輔助生殖技術(shù)與妊娠

輔助生殖技術(shù)與妊娠近20年來，輔助生殖技術(shù)(assistedreproductivetechniques,ART)發(fā)展迅速，使不孕癥的治療不斷革新。但經(jīng)ART治療獲得的妊娠結(jié)果不同于自然妊娠，故也給圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)帶來新的內(nèi)容，如經(jīng)ART妊娠者的流產(chǎn)率、異位妊娠率較高，多胎妊娠明顯增加，孕婦易發(fā)生妊娠期并發(fā)癥，圍生期胎、嬰兒發(fā)病率及死亡率升高。本章重點(diǎn)概述ART進(jìn)展，以及經(jīng)ART妊娠的孕產(chǎn)期并發(fā)癥及其處理。第一節(jié)輔助生殖技術(shù)概述輔助生殖技術(shù)廣義的包括各種幫助不孕患者妊娠的技術(shù)，而狹義的只包括對(duì)卵子進(jìn)行操作的技術(shù)。本節(jié)主要概述對(duì)卵子進(jìn)行操作的ART。一、體外受精與胚胎移植體外受精與胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer，IVF-ET)是不依賴于外科輸卵管手術(shù)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，是現(xiàn)代人類新的助孕措施中最基本的技術(shù)，涉及生殖內(nèi)分泌、胚胎、遺傳等多個(gè)基礎(chǔ)學(xué)科。經(jīng)IVF—ET出生的嬰兒即所謂試管嬰兒。1978年世界第一例試管嬰兒在英國誕生，從此，此項(xiàng)助孕技術(shù)在世界范圍內(nèi)迅速發(fā)展。我國大陸首例試管嬰兒于1988年在北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院誕生，隨后，不斷有試管嬰兒相繼在不同地區(qū)出生。目前，全世界采用IVF—ET出生的嬰兒已有數(shù)萬例。適應(yīng)證輸卵管性不孕如雙側(cè)輸卵管梗阻、切除或嚴(yán)重盆腔粘連使輸卵管喪失正常功能，是最主要的適應(yīng)證。子宮內(nèi)膜異位癥經(jīng)治療長期不孕者。男性輕一中度少精、弱精癥。免疫性不孕。原因不明性不孕。(二).主要工作程序1.控制的超促排卵 世界首例試管嬰兒是采用自然周期獲取卵母細(xì)胞進(jìn)行IVF—ET。其優(yōu)點(diǎn)是不影響機(jī)體內(nèi)分泌環(huán)境，無卵巢過度刺激及多胎妊娠的危險(xiǎn)，節(jié)約經(jīng)費(fèi)。但由于僅有一個(gè)成熟卵泡，且常出現(xiàn)取卵失敗，妊娠率較低。故目前多采用控制的超促排卵(controlledovarianstimulation，COH)，以獲得多個(gè)成熟卵母細(xì)胞，提高妊娠率。超促排卵常用藥物：①克羅米酚(Cc):通常與其它藥物合用。②促性腺激素(GnH)：包括卵泡刺激素(FSH)，每支含F(xiàn)SH75IU，LH<l%；人絕經(jīng)期促性腺激素(hMG)，每支含F(xiàn)SH及LH各75IU；高純度卵泡刺激素(FSH—HP)，每支含F(xiàn)SH75IU，LH<O.1%。上述三種GnH均從尿液中提取。最近有完全不含LH的重組人卵泡刺激素(r—hFSH)。這些GnH刺激卵泡生長、發(fā)育及成熟。③人絨毛膜促性腺激素(hCG)：促使卵泡的最后成熟及排卵。④促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH—a)：有多種制劑，常用的有Buserelin、丙氨瑞林(現(xiàn)名：阿拉瑞林)。近來促性腺激素釋放激素拮抗劑也開始在臨床使用。這類藥物可使垂體降調(diào)節(jié)，防止內(nèi)源性過早的LH峰，改善卵泡發(fā)育的同步化。⑤生長激素(GH)：GH與GnH合用可增強(qiáng)卵巢的反應(yīng)性，減少GnH的用量。超促排卵方案：20年來隨著ART的發(fā)展，COH方案不斷改進(jìn)，常用的方案如下：CC/FSH、hMG/hCG：于月經(jīng)周期第2。3日開始每日服CC100rag，連用5日。第5?6日開始肌注FSH或hMG2支/日，至卵泡成熟時(shí)，停用FSH或hMG，約36小時(shí)后肌注hCG5000一100001u。FSH、hMG/hCG:于月經(jīng)周期第3—5日開始肌注FSH或hMG2—3支/日，根據(jù)卵泡生長速度調(diào)整劑量，至卵泡成熟時(shí)肌注hCG5000—100001U。GnRH—a/Gn/hCG：此方案是目前國內(nèi)外公認(rèn)效果較好的COH方案。通常于前一個(gè)月經(jīng)周期的第21日左右開始用Buserelin鼻噴，每次0.3rag，每日3次，或每日肌注阿拉瑞林150/.tg，直至注射hCG日停止。月經(jīng)來潮第3—5日開始用GnH，目前較多使用FSH及FSH—HP。現(xiàn)r—hFSH的應(yīng)用也日益增多，有報(bào)道r—hFSH的效果優(yōu)于其它種類的GnH，且所需總劑量減少。GnH用量一般每日2.3支，年齡＞40歲或卵巢反應(yīng)不良者可每日4—6支，也可同時(shí)加用GH2IU，隔日一次。卵泡成熟時(shí)停用GnRH—a及GnH，肌注hCG5000—10000IU。各種超促排卵方案均為模擬人體生理狀態(tài)而設(shè)計(jì)的。