免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)基本原理：。在胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、腫瘤、藥物檢測(cè)、免疫學(xué)、血型鑒定等。常見(jiàn)熒光色素：為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：（一）熒光色素異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水389.490495n520530n，呈（rhodamine，RIB200）570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm，呈橘紅色熒光。四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：最大550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比（二）其他熒光物質(zhì)4--β-D半乳糖苷受甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，1激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對(duì)羥基苯乙酸等。鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪Eu3、鋱Tb3、鈰Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+Eu3+螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，最適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀和時(shí)間分辨熒光計(jì)等儀器激光共聚焦顯微鏡熒光一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定擾，以及激發(fā)光源的雜射光的影響，使靈敏度受到很大限制。時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定是針對(duì)這缺點(diǎn)加以改進(jìn)的一種新型檢測(cè)技術(shù)。其基本原理是以鑭系元素銪螯合物作熒光標(biāo)記物，利用這類熒光物質(zhì)有長(zhǎng)熒光TR-FIA的測(cè)17-417-5。其中增強(qiáng)液的作用是使熒pH2～3，銪離子很容易解離出來(lái)，并與增器（1000次的氙燈），0.2～1ng/ml。解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觯―issociationEnhancedLanthanide的螯合劑，使其一端與銪/EU標(biāo)記的2抗體/Eu3+Eu3+同增強(qiáng)劑中的另一種螯合劑兩對(duì)半定量測(cè)定乙肝病毒標(biāo)記物的檢測(cè)方法常用測(cè)定乙肝病毒的抗原、抗體標(biāo)記物6070酶聯(lián)免疫吸附、同位素免疫標(biāo)記80年代中建立的稀土離子熒光標(biāo)記（時(shí)間分辨熒光免疫分析）等不同的檢測(cè)方法。隨著科學(xué)的發(fā)展和檢驗(yàn)(其中RIA為10-12mol/L、ELISA為10-9mol/L、CLIA為10-15mol/L、ECL10為-17/L、TRF為10-18mol/L)為近年新研制成功的用三價(jià)稀土離子作為示蹤物，以單克隆抗體包被支持物與樣品中抗原反應(yīng)，再加入用銪標(biāo)記的抗體，進(jìn)法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)記物較其他方法靈敏度高、特異性好，因干擾因素少可大地優(yōu)于以上各種方法，可與HBV-DNAHBV-DNA檢測(cè)，多年為目前檢測(cè)乙TRF“為臨床診斷乙肝提供了新手段HBV感染情況、療效的觀察和轉(zhuǎn)歸等情況的分析，至少可對(duì)下列23.懷孕前進(jìn)行定量TRFIAELISA法，乙肝兩對(duì)半的定量制定將給臨床提供一個(gè)關(guān)于乙肝診斷及療效，預(yù)后判斷的更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1.極大地提高了檢HbsAg0.2ng/ml,而酶標(biāo)2ng/ml，極大地提高檢測(cè)的靈敏度。因此，在急性乙肝早期能及HbsAgHBVHbsAg攜帶者；在部分慢HBV3HbsAg和HbsAb提供依據(jù)。2.能動(dòng)態(tài)觀察療效和監(jiān)測(cè)病情1）定量分析HBsAg和HBsAb的濃度變化，可HBsAgHBsAb2）定量分析HBeAgHBeAb的濃度變化，可反映病情HBeAgHBeAbHBeAg濃度HbeAbHBeAgHBeAb一方面提示病情好轉(zhuǎn)，而在某些時(shí)候（如肝功能指標(biāo)很差）則可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關(guān)。3）HBcAb濃度的高低可反映病毒感染的狀態(tài)。高濃度的抗-Hbc-Hbc4）有利于對(duì)慢性肝炎活動(dòng)性或非活動(dòng)性的判斷。非活3.TRFIAPCR技術(shù)可互相補(bǔ)充血清HBV—DNAPCRHBVHBV—DNA陰性并HBV”HBV4.HbsAb的定量測(cè)定能夠?qū)σ腋蔚念A(yù)防起到監(jiān)督作用HbsAb的定量測(cè)定能夠?qū)贵w是否真正“”HBVHbsAb的含量在10mlU/mlELISA檢測(cè)即可呈陽(yáng)性結(jié)果，但并不提示機(jī)體都一定具有免疫力，而HBsAb10—100mlU/ml陽(yáng)性”HBV的免疫力HBVHbsAb100mlU/ml以上時(shí)才可確定具有抵抗HBVHBsAbHBV的免疫狀態(tài)及乙肝疫苗的免疫效果。因此定量測(cè)定對(duì)乙肝疫苗免疫力的評(píng)價(jià)和高危人群預(yù)防免疫具有重要意義，特別是在少年兒童預(yù)防乙肝方面。二、熒光偏振免疫測(cè)定4熒光偏振免疫分析技術(shù)(FPIA),這是一種均相熒光免疫分析法,如藥485m,,很快以發(fā)出光子的形式釋放能量而還原。發(fā)射出的525550nm,,,因,,分子的轉(zhuǎn)動(dòng)慢,,待測(cè)抗而熒光標(biāo),熒光偏振的程度與熒光標(biāo)記物分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度,,因此熒光偏,可以通過(guò)計(jì)算獲得其含量。方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（CV一般可控制在3％－5檢測(cè)過(guò)程僅需樣品、示蹤劑和抗體的加入和混勻數(shù)分鐘甚至數(shù)秒鐘孵育后即可測(cè)定熒光偏振光強(qiáng)度方法的測(cè)定速度快有利于大批量樣品的分（3）。注意事項(xiàng)：1SantaCruz和含5%BSA的和直接免疫熒光法 注意事項(xiàng)抗體濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過(guò)弱，影響結(jié)果的觀察。5染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10min到數(shù)小時(shí)，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫2，高于3但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用min效果好的多。色的干擾。1-20.01mol/L，pH7.4的PBS。特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。為特異性陽(yáng)性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。間接免疫熒光法 注意事項(xiàng)1h4h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使熒光減