結(jié)結(jié)果表表明明，全部血血檢陽性的的病例中，，有47.8%（江江蘇）、73.5%（山東））、77.7%（南南方7省））、84.1%（河河南）是在在臨床初診診為瘧疾、、疑似瘧疾疾的發(fā)熱病病中查出的的，而其它它15%~42%的的病例，是是在臨床初初診為發(fā)熱熱原因不明明和感冒及及其它發(fā)熱熱病人中查查出的。30三、發(fā)熱病病人血檢的的質(zhì)量控制制2、血檢檢對象因此，為盡盡可能多地地發(fā)現(xiàn)病人人，各地把把臨床初診診為瘧疾、、疑似瘧疾疾、發(fā)熱原原因不明和和感冒及其其它發(fā)熱的的“四熱””病人列為為血檢對象象。31三、發(fā)熱病病人血檢的的質(zhì)量控制制2、血檢檢對象但是，隨著著瘧疾流行行程度的降降低，“四四熱”病人人中查出的的瘧疾病例例所占的比比例也發(fā)生生了變化。。上世紀(jì)90年代初初，在全國國10省省、區(qū)發(fā)病病率穩(wěn)定在在1/萬以以下地區(qū)開開展研究，，發(fā)現(xiàn)92.33%的病病例發(fā)生在在臨床診斷斷為瘧疾、、疑似瘧疾疾（包括來來自高瘧區(qū)區(qū)流動人口口）中（見見表）。32三、發(fā)熱病病人血檢的的質(zhì)量控制制2、血檢檢對象臨床初診血檢人數(shù)陽性人數(shù)陽性率%占總陽性人數(shù)%瘧疾1093167064.4964.24疑似瘧疾247332932.3528.09發(fā)熱原因不明10602760.027.29其它9608440.0040.38表各類類發(fā)熱病人人血檢原蟲蟲陽性率33三、發(fā)熱病病人血檢的的質(zhì)量控制制2、血檢檢對象表中顯示，，在診斷為為發(fā)熱原因因不明的病病人中，原原蟲陽性率率僅為0.02%，，也就是說說檢出1例例病人要鏡鏡檢5000張以上上血片；而而在“其它它”發(fā)熱病病人中檢查查2.4萬萬病人方檢檢出1例病病人。34三、發(fā)熱病病人血檢的的質(zhì)量控制制2、血檢檢對象因此提出發(fā)發(fā)病率在1/萬地區(qū)區(qū)，由于92%以上上的病例在在診斷為瘧瘧疾、疑似似瘧疾（包包括來自高高瘧區(qū)流動動人口）““二熱”病病人中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)，因此以以“二熱””病人為血血檢對象即即可。至于于在發(fā)熱原原因不明中中查出的7%病例，，可在其出出現(xiàn)疑似瘧瘧疾的癥狀狀時(shí)再做血血檢，這就就極大的減減少了工作作量。35三、、發(fā)發(fā)熱熱病病人人血血檢檢的的質(zhì)質(zhì)量量控控制制2、、血血檢檢對對象象提供供以以上上資資料料，，僅僅供供在在確確定定血血象象時(shí)時(shí)參參考考，，各各地地可可根根據(jù)據(jù)當(dāng)當(dāng)?shù)氐氐牡寞懐懠布擦髁餍行谐坛潭榷?、、血血檢檢的的具具體體目目的的來來確確定定血血檢檢對對象象。。36三、、發(fā)發(fā)熱熱病病人人血血檢檢的的質(zhì)質(zhì)量量控控制制3、、血血檢檢率率發(fā)熱熱病病人人血血檢檢率率是是指指血血檢檢的的人人數(shù)數(shù)占占血血檢檢范范圍圍人人口口的的比比率率。。血血檢檢率率的的高高低低應(yīng)應(yīng)以以瘧瘧疾疾的的流流行行程程度度來來定定。。20世世紀(jì)紀(jì)50年年代代WHO提出出，，在在實(shí)實(shí)施施抗抗瘧瘧計(jì)計(jì)劃劃的的攻攻擊擊期期，，年年血血檢檢率率在在10%以以上上。。我我國國基基本本消消滅滅瘧瘧疾疾標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)中中提提出出年年血血檢檢率率5%以以上上。。37三、、發(fā)發(fā)熱熱病病人人血血檢檢的的質(zhì)質(zhì)量量控控制制3、、血血檢檢率率在目目前前，，年年檢檢率率應(yīng)應(yīng)多多高高？？各各地地應(yīng)應(yīng)根根據(jù)據(jù)當(dāng)當(dāng)?shù)氐丿懐懠布驳牡牧髁餍行兴狡?，，在在以以臨臨床床初初診診為為瘧瘧疾疾和和疑疑似似瘧瘧疾疾為為重重點(diǎn)點(diǎn)的的基基礎(chǔ)礎(chǔ)上上，，來來確確定定血血檢檢對對象象。。38三、、發(fā)發(fā)熱熱病病人人血血檢檢的的質(zhì)質(zhì)量量控控制制3、、血血檢檢率率根據(jù)據(jù)上上世世紀(jì)紀(jì)90年年代代初初，，在在全全國國10省省、、區(qū)區(qū)發(fā)發(fā)病病率率穩(wěn)穩(wěn)定定在在1/萬萬以以下下地地