因個(gè)體的體質(zhì)、年齡及對(duì)藥物敏感性存在差異，各類藥物作用也有差異，故可根據(jù)不同的情況，對(duì)超促排卵方案的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行適當(dāng)或必要的調(diào)整。監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育：現(xiàn)大多數(shù)生殖中心主要依靠陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況。從刺激周期第8日開始，每2—3日監(jiān)測(cè)一次，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑＞14mm時(shí)每日一次。并每8—12小時(shí)測(cè)尿LH1次，以發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性過早LH峰。同時(shí)動(dòng)態(tài)觀察血清雌二醇水平。適時(shí)注射hCG：當(dāng)2個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑^16—18mm時(shí)，停用GnRH—a及GH，肌注hCG5000?10000IU，啟動(dòng)卵細(xì)胞最后成熟及黃體形成。注射hCG后36小時(shí)取卵。2?取卵現(xiàn)普遍采用陰道B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穹窿，用16G穿刺針抽吸所有卵泡。在解剖顯微鏡下自卵泡液中找出卵細(xì)胞，移入培養(yǎng)液中，立即置入5%CO，、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 ’3?精液處理目的是除去精液中的有害成分，收集活動(dòng)力良好的精子，使精子獲能，改善精子受精能力。于取卵日上午，男方用手淫法留取精液，室溫液化后，用上游法或PereoU梯度離心法處理精液。4?體外授精與培養(yǎng)卵細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)3—6小時(shí)后，于每個(gè)卵細(xì)胞培養(yǎng)滴內(nèi)加入5?10萬個(gè)已處理過的活精子。共同培養(yǎng)l一2小時(shí)后，用培養(yǎng)液洗滌卵細(xì)胞，去除多余精子，將卵細(xì)胞及其周圍的少量顆粒細(xì)胞移入新的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。研究表明(Dirnfeld，1999)精一卵共同培養(yǎng)l小時(shí)與傳統(tǒng)的培養(yǎng)16-20小時(shí)比較，受精率(56%與6l%)及卵裂率(96%與92%)無明顯區(qū)別，但短時(shí)間培養(yǎng)組的胚胎質(zhì)量明顯提高，種植率及妊娠率明顯增加(種植率分別為16%及10%;每移植周期妊娠率分別為42.4%及26%)。這是由于精一卵短時(shí)間共同培養(yǎng)可避免或減少大量精子的代謝產(chǎn)物對(duì)卵細(xì)胞的不良影響。授精16-20小時(shí)后，拆除卵細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞，觀察受精情況。更換培養(yǎng)液再培養(yǎng)24小時(shí)，觀察卵裂情況，此時(shí)多為2-4細(xì)胞分裂球。5.胚胎移植將早期胚胎3—4個(gè)通過移植管送人母體子宮腔內(nèi)距宮底0.5cm傳統(tǒng)的移植時(shí)間大多在取卵后48小時(shí)，但妊娠率較低，約為20%左右。近年展了囊胚期胚胎培養(yǎng)技術(shù)，移植時(shí)間可延長至取卵后3-6日進(jìn)行。為避免多娠，現(xiàn)多主張移植2—3個(gè)胚胎。6?移植后處理胚胎移植后一般臥床休息6小時(shí)；用hCG或孕酮支持黃體功移植后14日測(cè)尿hCG，若為陽性，2—3周后行B超檢查，以進(jìn)一步確診妊娠(三)IVF—El新技術(shù)1?凍融胚胎移植在IVF—ET治療中，廣泛使用GnH進(jìn)行COH，一個(gè)周期可獲得多個(gè)卵細(xì)胞，受精后發(fā)育成的早期胚胎常多于一次移植所需的胚胎數(shù)，可將這部分剩余的胚胎冷凍保存，供再次移植，增加一次取卵的妊娠機(jī)會(huì)，減少患者的痛苦及花費(fèi)。此外，凍融胚胎移植還可用于：①對(duì)有可能發(fā)生嚴(yán)重卵巢過度刺激綜合征的患者，在IVF治療周期不移植，將胚胎冷凍保存，在以后的自然周期移植；②治療周期子宮內(nèi)膜生長發(fā)育不良；③本次胚胎移植時(shí)移植管插入宮腔非常困難；④胚胎活檢后需等待診斷結(jié)果，或需排除供配子者人類免疫缺陷病毒(HIV)感染。胚胎冷凍可在原核期、卵裂早期(2—8細(xì)胞階段)或囊胚期進(jìn)行。常用的凍融方法有慢速冷凍和快速復(fù)溫法、超快速凍融法、玻璃化法及囊胚凍融法。經(jīng)凍融過程后，胚胎的存活率有所下降。贈(zèng)卵體外受精與胚胎移植接受贈(zèng)卵的指征：①卵巢無功能，包括卵巢功能早衰，性腺發(fā)育不全，卵巢切除或化療、放療導(dǎo)致卵巢功能衰竭等；②女方染色體異常；③反復(fù)體外受精失敗，而非男性因素所致。供卵者的條件：年齡小于35歲，家譜正常，生理特征盡可能與受者相似，排除精神疾病及傳染病。