瓊脂糖凝膠電泳解析課件

瓊脂糖凝膠電泳

agarosegelelectrophoresis

瓊脂糖凝膠電泳

agarosegelelectropho1一、瓊脂糖凝膠電泳的作用是什么？

＝在什么情況下我們需要做瓊脂糖凝膠電泳？

＝做瓊脂糖凝膠電泳的目的是什么？瓊脂糖凝膠電泳可以回答兩個(gè)問題㈠目標(biāo)DNA片段有沒有？㈡目標(biāo)DNA片段的濃度和純度怎樣？以下列舉一些應(yīng)用實(shí)例一、瓊脂糖凝膠電泳的作用是什么？

＝在什么情況下我們需要做瓊21當(dāng)我們需要檢測所提取的DNA時(shí)條帶的相對(duì)位置反映片段的大??；條帶的亮度反映樣品的濃度1當(dāng)我們需要檢測所提取的DNA時(shí)條帶的相對(duì)位置反映片段的大32當(dāng)我們設(shè)計(jì)了引物想擴(kuò)增某段基因序列，做完了PCR后，想要知道有沒有成功擴(kuò)增，是否需要進(jìn)一步優(yōu)化PCR條件DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)EXON1526bpEXON9487bpEXON20525bp

1234500bp750bp2當(dāng)我們設(shè)計(jì)了引物想擴(kuò)增某段基因序列，做完了PCR后，想要4

TA克隆PCR鑒定（陽性片段約500bp）07-17PCR鑒定02號(hào)標(biāo)本E9TA候選克隆LINE1克隆編號(hào)：13-24LINE2克隆編號(hào)：25-36

陽性克隆編號(hào)：02-13；02-14；02-30；02-34。

07-17PCR鑒定02號(hào)標(biāo)本E9TA候選克隆5這次電泳對(duì)我有什么價(jià)值？這次電泳對(duì)我6⑥-24⑦-1⑦-2⑦-4⑦-5⑦-6⑦-13⑦-14⑧-3⑧-4⑧-7⑧-8M①-2①-7①-8①-9①-10③-2③-5③-13⑥-13⑥-14⑥-16⑥-20M3當(dāng)你需要觀察限制性內(nèi)切酶的切割結(jié)果⑥-24⑦-1⑦-2⑦-4⑦-5⑦-674當(dāng)你需要通過切膠回收純化某個(gè)片段

12312

3

412

3

PCR擴(kuò)增S1和S2

1Marker2S2（1875bp）3S1（2172bp）2nd擴(kuò)增S1，S21S12S23DL2000S1，S2產(chǎn)物純化1，4DL20002S13S2PCR擴(kuò)增某病毒S基因4當(dāng)你需要通過切膠回收純化某個(gè)片段128二、瓊脂糖凝膠電泳的原理是什么1帶電顆粒在電場中將受到電場力的作用而發(fā)生泳動(dòng)。2電泳緩沖液中充滿了離子，因而導(dǎo)電，DNA分子在PH7~8時(shí)帶負(fù)電，因此在電場作用下向正極泳動(dòng)。3瓊脂糖凝膠中含有密集細(xì)小的孔洞，線狀的DNA分子可以通過。4DNA分子越大，阻力越大，泳動(dòng)越慢，經(jīng)過一定時(shí)間泳動(dòng)后將按大小排列成一組“條帶”。二、瓊脂糖凝膠電泳的原理是什么1帶電顆粒在電場中將受到電場9三、怎樣做瓊脂糖凝膠電泳1儀器準(zhǔn)備2制膠（需要注意的細(xì)節(jié)特別多，電泳成敗的關(guān)鍵所在）3上樣，電泳，染色4結(jié)果觀察，記錄三、怎樣做瓊脂糖凝膠電泳1儀器準(zhǔn)備10微波爐實(shí)驗(yàn)儀器微波爐用于制膠過程中，加熱使固體的瓊脂糖均勻融解在緩沖液中，成為液態(tài)的瓊脂糖凝膠，降溫后液態(tài)的凝膠凝固成固態(tài)微波爐實(shí)驗(yàn)儀器微波爐用于制膠過程中，加熱使固體的瓊脂糖均勻融11不同電泳儀及水平電泳槽不同電泳儀及水平電泳槽12水平電泳槽和梳子梳子的作用是制膠時(shí)插入膠中，以便膠凝固后產(chǎn)生加樣孔水平電泳槽和梳子梳子的作用是制膠時(shí)插入膠中，以便膠凝固后產(chǎn)生13伯樂公司（bio-rad）電泳儀伯樂公司（bio-rad）電泳儀14凝膠/電泳槽凝膠/電泳槽15紫外透射儀用于觀察DNA電泳結(jié)果或同時(shí)進(jìn)行切膠純化紫外透射儀用于觀察DNA電泳結(jié)果或同時(shí)進(jìn)行切膠純化16凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)17瓊脂糖凝膠電泳解析課件182制膠①配制5×（或10×）TBE或TAE或TPE貯存液，分別代表Tris-硼酸、Tris-乙酸、Tris-磷酸緩沖液②TBE的工作濃度一般為0.5×，電泳前將貯存液稀釋至工作濃度。配制凝膠用的TBE和電泳緩沖液應(yīng)濃度一致。③稱取合適重量的瓊脂糖，以便配制成一定濃度的凝膠。如稱取2g瓊脂糖加在100ml0.5×TBE中將制成濃度為2％的瓊脂糖凝膠。凝膠濃度越大，剛性越大，一般分辨能力也越強(qiáng)。常用的凝膠濃度在1％～2％之間，凝膠濃度太小則凝膠容易太軟而且易碎，很難操作，但有時(shí)候的確需要較小濃度的凝膠。2制膠①配制5×（或10×）TBE或TAE或TPE貯19④膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。⑤將配制好的適當(dāng)濃度的凝膠放入微波爐中融解，2分鐘左右即可，需嚴(yán)密觀察，小心操作，戴上微波爐專用手套，隨時(shí)輕輕搖動(dòng)以便瓊脂糖完全融解，均勻分布。（謹(jǐn)防燙傷）④膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好20⑥加入EB（可選）：向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg/mL。（貯存液10mg/ml）⑦倒膠：用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。⑧拔梳：待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。

