植物組織培養(yǎng)的基本技術與設施

關于植物組織培養(yǎng)的基本技術與設施第一頁，共四十九頁，2022年，8月28日

外植體（Explants）：指植物離體培養(yǎng)的各種接種材料，包括植物體的各種器官、組織、細胞和原生質(zhì)體。一、外植體的選擇外植體的選擇依據(jù)優(yōu)良的種質(zhì)健壯的植株大小適宜的外植體適宜的發(fā)育時期適宜的部位適宜生理狀態(tài)和發(fā)育年齡的器官細胞培養(yǎng)材料的選擇第二頁，共四十九頁，2022年，8月28日

（二）外植體滅菌的一般步驟

二、外植體的滅菌（一）常用滅菌劑的使用及其效果（三）各種外植體的滅菌方法第三頁，共四十九頁，2022年，8月28日（一）常用消毒劑消毒劑使用濃度（％）去除的難易消毒時間（分）效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗菌素硝酸銀9～102飽和溶液1～210～120.1～170～754～5（mg/L）1易易易易最易較難易中較難5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好較好好自:曹孜義第四頁，共四十九頁，2022年，8月28日（二）外植體滅菌的一般步驟3.將適當濃度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸鈉)(含有幾滴活化劑Tween20或Tween80)，使材料完全浸沒在消毒液中，蓋上蓋，把玻璃瓶置入超凈工作臺滅菌一定時間。在滅菌期間須把玻璃瓶搖動2～3次。

4．消毒處理后，將瓶蓋打開，將消毒液倒出，注入適量的無菌蒸餾水，再蓋上蓋，搖動數(shù)次，將水倒掉，重復3～4次。1．預處理，先對植物組織進行修整，去掉不需要的部分，將準備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。經(jīng)過預處理的植物材料，其表面仍有很多細菌和真菌。

2．將植物組織塊置于一個有絲蓋的玻璃瓶中，注入75%的酒精溶液埋沒材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用無菌水沖洗一次。第五頁，共四十九頁，2022年，8月28日

1、莖尖、莖段及葉片等的消毒消毒前要經(jīng)自來水較長時間的沖洗。消毒時要用70%的酒精浸泡數(shù)秒，無菌水沖洗2～3次，然后用2%～10%的次氯酸鈉溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中加入幾滴吐溫-80，或者用0.1％～0.2％升汞浸泡消毒5～10分鐘消毒后，用無菌水沖洗3次后方可接種。2、果實及種子的消毒用自來水沖洗10～20分鐘或更長，用純酒精迅速漂洗一下。果實用2%次氯酸鈉溶液浸10min后，用無菌水沖洗2～3次。種子要先用10%次氯酸鈉浸泡20～30min甚至幾小時。對難以消毒的還可用0.l%升汞或1%～2%溴水消毒5min。胚或胚乳培養(yǎng)時，對種皮太硬的種子，可先去掉種皮，再用4%～10%的次氯酸鈉溶液浸泡8～10min，經(jīng)無菌水沖洗后，即可取出接種。（三）幾種外植體的滅菌方法第六頁，共四十九頁，2022年，8月28日

70％酒精擦洗花蕾，或浸泡數(shù)秒鐘飽和漂白粉上清液：浸泡10分鐘；或次氯酸鈉液2％～5％：8～10分鐘無菌水沖洗幾次后，吸去水分，剝?nèi)』ㄋ幓蚺咧榻臃N。3、花藥的消毒第七頁，共四十九頁，2022年，8月28日

預先用自來水洗滌，再用軟毛刷刷洗，且用刀切去損傷及污染嚴重部位，吸水紙吸干后，再用酒精漂洗?？刹捎?.1%～0.2%升汞浸5～10min或2%次氯酸鈉溶液浸10～15min，然后以無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干后可接種。

4、根及地下部器官的消毒第八頁，共四十九頁，2022年，8月28日

三、外植體的接種和培養(yǎng)

（一）無菌操作（二）外植體的培養(yǎng)第九頁，共四十九頁，2022年，8月28日

植物組織培養(yǎng)的接種：把經(jīng)過表面消毒后的植物材料切碎或分離出器官、組織細胞，并把它們轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程，是一種無菌技術。在操作過程中引起的污染來源：主要是由材料本身帶菌和工作人員本身引起的。

（一）無菌操作第十頁，共四十九頁，2022年，8月28日

污染的主要來源是空氣中的細菌和真菌孢子每次接種前半小時地面：用70％酒精噴霧使空氣的灰塵沉降。紫外線燈照射20分鐘。工作臺面要用新潔爾滅或酒精擦洗。

1、接種室的消毒第十一頁，共四十九頁，2022年，8月28日

入無菌室前，要洗手。l%新潔爾滅溶液內(nèi)5分鐘入室時要穿上經(jīng)過消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要經(jīng)常用酒精擦洗手。不準講話，以免微生物污染材料、培養(yǎng)基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。必須在酒精燈火焰處進行操作，如打開瓶口，轉(zhuǎn)接材料。蓋瓶蓋前應將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上燒一下，然后蓋上。2、工作人員要求第十二頁，共四十九頁，2022年，8月28日