有正常生育史，自愿供卵。方法：將供者的卵子與受者丈夫精子在體外受精，發(fā)育為早期胚胎后，移植至受者的宮腔內(nèi)。妊娠成功的關(guān)鍵除IVF—ET技術(shù)外，尚需使供卵者與受者子宮內(nèi)膜達(dá)到同步化。通常使用雌、孕激素使受者內(nèi)膜發(fā)育，適合胚胎著床，妊娠后仍應(yīng)繼續(xù)使用，直至胎盤功能建立。對(duì)有正常排卵的受者，胚胎移植可在自然周期進(jìn)行。人們發(fā)現(xiàn)激素替代周期的妊娠率高于自然周期和常規(guī)IVF周期?？赡芤?yàn)榧に靥娲委熀蟾纳屏俗訉m內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受性。代孕母親患者卵巢功能正常，但由于子宮因病變已切除，或子宮內(nèi)膜受損不能妊娠，需由他人代孕。方法為：將患者夫婦的精子和卵子經(jīng)體外受精，培養(yǎng)發(fā)育成早期胚胎，移植至代孕者的子宮內(nèi)著床、生長發(fā)育成胎兒。此項(xiàng)技術(shù)因涉及倫理及法律等問題，在施行時(shí)指征必須嚴(yán)格，并需簽署一定的法律手續(xù)。二、從體外受精與胚胎移植派生的技術(shù)這些技術(shù)也都包括了超促排卵、取卵及體外處理精液等步驟。配子輸卵管內(nèi)移植配子輸卵管內(nèi)移植(gameteintrafallopiantransfer，GIFT)是直接將取出的卵子和處理后的精子移植到輸卵管壺腹部，使精子、卵細(xì)胞在輸卵管內(nèi)受精，進(jìn)入宮腔著床。此技術(shù)無需體外受精及培養(yǎng)過程，故較常規(guī)IVF—ET簡(jiǎn)單，且更接近生理，妊娠率略高于IVF—ET。但必需的條件是至少有一側(cè)輸卵管形態(tài)及功能正常，其它適應(yīng)證與IVF相同。通常將配子經(jīng)腹腔鏡從輸卵管傘端注入輸卵管壺腹部。近來移植技術(shù)又有改進(jìn)，可在B超引導(dǎo)下經(jīng)官腔輸卵管插管行配子移植，并取得成功妊娠。目前大多數(shù)中心限制移植卵母細(xì)胞數(shù)為3個(gè)，年齡較大或以往反復(fù)失敗的婦女可移植4個(gè)或4個(gè)以上卵母細(xì)胞。有些研究者將GIFT與IVF—ET聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)GIFT后剩余的卵子進(jìn)行體外受精。在發(fā)育到4-6個(gè)分裂球時(shí)（約在行GITF后48小時(shí)），再行官腔內(nèi)胚胎移植。妊娠率高于單純行GIFT。（二）配子宮腔內(nèi)移植配子宮腔內(nèi)移植（gameteintrauterinetransfer,GluT）是將配子（卵子和精子）直接移植入官腔內(nèi)，使其在官腔內(nèi)受精、著床。適應(yīng)證同IVF—ET。一般移植5.6個(gè)卵細(xì)胞，妊娠率較IVF—ET及GIFT為低，約為16.4%。但此技術(shù)操作更簡(jiǎn)單易行。㈢配子腹腔內(nèi)移植配子腹腔內(nèi)移植（peritonealoocyteandspermtransferPOST）是將處理后的精子與4個(gè)卵子經(jīng)陰道穿刺針引導(dǎo)放入輸卵管傘部及卵巢旁，適用于非輸卵管因素的小咧原因不孕。 ^（四）合子輸卵管內(nèi)移植和胚胎輸卵管內(nèi)移植合子輸卵管內(nèi)移植（zygoteintrafallopiantransfer，ZIFT）或稱原核期移植：?ronucleistagetransfer，PROST），其指征和條件同GIFT，方法也相似，但要行體竺芋精，培養(yǎng)至原核階段，將受精卵注入輸卵管壺腹部，其優(yōu)點(diǎn)是保證移植的是受精卵。.胚胎輸卵管內(nèi)移植（tubalembryotransfer，TET），技術(shù)操作基本同ZIFT，所不同的是將受精卵在體外培養(yǎng)至胚胎階段再移入輸卵管內(nèi)。、 三、顯微授精對(duì)嚴(yán)重男性因素及部分不明原因不孕癥的治療，常規(guī)IVF技術(shù)已不能完全滿足臨床需要，從而發(fā)展了顯微授精技術(shù)。自1988年顯微授精技術(shù)開始應(yīng)用于人類助孕，至1992年獲得突破性進(jìn)展。（一）顯微授精的方法透明帶部分切除透明帶部分切除（partialzonaldissecti。。，PZD）是初期應(yīng)用的有利于受精的方法。用機(jī)械法或激光在透明帶部位鉆孔，然后加入處理的精三：使精子自行進(jìn)入卵細(xì)胞內(nèi)。1988年獲首例妊娠。但PZD的單精受精率及妊娠率低（分別為16.8%和3.8%），且多精受精率高。2?透明帶下顯微授精.透明帶下顯微授精（subzonalinsemination，SUZI）是將5?10個(gè)精子注入透明帶下，使卵子受精。1990年在英國誕生首例采用SUZI獲得的試管嬰兒。此法的單精受精率為17.7%，妊娠率10.3%。由于單精受精率低，多精受精難以控制，妊娠率低，且需要精子數(shù)目＞5XlO?/ml，目前臨床上已基本不采用PZD及SUZI技術(shù)。3.卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射（intracytoplasmicsperminjection，ICSI）系將單個(gè)精子直接注入卵母細(xì)胞漿內(nèi)f使其受精。