流式細(xì)胞分析

關(guān)于流式細(xì)胞分析1第一頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日2

流式細(xì)胞儀（Flow

Cytometer

簡(jiǎn)稱FCM）是一項(xiàng)集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。概括來(lái)說(shuō)，流式細(xì)胞術(shù)就是對(duì)于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選的技術(shù)。從開(kāi)始設(shè)想到第一臺(tái)儀器的問(wèn)世,科技工作者進(jìn)行了不懈的努力。隨著各相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展，F(xiàn)CM技術(shù)已經(jīng)成為日益完善的細(xì)胞分析和分選的工具。

第二頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日3FCM儀器分為二大類：一類為臺(tái)式機(jī)，其特點(diǎn)為：儀器的光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)便，易學(xué)易掌握。BD公司的臨床型

FACScan也是最早可用于臨床診斷的儀器。另一類為大型機(jī)，其特點(diǎn)為可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來(lái)，并且可將單個(gè)或指定個(gè)數(shù)的細(xì)胞分選到特定的培養(yǎng)孔或板上，同時(shí)可選配多種波長(zhǎng)和類型的激光器，適用于更廣泛更靈活的科學(xué)研究應(yīng)用。第三頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日4●流式細(xì)胞儀實(shí)物BDFACSVantageBD-Calibur第四頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日5其特點(diǎn)是：①測(cè)量速度快，最快可在1秒種內(nèi)計(jì)測(cè)數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；②可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，可以對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等從多領(lǐng)域的知識(shí)和成果；④既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。第五頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日6概要說(shuō)來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)主要包括了樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的分選和計(jì)數(shù)技術(shù)，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。FCM目前發(fā)展的水平凝聚了半個(gè)世紀(jì)以來(lái)人們?cè)谶@方面的心血和成果。第六頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日7流式細(xì)胞儀發(fā)展的歷史起源:1934年---細(xì)胞計(jì)數(shù)儀雛形:1949年---Coulter計(jì)數(shù)器1959年---B型Coulter計(jì)數(shù)器1972年:BD(Becton-Dickinson)

第一臺(tái)流式細(xì)胞儀,具有分選功能

第七頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日8流式細(xì)胞儀主要由三部分組成：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)。其作用如下：液流系統(tǒng)：依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)。光路系統(tǒng)：細(xì)胞由激光激發(fā)，通過(guò)光學(xué)濾片產(chǎn)生光信號(hào)，并傳送到相應(yīng)的探測(cè)器。電系統(tǒng)：把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。

第八頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日9在流式細(xì)胞儀中，細(xì)胞被傳送到液流中的激光照射區(qū)。任何存在于懸液中的直徑為0.2-150微米的粒子或細(xì)胞都適用于流式分析。在實(shí)際工作中，用實(shí)體組織進(jìn)行流式細(xì)胞分析往往是不可能的，分析之前必須對(duì)其進(jìn)行分解。被液滴包繞的粒子稱為細(xì)胞液柱，當(dāng)粒子經(jīng)過(guò)激光照射區(qū)時(shí)，通過(guò)激光激發(fā)產(chǎn)生散射光。含有熒光的粒子就會(huì)表現(xiàn)出其熒光特性。散射光和熒光由光路系統(tǒng)（相應(yīng)的透鏡，濾片和探測(cè)器）收集。分光器和濾光片引導(dǎo)散射光和熒光至相應(yīng)的探測(cè)器，把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。第九頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日10第十頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日11液流系統(tǒng)

液流系統(tǒng)的作用是依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)，其理想狀態(tài)是把細(xì)胞傳送到激光束的中心。而且在特定時(shí)間內(nèi)，應(yīng)該只有一個(gè)細(xì)胞或粒子通過(guò)激光束。

因此，必須在流動(dòng)室內(nèi)把細(xì)胞注入鞘液流。流動(dòng)室是液流系統(tǒng)的核心部件，臺(tái)式機(jī)中流動(dòng)室稱為樣品槽，大型機(jī)稱之為噴嘴。在流動(dòng)室內(nèi)細(xì)胞液柱聚焦于鞘液中心，細(xì)胞在此與激光相交。