瓊脂糖凝膠電泳解析課件213上樣，電泳，染色加樣：取10μLDNA樣品與2μL6×上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V（1～5v/cm），電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳。染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/mL的EB溶液中，室溫下染色20-25min。

3上樣，電泳，染色加樣：取10μLDNA樣品與2μL6224結(jié)果觀察，記錄觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。4結(jié)果觀察，記錄觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外23四常見問題分析四常見問題分析24瓊脂糖凝膠電泳解析課件25

1234123456789D14-TA克隆酶切鑒定1DL20002陽性克隆/EcoRI3假陽性克隆4T載體對(duì)照D23-TA克隆酶切鑒定1~3陽性克隆6~8陽性克隆/EcoRI4假陽性克隆（載體環(huán)化）9假陽性克隆/EcoRI5DL2000圖4S基因克隆到T載體中1226瓊脂糖凝膠電泳解析課件27PCDNA3/EcoR1酶切2，3，7，8，9，10PCD12/EcoR1酶切4,5PCD12/EcoR1酶切(酶切不全）6DL20002000bp5.1kb12345678910PCDNA3/EcoR1酶切2000bp5.1kb128瓊脂糖凝膠電泳解析課件29瓊脂糖凝膠電泳

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瓊脂糖凝膠電泳

agarosegelelectropho30一、瓊脂糖凝膠電泳的作用是什么？

＝在什么情況下我們需要做瓊脂糖凝膠電泳？

＝做瓊脂糖凝膠電泳的目的是什么？瓊脂糖凝膠電泳可以回答兩個(gè)問題㈠目標(biāo)DNA片段有沒有？㈡目標(biāo)DNA片段的濃度和純度怎樣？以下列舉一些應(yīng)用實(shí)例一、瓊脂糖凝膠電泳的作用是什么？

＝在什么情況下我們需要做瓊311當(dāng)我們需要檢測所提取的DNA時(shí)條帶的相對(duì)位置反映片段的大??；條帶的亮度反映樣品的濃度1當(dāng)我們需要檢測所提取的DNA時(shí)條帶的相對(duì)位置反映片段的大322當(dāng)我們設(shè)計(jì)了引物想擴(kuò)增某段基因序列，做完了PCR后，想要知道有沒有成功擴(kuò)增，是否需要進(jìn)一步優(yōu)化PCR條件DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)EXON1526bpEXON9487bpEXON20525bp

1234500bp750bp2當(dāng)我們設(shè)計(jì)了引物想擴(kuò)增某段基因序列，做完了PCR后，想要33

TA克隆PCR鑒定（陽性片段約500bp）07-17PCR鑒定02號(hào)標(biāo)本E9TA候選克隆LINE1克隆編號(hào)：13-24LINE2克隆編號(hào)：25-36