其受精結(jié)果不受精子濃度、活動(dòng)度和形態(tài)的影響，正常受精率及妊娠率明顯高于PZD…麥SUZI。ICSI的受精率可達(dá)70%，每移植周期妊娠率達(dá)30%，故目前普遍采用ICSI。世界首例ICSI嬰兒于1992年在比利時(shí)誕生，我國首例ICSI嬰兒1996年誕生于中山醫(yī)科大學(xué)。 ’（二）ICSI的適應(yīng)證l?嚴(yán)重少精、弱精癥一次射精的精子濃度＜2X106/ml或前向運(yùn)動(dòng)的精子2?輸精管阻塞或缺如所致無精癥可用附睪抽吸術(shù)或睪丸活檢獲得精子。3.多次IVF—ET周期卵子不受精或受精率低下（＜20%）者。.ICSI的主要禁忌證為染色體異?；驀?yán)重先天畸形患者。（三）IQSl的步驟 - ’ 。ICSI與IVF根本的區(qū)別在于授精過程不同，也需超促排卵、取卵，體外培養(yǎng)及胚胎移植。取卵后2小時(shí)，拆除卵母維胞周圍的顆粒細(xì)胞，挑選分裂中期II期卵母細(xì)胞進(jìn)行單精子注射。獲取精子的方法有手淫法、附睪穿刺抽吸取精術(shù)及睪丸活檢取得的曲細(xì)精管分離精子。將注入精子的卵母細(xì)胞放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。以后的步驟同IVFOICSI技術(shù)的關(guān)鍵是①操作使用標(biāo)準(zhǔn)的尖而平滑的注射針;②精子在準(zhǔn)備注射前必須制動(dòng)；③將精子注入卵漿前必須抽吸少量卵漿，促進(jìn)鈣離子流人，激活卵母細(xì)胞。 ， .：ICSI受精是對(duì)傳統(tǒng)受精生理過程的挑戰(zhàn)，.周精子被直接注入卵母細(xì)胞內(nèi)，無需自動(dòng)穿越透明帶及發(fā)生頂體反應(yīng)。卵母細(xì)胞的激活過程是由于顯微注射操作穿刺卵細(xì)胞膜及抽吸卵漿引發(fā)鈣離子的釋放，以及制魂精子引起部分精子膜的損傷，增加膜的通透性，而有助于受精。為使卵母細(xì)胞與精子處在相同的細(xì)胞分裂周期，進(jìn)行注射的卵母細(xì)胞必須處于分裂中期II期。ICSI所采用盼精予可，以是新鮮精子或凍融精子；可來自附睪或睪丸；甚至采用精細(xì)胞，均可獲得受精及妊娠。因此，目前ICSI技術(shù)成為生殖醫(yī)學(xué)研究的新里程碑。最近，Dale等（1999）報(bào)道了一種新的方法，在完成卵漿內(nèi)注射精子后1小時(shí)，即將被激活的卵母細(xì)胞移植入官腔。共治療19偽患者，；18例行移植，移植卵母細(xì)胞數(shù)1—5個(gè)（平均3.6士1.5），獲5例繼續(xù)妊娠?種植率為11%，.妊娠率28%，與傳統(tǒng)的IVF及ICSI的妊娠率相同。四、輔助生殖技術(shù)新進(jìn)展（一）囊胚期胚胎培養(yǎng)技術(shù) ’，’常規(guī)IVF—ET最令人關(guān)注的問題是如何提高種植率及妊娠率。在傳統(tǒng)的取卵后48小時(shí)進(jìn)行胚胎移植中，盡管受精率與卵裂率可達(dá)q0%.80%，但種植率僅5%—15%，每治療周期的妊娠率為7%—26%。其根本原因是體外培養(yǎng)環(huán)境未能克服人類胚胎8細(xì)胞期的發(fā)育停滯，以致不能達(dá)到近似生理的囊胚植入。近年來發(fā)展了囊胚期胚胎培養(yǎng)技術(shù)，主要包括共同培養(yǎng)及序貫培養(yǎng)。通過此技術(shù)獲得有生命的囊胚，囊胚期胚胎移植不僅可提高妊娠率，還可減少移植數(shù)目，從而減少多胎妊娠的危險(xiǎn)。 -.共同培養(yǎng)將胚胎與體細(xì)胞（又稱輔助細(xì)胞）一起培養(yǎng)稱共同培養(yǎng)（Co—Culture）。這些體細(xì)胞在共同培養(yǎng)中可釋放特異性胚胎營養(yǎng)因子。如多種生長因子及各種糖蛋白；分泌抗氧化劑?；撬?，同時(shí)減少培養(yǎng)液中對(duì)胚胎有害的成分，如自由基和氨，控制代謝物質(zhì)的變化，穩(wěn)定pH、02及02/C02比值。而且胚胎細(xì)胞與輔助細(xì)胞之間進(jìn)行著生物信息傳遞；有利于胚胎發(fā)育。目前使用的輔助細(xì)胞大多是人輸卵管上皮細(xì)胞，將胚胎置于輸卵管上皮細(xì)胞層上共同培養(yǎng)，類似在體外的人造輸卵管內(nèi)生長，可促進(jìn)囊胚發(fā)育，提高著床率。有報(bào)道在這樣的共同培養(yǎng)條件下，囊胚形成率為60%—65%，妊娠率達(dá)44%。50%，特別可提高常規(guī)IVF—ET反復(fù)失敗者的妊娠率。 ?共同培養(yǎng)存在的問題是機(jī)制尚未闡明，其有效性仍有待進(jìn)一步證實(shí)。其中最大的困難是如何避免長時(shí)間體外培養(yǎng)可能產(chǎn)生的霉菌、細(xì)菌或病毒對(duì)胚胎的污染。序貫培養(yǎng)胚胎從受精卵發(fā)育到囊胚期將發(fā)生一系列生理及代謝的變化，不同時(shí)期所需營養(yǎng)物質(zhì)不同。早期胚胎在基因組轉(zhuǎn)錄激活前需要穩(wěn)定的pi-I與滲透壓，培養(yǎng)液成分簡(jiǎn)單，主要包括非必需氨基酸、谷氨酸胺、低濃度糖及磷酸。而基因組轉(zhuǎn)錄激活后，其卵裂球發(fā)育至有類似體細(xì)胞的生理功能時(shí)則需要各種營養(yǎng)物質(zhì)，如必需氨基酸，檸檬酸及各種脂類等，以保證胚胎合成足夠的蛋白質(zhì)，避免胚胎發(fā)育停滯，促進(jìn)囊胚形成。