第十一頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日12FlowCellInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid第十二頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日13第十三頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日14高流速適用于定性測(cè)量，如免疫表型。樣本流變寬，細(xì)胞間距離縮短，這樣在單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)量增加，可以快速獲取數(shù)據(jù)。低流速促使樣本流變窄，單個(gè)細(xì)胞得以依次通過(guò)，這樣大多數(shù)細(xì)胞可流經(jīng)激光束的中心，細(xì)胞受激光照射的能量比較均一，因而低流速適用于檢測(cè)分辨率要求高的實(shí)驗(yàn)，如DNA分析。第十四頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日15散射光信號(hào)和熒光信號(hào)的檢測(cè)

前向角散射：前向角散射（FSC）光與被測(cè)細(xì)胞的大小和面積有關(guān)，檢測(cè)的是激光束照射方向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管軸向方向的散射光信號(hào)。FSC不受細(xì)胞熒光染色的影響，常用于免疫表型分析的信號(hào)處理。第十五頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日16ForwardAngleLightScatter前向角FALSSensorLaser第十六頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日17側(cè)向角散射：側(cè)向角散射（SSC）光與被測(cè)細(xì)胞的顆粒密度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)，對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感。SSC收集與激光束正交90度方向的散射光信號(hào)。第十七頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日1890DegreeLightScatter90度側(cè)向角FALSSensor90LSSensorLaser第十八頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日19流式細(xì)胞儀產(chǎn)生的信號(hào)非熒光信號(hào)顆粒度細(xì)胞大小第十九頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日20上述兩種信號(hào)都是來(lái)自于激光原光束，目前采用這兩個(gè)參數(shù)組合，可區(qū)分不同種類的細(xì)胞亞群，同時(shí)可獲得細(xì)胞相關(guān)的重要信息，下圖（圖3-2）為FSC和SSC組成的二維散點(diǎn)圖，從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及粒細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。第二十頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日21第二十一頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日22熒光信號(hào)熒光物質(zhì)吸收符合其波長(zhǎng)范圍的光能量，內(nèi)部電子受激上升到高能級(jí)。然后受激電子迅速衰落回基態(tài)，釋放過(guò)剩能量成為光子。這種能量的轉(zhuǎn)換稱為熒光。能夠激發(fā)熒光物質(zhì)的波長(zhǎng)范圍稱為激發(fā)光譜。因?yàn)楦嗟哪芰肯脑谖辙D(zhuǎn)換而不是熒光轉(zhuǎn)換中，所以發(fā)射光波長(zhǎng)要高于激發(fā)光波長(zhǎng)。熒光物質(zhì)的發(fā)射波長(zhǎng)范圍叫做發(fā)射光譜。第二十二頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日23目前的流式細(xì)胞儀大多采用氬離子激光器，因?yàn)?88nm的激光器能夠激發(fā)一種以上的熒光。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)愈強(qiáng)。FITC的激發(fā)光譜如圖3-3所示，488nm非常接近FITC的激發(fā)光譜的峰值，所以FITC被激發(fā)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出最強(qiáng)熒光信號(hào)，而當(dāng)FITC被其波譜范圍內(nèi)的其它波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，也會(huì)檢測(cè)到熒光，但信號(hào)強(qiáng)度不會(huì)這么高。第二十三頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日24第二十四頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日25第二十五頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日26Fluorescein(FITC)400nm600nm700nmWavelength500nmExcitationEmission第二十六頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日27Phycoerythrin(PE)400nm600nm700nmWavelengthExcitationEmission500nmFluorescentDyes第二十七頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日28EthidiumPEcis-ParinaricacidTexasRedPE-TRConj.PIFITC600nm300nm500nm700nm400nm457350514610632488CommonLaserLines第二十八頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日29第二十九頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日30對(duì)單克隆抗體進(jìn)行熒光染色，通過(guò)分析細(xì)胞表面抗原標(biāo)記確認(rèn)細(xì)胞類型。在細(xì)胞的混合群體中，我們使用不同的熒光染料區(qū)分細(xì)胞亞群。每個(gè)亞群的染色模式與FSC和SSC數(shù)據(jù)相結(jié)合，用于識(shí)別樣本中的細(xì)胞種類，并可以得到各細(xì)胞亞群的百分含量。而且，還可以對(duì)感興趣的細(xì)胞進(jìn)行再分選。第三十頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日31FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector第三十一頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日32PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersExampleChannelLayoutforLaser-basedFlowCytometryLaser1234Flowcell第三十二頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日33臺(tái)式機(jī)通常配有兩根激光器：第一根激光器波長(zhǎng)為488nm。第二根為波長(zhǎng)635nm的紅二極管固態(tài)激光器。第三十三頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日34數(shù)據(jù)分析