切取和接種較大的材料肉眼觀察即可操作分離，較小的材料需在雙筒解剖鏡下操作。分離工具一定要放好，切割動作要快，防止擠壓使材料損傷而失敗。

接種時要防止交叉污染的發(fā)生3、材料的切取第十三頁，共四十九頁，2022年，8月28日酒精擦拭手外植體消毒浸泡5min器械消毒酒精燈灼燒4、接種的具體操作第十四頁，共四十九頁，2022年，8月28日旋轉(zhuǎn)灼燒取外植體接種蓋好瓶塞第十五頁，共四十九頁，2022年，8月28日

1、培養(yǎng)條件：

溫度：常保持在23±2℃，夜溫低1—2℃

光照時數(shù)：大多數(shù)情況下為16h（暗培養(yǎng)不需要光照，例如起始培養(yǎng)的前幾天不需要光照）

光照強度：1000—3000lx，白色熒光燈，光的作用是滿足形態(tài)建成的需要（誘導）

相對濕度：培養(yǎng)室的相對濕度一般不控制。根據(jù)需要適當調(diào)整培養(yǎng)間濕度（二）外植體培養(yǎng)第十六頁，共四十九頁，2022年，8月28日

接種后3～7天內(nèi)，主要是檢查其污染情況。增殖、繼代培養(yǎng)，建立了無菌培養(yǎng)系。細胞學觀察：一般每隔3～5天觀察一次。及時記錄。觀察方法根據(jù)培養(yǎng)方式靈活掌握：可用顯微鏡進行定點觀察如平板培養(yǎng)可用倒置顯微鏡觀察如液體培養(yǎng)2、定期檢查和細胞學觀察第十七頁，共四十九頁，2022年，8月28日

1．外植體先形成愈傷組織，再分化成完整的植株。四、外植體的成苗途徑2．胚狀體發(fā)生3．外植體經(jīng)誘導后直接形成根與芽，發(fā)育成完整的植株4．原球莖型---圖片第十八頁，共四十九頁，2022年，8月28日石斛蘭的原球莖第十九頁，共四十九頁，2022年，8月28日外植體愈傷組織

根、芽芽根根芽胚狀體根、芽試管苗外植體的成苗途徑第二十頁，共四十九頁，2022年，8月28日

不定芽形成---多細胞參與胚狀體形成過程--單細胞參與體細胞胚的發(fā)育過程第二十一頁，共四十九頁，2022年，8月28日

低CTK/IAA外植體愈傷組織芽根脫分化再分化低CTK/IAA根

完整植株生長調(diào)節(jié)物質(zhì)控制器官分化的模式芽高CTK/IAA低CTK/IAA第二十二頁，共四十九頁，2022年，8月28日五、污染的原因及其預防措施

污染

概念：是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。原因：細菌菌斑呈黏液狀物。除材料帶菌或培養(yǎng)基滅菌不徹底會造成成批接種材料被細菌污染外，操作人員的不慎也是造成細菌污染的重要原因。因此接種人員的手應經(jīng)常用70％酒精擦凈，鑷子和接種針在使用前必須在火焰上燒紅。真菌污染部分長有不同顏色的霉菌，在接種后3～10d才能發(fā)現(xiàn)，造成真菌污染的原因多為周圍環(huán)境的不清潔、超凈工作臺的過濾裝置失效、培養(yǎng)瓶的口徑過大、操作不慎等途徑：

外植體帶菌；培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底；操作人員未遵守操作規(guī)程等。第二十三頁，共四十九頁，2022年，8月28日

防止材料帶菌的措施

用莖尖作外植體時，可在室內(nèi)或無菌條件下對枝條先進行預培養(yǎng)。避免陰雨天在田間采取外植體。對于材料內(nèi)部污染的材料采取特殊方法。

外植體的滅菌

多次滅菌法多種藥液交替浸泡法金屬器械的滅菌一般用火焰滅菌法，即把金屬器械放在95％的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。這一步驟應當在無菌操作過程中反復進行。金屬器械也可以用干熱滅菌法滅菌，即將拭凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。布質(zhì)制品的滅菌:工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的布質(zhì)品，放入高壓滅菌器中，在壓力為108kPa，溫度為121℃的情況下，滅菌20～30min無菌操作室的滅菌:

無菌操作室的地面、墻壁和工作臺的滅菌可用2％的新潔爾滅或70％的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20min。使用前用70％的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。操作人員

污染的預防措施第二十四頁，共四十九頁，2022年，8月28日六、外植體的褐變及其防止措施

（一）褐變的原因

1.基因型

2.外植體的生理狀態(tài)

3.培養(yǎng)基的成分無機鹽濃度；植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)；外植體脫分化條件；轉(zhuǎn)移時間過長。