在無需共同培養(yǎng)的條件下，于胚胎不同時(shí)期使用不同的培養(yǎng)液序貫培養(yǎng)，囊胚形成率可達(dá)66%，種植率45.5%、，妊娠率達(dá)63%。即使在取卵后72小時(shí)進(jìn)行胚胎移植，種植率亦可達(dá)21%，妊娠率達(dá)47%(Gardnero1998)。序貫培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)室操作比共同培養(yǎng)簡(jiǎn)單，、但仍需克服隨體外培養(yǎng)時(shí)間延長染色體退化等問題。輔助孵出由于培養(yǎng)條件改善和授精技術(shù)的發(fā)展，人類IVF已達(dá)封比較理想的結(jié)果，但妊娠率至今仍不令人滿意。其可能的原因之一是體外培養(yǎng)條件影響了透明帶正常演變過程，使胚胎透明帶變硬。許多胚胎即使發(fā)育到囊胚擴(kuò)張階段，也無法從透明帶中孵出，因而無法種植，或延遲孵出錯(cuò)過了子宮內(nèi)膜容許胚胎種植的時(shí)機(jī)，以致著床失敗。在胚胎移植前，用不同的方法使胚胎透明帶形成一個(gè)開口、或削減透明帶厚度、或軟化透明帶，以利于胚胎孵出，l這些技術(shù)稱為輔助孵出(assistedhatch.ing，AH)。AH通常在8細(xì)胞期以后進(jìn)行，在囊胚期進(jìn)行更合理，效果更顯著。AH的適應(yīng)證：①患者年齡N38歲；②胚胎透明帶厚度N，15um；③胚胎移植2個(gè)周期以上未孕者；，④卵巢反應(yīng)不良者。AH的方法①機(jī)械法：借助顯微操作行胚胎透明帶部分切除(PZD)，使透明帶形成一個(gè)開口1.②化學(xué)法：用酸性Tyrode溶液溶解透明帶，使透明帶形成一小孔，-或使透明帶部分或整體變?。虎奂す夥ǎ河锰刂撇ＡЮw維導(dǎo)入直徑為20ttm的激光束，利用這種低能量產(chǎn)生的光切割作用將透明帶鉆孔；④生化法：用蛋白酶(pronase或proteinaseK)軟化透明帶。通過以上方法可改善胚胎的孵出率及種植率，從而提高妊娠率。 ，但近期Edirisinghe等(1999)在兩個(gè)不孕中心，于胚胎第3日用PZD法行AH，共189個(gè)周期，其中新鮮胚胎96個(gè)周期，冷凍胚胎93個(gè)周期。與對(duì)照組比較，胚胎質(zhì)量、種植率及妊娠率無明顯區(qū)別。而且，結(jié)果顯示AoH對(duì)凍融胚胎有不利影響的傾向。這些發(fā)現(xiàn)尚需要大量研究證實(shí)。 ^種植前遺傳學(xué)診斷種植前遺傳學(xué)診斷(preimplantationgeneticdiagnosis，PGD)是指從體外受精的胚胎取部分細(xì)胞進(jìn)行基因檢測(cè)，確定胚胎無致病基因后再移植。廣義的PGD還包括受精前配子的基因型檢測(cè)及極體活檢等。1990年世界首例經(jīng)PGD后妊娠成功，并獲得健康嬰兒，至今全世界已進(jìn)行PGDl200多個(gè)周期，約有200例健康嬰兒誕生。PGD是最早期的產(chǎn)前診斷措施，此技術(shù)的發(fā)展對(duì)優(yōu)生起到重要作用。PGD是建立在IVF及ICSI的基礎(chǔ)上，技術(shù)難度大，需要有生殖內(nèi)分泌、胚胎學(xué)和分子遺傳學(xué)等多學(xué)科的密切配合，必須采用高靈敏度和高特異性的檢測(cè)方法。目前的PGD技術(shù)已達(dá)到在IVF過程中對(duì)卵子、合子和胚胎進(jìn)行活檢的水平，主要采用的方法有：①聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)，通過重復(fù)擴(kuò)增特異DNA片段以獲得足夠的拷貝，對(duì)極體或卵裂球的單基因突變進(jìn)行檢測(cè)；②熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)利用熒光標(biāo)記的特定探針，可檢測(cè)出多種染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常。PGD的臨床應(yīng)用應(yīng)用特殊的x或Y染色體探針對(duì)胚胎進(jìn)行FISH-或應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)性染色體分析，以診斷胎兒的性別，從而避免嚴(yán)重的性連鎖疾病。應(yīng)用FISH可同時(shí)對(duì)胚胎的多條染色體進(jìn)行分析，以鑒別非整倍體胚胎，對(duì)高齡婦女可減少或消除三體性胚胎如唐氏綜合征(2l-三體)的風(fēng)險(xiǎn)。FISH也可用于平衡易位，片段缺失等其他染色體異常的診斷。PCR技術(shù)已成功地用于診斷單基因疾病，主要包括地中海貧血、進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良、囊性纖維病、脆性X綜合征等。此外，此技術(shù)亦用于診斷其它常見的遺傳疾病。胚胎活檢應(yīng)用顯微操作對(duì)胚胎進(jìn)行活檢以獲得遺傳物質(zhì)是PGD的最關(guān)鍵的第一步?；顧z術(shù)必須保證對(duì)胚胎無影響。卵子的第一極體、第二極體、早期胚胎的卵裂細(xì)胞及囊胚期的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞均可作為PGD的材料。