陽性克隆編號(hào)：02-13；02-14；02-30；02-34。

07-17PCR鑒定02號(hào)標(biāo)本E9TA候選克隆34這次電泳對(duì)我有什么價(jià)值？這次電泳對(duì)我35⑥-24⑦-1⑦-2⑦-4⑦-5⑦-6⑦-13⑦-14⑧-3⑧-4⑧-7⑧-8M①-2①-7①-8①-9①-10③-2③-5③-13⑥-13⑥-14⑥-16⑥-20M3當(dāng)你需要觀察限制性內(nèi)切酶的切割結(jié)果⑥-24⑦-1⑦-2⑦-4⑦-5⑦-6364當(dāng)你需要通過切膠回收純化某個(gè)片段

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PCR擴(kuò)增S1和S2

1Marker2S2（1875bp）3S1（2172bp）2nd擴(kuò)增S1，S21S12S23DL2000S1，S2產(chǎn)物純化1，4DL20002S13S2PCR擴(kuò)增某病毒S基因4當(dāng)你需要通過切膠回收純化某個(gè)片段1237二、瓊脂糖凝膠電泳的原理是什么1帶電顆粒在電場中將受到電場力的作用而發(fā)生泳動(dòng)。2電泳緩沖液中充滿了離子，因而導(dǎo)電，DNA分子在PH7~8時(shí)帶負(fù)電，因此在電場作用下向正極泳動(dòng)。3瓊脂糖凝膠中含有密集細(xì)小的孔洞，線狀的DNA分子可以通過。4DNA分子越大，阻力越大，泳動(dòng)越慢，經(jīng)過一定時(shí)間泳動(dòng)后將按大小排列成一組“條帶”。二、瓊脂糖凝膠電泳的原理是什么1帶電顆粒在電場中將受到電場38三、怎樣做瓊脂糖凝膠電泳1儀器準(zhǔn)備2制膠（需要注意的細(xì)節(jié)特別多，電泳成敗的關(guān)鍵所在）3上樣，電泳，染色4結(jié)果觀察，記錄三、怎樣做瓊脂糖凝膠電泳1儀器準(zhǔn)備39微波爐實(shí)驗(yàn)儀器微波爐用于制膠過程中，加熱使固體的瓊脂糖均勻融解在緩沖液中，成為液態(tài)的瓊脂糖凝膠，降溫后液態(tài)的凝膠凝固成固態(tài)微波爐實(shí)驗(yàn)儀器微波爐用于制膠過程中，加熱使固體的瓊脂糖均勻融40不同電泳儀及水平電泳槽不同電泳儀及水平電泳槽41水平電泳槽和梳子梳子的作用是制膠時(shí)插入膠中，以便膠凝固后產(chǎn)生加樣孔水平電泳槽和梳子梳子的作用是制膠時(shí)插入膠中，以便膠凝固后產(chǎn)生42伯樂公司（bio-rad）電泳儀伯樂公司（bio-rad）電泳儀43凝膠/電泳槽凝膠/電泳槽44紫外透射儀用于觀察DNA電泳結(jié)果或同時(shí)進(jìn)行切膠純化紫外透射儀用于觀察DNA電泳結(jié)果或同時(shí)進(jìn)行切膠純化45凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)46瓊脂糖凝膠電泳解析課件472制膠①配制5×（或10×）TBE或TAE或TPE貯存液，分別代表Tris-硼酸、Tris-乙酸、Tris-磷酸緩沖液②TBE的工作濃度一般為0.5×，電泳前將貯存液稀釋至工作濃度。配制凝膠用的TBE和電泳緩沖液應(yīng)濃度一致。③稱取合適重量的瓊脂糖，以便配制成一定濃度的凝膠。如稱取2g瓊脂糖加在100ml0.5×TBE中將制成濃度為2％的瓊脂糖凝膠。凝膠濃度越大，剛性越大，一般分辨能力也越強(qiáng)。常用的凝膠濃度在1％～2％之間，凝膠濃度太小則凝膠容易太軟而且易碎，很難操作，但有時(shí)候的確需要較小濃度的凝膠。2制膠①配制5×（或10×）TBE或TAE或TPE貯48④膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。⑤將配制好的適當(dāng)濃度的凝膠放入微波爐中融解，2分鐘左右即可，需嚴(yán)密觀察，小心操作，戴上微波爐專用手套，隨時(shí)輕輕搖動(dòng)以便瓊脂糖完全融解，均勻分布。（謹(jǐn)防燙傷）④膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好49⑥加入EB（可選）：向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg/mL。（貯存液10mg/ml）⑦倒膠：用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。⑧拔梳：待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。

瓊脂糖凝膠電泳解析課件503上樣，電泳，染色加樣：取10μLDNA樣品與2μL6×上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V（1～5v/cm），電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳。染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/mL的EB溶液中，室溫下染