（二）褐變的防止措施

1.選擇適宜的外植體2.最佳培養(yǎng)基3.連續(xù)轉(zhuǎn)移

4.加抗氧化劑5.活性炭

第二十五頁，共四十九頁，2022年，8月28日七、培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預防措施

（一）玻璃化現(xiàn)象葉、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小腫脹，失綠，葉片皺縮成縱向卷曲，脆弱易碎；葉表皮缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織；體內(nèi)含水量高，但干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素含量低。第二十六頁，共四十九頁，2022年，8月28日

激素濃度激素濃度增加尤其是細胞分裂素濃度提高（或細胞分裂素與生長素比例高)。瓊脂濃度瓊脂濃度低時玻璃化苗比例增加，水浸狀嚴重。溫度：適宜的溫度可以使試管苗生長良好。光照時間多數(shù)植物在10～12h光照下都生長良好，大于15h時，玻璃化苗明顯增加。通風條件愈傷組織和試管苗生長越快，越容易形成玻璃化苗。愈傷組織和試管苗長時間培養(yǎng)，不能及時轉(zhuǎn)移，容易出現(xiàn)玻璃化苗。組織培養(yǎng)所用瓶蓋棉塞、濾紙、封口紙、牛皮紙通氣較好，玻璃化苗的比例較低。離子水平培養(yǎng)基中離子種類及其比例不適宜該種植物，玻璃化苗的比例就會增加。

（二）產(chǎn)生玻璃化苗的因素第二十七頁，共四十九頁，2022年，8月28日

適當控制培養(yǎng)基中無機營養(yǎng)成分；適當提高培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度；適當降低細胞分裂素和赤霉素的濃度；增加自然光照，控制光照時間；控制好溫度；改善培養(yǎng)器皿的氣體交換狀況在培養(yǎng)基中添加其他物質(zhì)，加入間苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地減輕或防治試管苗玻璃化。如添加馬鈴薯汁液法可降低油菜玻璃苗的產(chǎn)生頻率；0.5mg／L多效唑或10mg／L的矮壯素可減少重瓣絲石竹試管苗玻璃化的發(fā)生；1.5～2.5g/L的聚乙烯醇防治蘋果砧木玻璃化。加入0.3％的活性炭還可降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率。（三）預防措施第二十八頁，共四十九頁，2022年，8月28日

試管苗的特點試管苗的馴化試管苗的移栽提高試管苗移栽成活率的途徑

八、試管苗的馴化與移栽第二十九頁，共四十九頁，2022年，8月28日（一）、試管苗的特點

試管苗的生態(tài)環(huán)境高溫且恒溫；高濕；弱光；無菌。試管苗的特點

試管苗生長細弱，莖、葉表面角質(zhì)層不發(fā)達；試管苗莖、葉雖呈綠色，但葉綠體的光合作用較差；試管苗的葉片氣孔數(shù)目少，活性差；試管苗根的吸收功能弱。

試管苗和普通苗的根解剖比較藍莓第三十頁，共四十九頁，2022年，8月28日（二）、試管苗的馴化

馴化的目的:在于提高試管苗對外界環(huán)境條件的適應性，提高其光合作用的能力，促使試管苗健壯，最終達到提高試管苗的移栽成活率。馴化的原則：應從溫度、濕度、光照及有無菌態(tài)等環(huán)境要素進行，馴化開始數(shù)天內(nèi)，應和培養(yǎng)時的環(huán)境條件相似；馴化后期，則要與預計的栽培條件相似，從而達到逐步適應的目的。馴化的方法:煉苗由培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到半遮蔭的自然光下鍛煉，在自然光下恢復植物體內(nèi)葉綠體的光合作用能力和健壯度打開瓶蓋注入少量自來水使幼苗逐漸降低溫度，轉(zhuǎn)向有菌，這樣幼苗周圍的環(huán)境就會逐步與自然環(huán)境相似。

第三十一頁，共四十九頁，2022年，8月28日

試管苗的馴化第三十二頁，共四十九頁，2022年，8月28日（三）、試管苗的移栽

常規(guī)移栽法直接移栽法嫁接移栽法指選取生長良好的同一植物的實生苗或幼苗作砧木，用試管苗作接穗進行嫁接的方法。第三十三頁，共四十九頁，2022年，8月28日（四）、提高試管苗移栽成活率的途徑

試管苗的生理狀況植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)無機鹽濃度活性炭環(huán)境因子移栽過程中試管苗從無菌向有菌逐漸過渡第三十四頁，共四十九頁，2022年，8月28日

1．進行植物組織培養(yǎng)需要哪些設備？各有何作用?2．植物組織培養(yǎng)主要包括哪些環(huán)節(jié)?各環(huán)節(jié)的主要工作內(nèi)容是什么?3．培養(yǎng)基包括哪些基本成分?其作用是什么?如何配制?4．如何對外植體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿、接種器械進行滅菌？

5．離體培