極體活檢僅間接反映母體單方面的遺傳缺陷，有男方遺傳缺陷時(shí)則.不能采用極體活檢進(jìn)行PGD。理論上滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢較理想，因滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞不參與胎兒發(fā)育，取出10，30個(gè)細(xì)胞并不危害胎兒正常發(fā)育，卻可提供較多的遺傳物質(zhì)進(jìn)行分析，且囊胚期胚胎基因表達(dá)更為完全，增加了診斷的可靠性。但至今IVF中只有25%。50%的胚胎能發(fā)育到囊胚階段，故限制了實(shí)際應(yīng)用。目前臨床上常用的仍為極體活檢和胚胎發(fā)育至6-10細(xì)胞時(shí)卵裂細(xì)胞活檢。 ^實(shí)驗(yàn)表明人類胚胎經(jīng)活檢取出I/4、2/8或3/8個(gè)卵裂球后并不影響在體外繼續(xù)發(fā)育至囊胚期的能力?；顧z第一極體后，對(duì)卵子的受精和胚胎發(fā)育影響不大。胚胎活檢和PCR、FISH"檢測(cè)可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成。PGD存在的問題及發(fā)展方向胚胎活檢難度較大，約10%卵裂球在標(biāo)本制備過程中遭受損傷。所得到的遺傳物質(zhì)有限，通常無法作出重復(fù)檢證。.另外，由于子宮內(nèi)膜種植窗時(shí)間短，允許進(jìn)行PGO的時(shí)間有限。故PGD在臨床應(yīng)用的有效性和實(shí)用價(jià)值仍需進(jìn)一步證實(shí)。在應(yīng)用PCR進(jìn)行PGD的過程中，一個(gè)非常重要的問題是如何控制DNA污染。由于污染的外源性DNA可與活檢的模板DNA同時(shí)擴(kuò)增，而影響整個(gè)測(cè)定結(jié)果。其它問題包括優(yōu)勢(shì)等位基因擴(kuò)增及更嚴(yán)重的等位基因脫扣(Alleledropout，ADO)。ADO是PGD檢測(cè)單基因疾病可能出現(xiàn)誤診的主要原因，近年來對(duì)ADO的研究已有一定進(jìn)展。由于PGD是一項(xiàng)難度大、具有挑戰(zhàn)性的新技術(shù)，因而在未來的數(shù)年內(nèi)仍需進(jìn)一步研究。但在不久的將來會(huì)更加廣泛的應(yīng)用，其主要原因是①PGD的需求不斷增加：由于許多男性不孕癥可通過ICSI受精、妊娠，他們的遺傳缺陷可直接傳給下一代，通過PGD可減少這些風(fēng)險(xiǎn)；②PGD技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展將改善活檢效率，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和敏感性，減少假陽性和假陰性的發(fā)生率；③將來可對(duì)單個(gè)卵裂球進(jìn)行DNA指紋分析以排除外源性污染；④輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，特別是對(duì)配子和胚胎發(fā)育有了更多的了解，將直接或間接影響PGD的發(fā)展。使PGD在優(yōu)生優(yōu)育中發(fā)揮巨大的潛力。其他進(jìn)展近年的研究進(jìn)展還包括不成熟卵細(xì)胞在體外培養(yǎng)成熟以及克隆助孕技術(shù)。前者用于臨床已取得妊娠及分娩。而克隆助孕技術(shù)目前尚未應(yīng)用于人類，因其除技術(shù)問題外，尚涉及廣泛的倫理和法律方面的爭(zhēng)議。第二節(jié)孕產(chǎn)期并發(fā)癥及處理一、自然流產(chǎn)經(jīng)ART妊娠后自然流產(chǎn)的危險(xiǎn)高于自然妊娠，約為18.4%?30%。流產(chǎn)率增加明顯與母親年齡有關(guān)，小于25歲者流產(chǎn)率大約18%，而大于40歲者由于卵母細(xì)胞質(zhì)量差，流產(chǎn)率增加到40%。58%。此外，多胎妊娠、控制性超促排卵和體外培養(yǎng)過程中對(duì)卵子紡錘體的影響、以及ART過程中器械操作可能中斷了母體一胚胎間的某種聯(lián)系等，均為ART流產(chǎn)率較高的可能因素。二、 異位妊娠在經(jīng)ART妊娠者中，異位妊娠發(fā)生率為3.2%—5%，明顯高于自然妊娠的23%。2.21%。這可能是由于①藥物超促排卵，多個(gè)卵泡發(fā)育，雌激素水平明顯高于自然周期，子宮易受到激惹。在進(jìn)行胚胎移植時(shí)，導(dǎo)管進(jìn)入官腔可刺激宮縮，子宮內(nèi)膜有節(jié)奏地從子宮內(nèi)口向子宮底方向蠕動(dòng)。移植入官腔的胚胎一旦進(jìn)入輸卵管，由于患者大多有輸卵管病變，即使輸卵管正常，體內(nèi)非生理性的高水平激素環(huán)境可改變輸卵管的生理功能，因而不能將胚胎有效地推進(jìn)返回官腔，則形成輸卵管妊娠。②有些患者過去曾多次刮宮，子宮內(nèi)膜不利于胚胎著床，可發(fā)生宮頸妊娠。③少數(shù)情況下發(fā)生宮內(nèi)孕合并宮外孕，可能與移植多個(gè)胚胎有關(guān)。④ART的各種器械操作有可能干擾母體一胚胎間的微妙聯(lián)絡(luò)，亦可能與異位妊娠的發(fā)生有關(guān)。為避免或減少異位妊娠的發(fā)生，在胚胎移植時(shí)盡量減少刺激，包括盡可能不用宮頸鉗，選用刺激性小的移植導(dǎo)管等。