第三十四頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日35ImmunophenotypingCD2CD4第三十五頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日36設(shè)門通過(guò)設(shè)門的方法可以定義細(xì)胞亞群的區(qū)域。如：血樣本是混合細(xì)胞群，如果想單獨(dú)分析淋巴球細(xì)胞，可根據(jù)FSC或細(xì)胞大小，在FSC，SSC的散點(diǎn)圖中設(shè)門，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴細(xì)胞亞群的熒光特性。第三十六頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日37第三十七頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日38直方圖可直觀單個(gè)參數(shù)的細(xì)胞數(shù)量。陰性對(duì)照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右邊界。左圖中M1為陰性對(duì)照峰。右圖中M2為CD3FITC陽(yáng)性峰。

第三十八頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日39第三十九頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日40統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，整個(gè)事件共記錄了6000個(gè)細(xì)胞，門內(nèi)淋巴細(xì)胞2891個(gè)。其中M1（陰性）細(xì)胞619個(gè)，M2（CD3陽(yáng)性）細(xì)胞2272個(gè)細(xì)胞。淋巴細(xì)胞亞群CD3陽(yáng)性百分含量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：M2：2272/2891=78.59%。

第四十頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日41二維點(diǎn)圖以雙參數(shù)顯示結(jié)果，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。圖為陰性對(duì)照?qǐng)D，用于設(shè)定陰性對(duì)照邊界，全圖劃分為四個(gè)象限，以區(qū)分陰性細(xì)胞、單陽(yáng)性細(xì)胞以及雙陽(yáng)性細(xì)胞。左下象限（LL）為雙陰性細(xì)胞，左上象限（UL）為Y軸陽(yáng)性細(xì)胞（CD19PE），右下象限（LR）為X軸陽(yáng)性細(xì)胞（CD3FITC），右上象限（UR）為雙陽(yáng)性細(xì)胞（CD19+/CD3+）。第四十一頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日42如圖5-7所示，淋巴細(xì)胞亞群雙陽(yáng)性細(xì)胞（CD19+/CD3+）的百分含量為：296/2839=10.43%。第四十二頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日43分選

第四十三頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日44488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetectorPurdueUniversityCytometryLaboratories第四十四頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日45流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用

第四十五頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日461.檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群，監(jiān)測(cè)細(xì)胞免疫狀態(tài)2.白血病/淋巴瘤免疫分型3.HLA組織配型及HLA與某些疾病的關(guān)系4.干祖細(xì)胞的定量及成分分析.5.其它:血小板PAIg：粘附分子;TCR多態(tài)性檢測(cè);腫瘤癌基因及抑癌基因蛋白產(chǎn)物的檢測(cè);細(xì)胞內(nèi)酶;耐藥蛋白的分析等等。臨床常見(jiàn)應(yīng)用第四十六頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日47HLA-B27檢測(cè)

外周血HLAB27的表達(dá)及其表達(dá)程度與強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)生有很大程度的相關(guān)性.循環(huán)血中活化血小板（CD62P、CD63）：

糖尿病伴微血管病變、冠心病、高血壓病、高脂血癥、腦血栓形成、短暫性腦缺血發(fā)作、腦動(dòng)脈硬化患者活化血小板百分率和絕對(duì)值顯著高于正常人。而糖尿病無(wú)微血管病變、周圍血管病變以及深靜脈血栓形成患者活化血小板水平與正常人無(wú)顯著差異。PTCA后24小時(shí)發(fā)展成急性血管閉塞或高度再狹窄的患者活化血小板CD62p、CD63增多，可以用于預(yù)測(cè)PTCA后急性缺血再發(fā)作的危險(xiǎn)性。

第四十七頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日48微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞靈敏度:10-7第四十八頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日49細(xì)胞周期分析:在細(xì)胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各個(gè)時(shí)期，DNA的含量隨各時(shí)相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過(guò)核酸染料標(biāo)記DNA，并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的分布狀態(tài)，計(jì)算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的增殖活性。也可利用細(xì)胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行精確的分期：G0、G1、S、G2、M.DNA含量及細(xì)胞周期分析第四十九頁(yè)，共五十四頁(yè)，2022年，8月28日50G2MG0G1s0

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