注入胚胎后停留60秒，待注入的含胚胎的培養(yǎng)液溶于子宮內(nèi)膜腺體的粘液中再取出導(dǎo)管。應(yīng)控制移植胚胎數(shù)目不超過4個(gè)及液體總量不超過30td。在早孕階段，必須重視下腹痛、陰道出血等癥狀，對(duì)異位妊娠應(yīng)盡早診斷及處理。三、 多胎妊娠由于促排卵藥物在治療不孕癥中的應(yīng)用，多胎妊娠發(fā)生率明顯增加，在ART中多胎率可達(dá)30%以上。多胎妊娠對(duì)母兒均不利，特別是三胎及三胎以上的多胎妊娠，孕婦易出現(xiàn)妊娠高血壓綜合征、貧血、羊水過多、前置胎盤、胎膜早破、產(chǎn)后出血、；圍產(chǎn)期心衰等產(chǎn)科高危并發(fā)癥d胎兒易發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、低體重兒而增加圍產(chǎn)期胎、嬰兒發(fā)病率及死亡率。一些新生兒雖獲生存，也可引起永久性損害。故在ART中預(yù)防多胎是重要環(huán)節(jié)，應(yīng)限制移植胚胎的數(shù)目，建立胚胎凍存技術(shù)。對(duì)多胎妊娠的處理通常有①治療性人工流產(chǎn)：但大部分孕婦有長期不孕史，往往不能接受；②選擇性減胎術(shù)；③嚴(yán)密監(jiān)護(hù)下繼續(xù)妊娠。目前主張對(duì)三胎及三胎以上妊娠者行選擇性減胎術(shù)（一）選擇性減胎術(shù)選擇性減胎術(shù)是80年代初開始發(fā)展起來的技術(shù)。手術(shù)大多在B超引導(dǎo)下于孕早期經(jīng)陰道或腹部進(jìn)行。因多胎妊娠在孕早期有可能自然減胎，故行此術(shù)時(shí)通常保留2個(gè)胚胎。減胎術(shù)后可出現(xiàn)少量陰道出血，10%左右可發(fā)生全部胎兒流產(chǎn)。經(jīng)腹部減胎術(shù)-通常在孕9-12周進(jìn)行，方法為：在B超引導(dǎo)下穿刺針經(jīng)腹壁穿過子宮壁，進(jìn)入擬減滅的胎囊，針刺胎兒心臟，直接向胎心搏動(dòng)區(qū)注射15%氯化鉀溶液0.3一1.2ml，致胎心搏動(dòng)停止?；虺槲蛩笞⑷?%氯化鈉溶液3ml。也可單用穿刺針以物理創(chuàng)傷使胎兒心搏停止并吸出羊水。次日復(fù)查B超，觀察被穿刺的胎胚是否恢復(fù)心管搏動(dòng)，如恢復(fù)需再次行減胎術(shù)。死亡的胎兒可逐漸被吸收。經(jīng)陰道減胎術(shù)為現(xiàn)今常用的方法，一般在孕7。8周進(jìn)行。術(shù)前用鎮(zhèn)靜藥及靜脈注射抗生素，消毒陰道。手術(shù)在陰道B超引導(dǎo)下，穿刺針經(jīng)陰道穹窿及子宮壁進(jìn)入距穿刺針最近的孕囊，吸出胚胎組織及羊水，如有可能應(yīng)減去發(fā)育較小或位于子宮下部的胚胎。此法較經(jīng)腹部減胎術(shù)提早2。4周進(jìn)行，無須注入藥物，操作簡(jiǎn)單。由于胚胎及孕囊壞死組織量少，術(shù)后易吸收，可無陰道出血或少許陰道出血，極少出現(xiàn)母體凝血功能障礙，故比較安全〃尤其適用于四胎及四胎以上妊娠者。對(duì)四胎以上者應(yīng)分2次減胎。中山醫(yī)科大學(xué)生殖中心對(duì)妊娠周數(shù)較大、不易吸出的胚胎，采用自制鋼絲絞殺器減胎。穿刺針進(jìn)入胎心搏動(dòng)區(qū)時(shí)，拔出針芯，插入絞殺器，當(dāng)鋼絲伸出針尖時(shí)立即向兩側(cè)分開呈叉狀，嵌刺在心搏區(qū)，此時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)絞殺器即將心臟及部分胎體絞碎，然后吸出胚胎組織。此法減胎準(zhǔn)確、快捷、安全、簡(jiǎn)便。目前對(duì)孕早期減胎的最佳時(shí)間仍有爭(zhēng)議。在孕7。8周時(shí)進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，殘留胚胎組織少、吸收快，比較安全。但過早減胎，增加了自然流產(chǎn)率，且有自然減胎的可能。而過遲進(jìn)行減胎，有可能發(fā)生胎兒吸收不完全、陰道出血時(shí)間長及繼發(fā)宮腔感染等問題。此外，向胎心搏動(dòng)區(qū)注射氯化鉀對(duì)周圍保留之胚胎是否有不利影響尚無定論。故最佳減胎時(shí)間及更安全的減胎方法尚需進(jìn)一步研究。產(chǎn)前處理對(duì)多胎妊娠產(chǎn)前必須進(jìn)行系統(tǒng)而嚴(yán)密的監(jiān)護(hù)，重點(diǎn)是預(yù)防流產(chǎn)及早產(chǎn)，積極防治孕婦的各種產(chǎn)科并發(fā)癥，減少圍產(chǎn)期母嬰發(fā)病率及死亡率。孕期給高蛋白飲食，定期進(jìn)行B超監(jiān)測(cè)胎兒生長發(fā)育情況。對(duì)三胎及三胎以上妊娠者，孕20周開始臥床，孕26-28周住院直至分娩。從孕28周應(yīng)開始促胎兒肺成熟，必要時(shí)使用子宮松弛劑。也有學(xué)者提出在孕12周時(shí)即施行子宮頸環(huán)扎術(shù)，以增強(qiáng)宮頸內(nèi)口提托力，延長妊娠時(shí)間，減少早產(chǎn)。分娩處理多胎妊娠的分娩應(yīng)在產(chǎn)科、新生兒科及麻醉科醫(yī)師的共同協(xié)助下進(jìn)行，須具備良好的新生兒監(jiān)護(hù)室及設(shè)備。對(duì)經(jīng)ART所致多胎妊娠的分娩方式，現(xiàn)大多采用剖宮產(chǎn)。因此方式時(shí)間短，可避免新生兒腦損傷及胎先露異常經(jīng)陰道分娩的并發(fā)癥。故較為安全。但并非不能經(jīng)陰道分娩。應(yīng)根據(jù)孕婦年齡、胎次、產(chǎn)次、胎數(shù)、孕齡、胎先露、不孕史及產(chǎn)科合并癥等因素綜合考慮，選擇適宜的分娩方式。四、卵巢過度刺激綜合征卵巢過度刺激綜合征(Ovarianhyperstimulation。yndrome，OHSS)是在ART中使用GnH超促排卵引起的一種嚴(yán)重的醫(yī)源性疾病。表現(xiàn)為卵巢對(duì)GnH刺激過度反應(yīng)，卵巢多濾泡形成，體積增大，腹脹、腹水、胸水、少尿及低血容量所致的一系列臨床癥候群。發(fā)病率約20%，在妊娠周期中OHSS發(fā)生率約4倍于非孕周期，OHSS患者中妊娠率2—3倍于無OHSS者。表明卵巢對(duì)GnH的正常反應(yīng)與過度反應(yīng)之間的差異十分接近。因此，在超促排卵過程中，必須嚴(yán)密監(jiān)測(cè)，盡量防止OHSS發(fā)生。(一)OHSS的高危因素?使用大劑量的GnH在ART中為了在一個(gè)周期獲得多個(gè)成熟卵母細(xì)胞，卵泡初期即用大劑量外源性GnH以募集大批卵泡，大量中、小卵泡同時(shí)發(fā)育。在注射hCG前，當(dāng)雌二醇(E2)>9200pmol/L(2500pg/m1)時(shí)，易發(fā)生OHSS，如E2>14800pmoL/L(4000pg/m1)，幾乎100%發(fā)生OHSS。。通常年齡越輕，卵巢對(duì)GnH的敏感性越高，體格瘦小的年輕婦女易發(fā)生OHSSo’多囊卵巢綜合征患者對(duì)GnH的刺激產(chǎn)生2種結(jié)果，大多數(shù)易出現(xiàn)過度反應(yīng)，一部分則無反應(yīng)。 ’ ’hCG的促發(fā)作用卵泡成熟時(shí)用大劑量hCG誘導(dǎo)卵細(xì)胞最后成熟及排卵；排卵后補(bǔ)充hCG支持黃體；加之妊娠后內(nèi)源性hCG升高，均可觸發(fā)或加重OHSSo（二）OHSS的發(fā)病機(jī)制 ?！壳皩?duì)OHSS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，認(rèn)為主要是由于卵巢對(duì)GnH過度反應(yīng)，多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育，產(chǎn)生過多的雌激素，腎素一血管緊張素一醛固酮系統(tǒng)被激活。前列腺素、組織胺、5羥色胺以及血管通透因子等活性物質(zhì)產(chǎn)生增加。使毛細(xì)血管損害，通透性增加，血管內(nèi)液體大量外滲，蛋白丟失，出現(xiàn)腹水、胸水、全身水腫、低蛋白血癥、血容量降低、血液粘稠度增加，少尿、電解質(zhì)紊亂，肝腎功能損害，血栓形成等，嚴(yán)重者危及生命。大量卵泡發(fā)育，引起卵巢明顯增大，甚或發(fā)生卵巢扭轉(zhuǎn)或破裂。（蘭）oHss的臨床表現(xiàn)及分度OHSS常發(fā)生于注射hCG后3。1O日，月經(jīng)來潮后癥狀即緩解。如妊娠則癥狀會(huì)加重，可持續(xù)6周左右，如流產(chǎn)或胚胎停止發(fā)育，則癥狀亦會(huì)逐漸減輕。根據(jù)患者的臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢查，將OHSS分為輕、中、重三度。輕度輕微腹脹、胃部不適。卵巢直徑W5cm，卵泡數(shù)N10個(gè)，可有少量腹腔積液。。E2＞5550pmol/L（1500pg/m1）。中度有腹脹、腹痛，或惡心、嘔吐、腹瀉等消化道癥狀。卵巢直徑＞5cm，但＜12cm，有多個(gè)黃素化囊腫，中量腹水。血E2＞11100pmol/L（3000pg/m1）。重度腹脹明顯，腹部臌隆.，少尿，或有呼吸困難。卵巢直徑＞12cm，大量腹水，可伴有胸水。血液濃縮：紅細(xì)胞壓積＞45%，電解質(zhì)紊亂，肝腎功能損害，甚至血栓形成，嚴(yán)重者有生命危險(xiǎn)。已有OHSS導(dǎo)致死亡的個(gè)案報(bào)道。（四）；OHSS的治療：OHSS常出現(xiàn)在排卵后，不能排除妊娠的可能性，’故以保守治療為主。輕、中度OHSS具有自限性，可在門診嚴(yán)密隨訪，臥床休息，對(duì)癥處理，并盡早確診妊娠，.防止病情向重度發(fā)展。對(duì)重度OHSS則須住院積極治療，密切監(jiān)護(hù)。臥床休息、；每日測(cè)腹圍、體重、記出入量。.’查血、尿常規(guī)、尿比重、血液粘稠度、電解質(zhì)、肝腎功及凝血狀態(tài)。B超檢查卵巢及胸腹水情況。避免婦科檢查及增加腹壓，防止卵巢破裂或扭轉(zhuǎn)。補(bǔ)充白蛋白、血漿等維持膠體滲透壓，防止血管內(nèi)液體進(jìn)一步外滲。糾正低血容量及電解質(zhì)紊亂，常用低分子右旋糖酐、生理鹽水或葡萄糖溶液，維持有效血容量及水電解質(zhì)平衡，防止血液濃縮及腎衰。在未充分?jǐn)U容前，禁用利尿劑。降低毛細(xì)血管通透性，可用消炎痛、強(qiáng)的松等。腹水嚴(yán)重時(shí)，可行腹腔穿刺適量放液，改善癥狀。 ’6?血液呈高凝狀態(tài)時(shí)，可適當(dāng)用肝素治療，以防止深部靜脈血栓形成。7?若出現(xiàn)卵巢破裂、出血或扭轉(zhuǎn)等急腹癥，應(yīng)剖腹探查，盡量保留卵巢組織。預(yù)防感染。