國內外食品微生物檢測方法大全課件

準確、可靠的檢驗結果是正確評價和保證食品安全性的先決條件，也是國際貿易上公平交易的有力科學依據(jù)。在食品微生物檢驗領域中，檢驗規(guī)程規(guī)范化和分析方法標準化是檢驗結果可信性的重要保證。避免“公說公有理，婆說婆有理”；避免“仁者見仁，智者見智”1/4/2023準確、可靠的檢驗結果是正確評價和保證食品安全性的先決1內容第一部分國內外食品微生物標準檢驗體系第二部分微生物檢驗快速檢測系統(tǒng)第三部分方法的選擇第四部分微生物檢驗方法的編寫第五部分食品微生物檢驗方法的驗證和確認1/4/2023內容第一部分國內外食品微生物標準檢驗體系122第一部分國內外的食品微生物標準檢驗體系一、術語和定義

1、標準方法：指國際、區(qū)域、國家發(fā)布的經(jīng)過嚴格確認的以及公認的方法。標準方法包括參考方法和公定方法。

（1）參考方法：指適用于特殊待驗目標的經(jīng)過國際或國家公認的檢驗方法。對于食品微生物檢驗而言，典型的傳統(tǒng)的參考方法是培養(yǎng)法。

（2）公定方法：指知名的技術組織或機構（如AOAC）公布的檢測方法。

2、非標準方法：標準方法中未包含的需要確認后才能采用的方法。

可替代方法：指用來檢驗某一特定產(chǎn)品中某種目標微生物的與相應參考方法等效的方法（ISO16140:2003），如快速檢測試劑盒和自動化系統(tǒng)。值得說明的是，并非所有的可替代方法都是標準方法。1/4/2023第一部分國內外的食品微生物標準檢驗體系一、術語和定義可3二、國內外食品微生物檢測體系

國內主要食品微生物檢測體系

國家標準(GB)

檢驗檢疫行業(yè)標準(SN)

衛(wèi)生行標(WS)

農業(yè)行標(NY)國外主要食品微生物檢測體系

國際標準化組織(ISO)

美國食品藥品監(jiān)督局（FDA）(online)

美國官方分析化學師協(xié)會(AOAC)

美國農業(yè)部（USDA）(online)

加拿大健康署(HPB)(online)

美國公共衛(wèi)生協(xié)會(APHA)

北歐食品分析委員會（NMKL）

法國標準協(xié)會(AFNOR)標準、英國國家標準(BS)、日本國家標準(JIS)、韓國國家標準（KS）等

標準方法非標準方法科學書籍和期刊公布的方法；實驗室研發(fā)的未出版的方法；部分由設備制造商指定的方法；擴充和修改過的標準方法；企業(yè)標準；部分協(xié)會標準；部分地方標準等。食品微生物檢測方法標準方法未包含的方法

1/4/2023二、國內外食品微生物檢測體系國內主要食品微生物檢測體系4

食品中常規(guī)指示菌和致病菌的關系好氧菌總數(shù)腸桿菌科大腸菌群糞大腸菌群大腸桿菌沙門氏菌致瀉性大腸桿菌金黃色葡萄球菌糞鏈球菌弧菌科單增李斯特氏菌志賀氏菌芽孢桿菌O157厭氧梭菌彎曲菌1/4/2023食品中常規(guī)指示菌和致病菌的關系好氧菌總數(shù)腸桿菌科大腸5常規(guī)指示菌和致病菌的“危害分類”VeryfewmicrobesarealwayspathogenicManymicrobesarepotentiallypathogenicMostmicrobesareneverpathogenic如霍亂弧菌、O157、單核細胞增生李斯特氏菌等如腸球菌、蠟樣芽孢桿菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌等如乳酸桿菌、雙歧桿菌等1/4/2023常規(guī)指示菌和致病菌的“危害分類”Veryfewmicro6食品微生物檢測方法方法定量方法定性方法直接計數(shù)方法細菌總數(shù)*、大腸菌群*、大腸桿菌*、腸球菌*、金黃色葡萄球菌*、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、單核增生李斯特氏菌、沙門氏菌、彎曲菌屬、腸桿菌科*、副溶血性弧菌、亞硫酸鹽還原梭菌、李斯特氏菌屬、霉菌和酵母菌數(shù)*、嗜冷菌*、乳酸菌、雙歧桿菌等間接計數(shù)法(MPN法)大腸菌群*、糞大腸菌群*、大腸桿菌*、腸球菌*、金黃色葡萄球菌*、蠟樣芽孢桿菌、單核增生李斯特氏菌、腸桿菌科*、副溶血性弧菌、亞硫酸鹽還原梭菌等致病菌：單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、空腸彎曲菌、O157、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、肉毒梭菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、產(chǎn)毒霉菌等

帶*者通常被列為食品衛(wèi)生指示菌1/4/2023食品微生物檢測方法方法定量方法定性方法直接計數(shù)方法間接計7傳統(tǒng)直接計數(shù)法平板傾注法平板涂布法1/4/2023傳統(tǒng)直接計數(shù)法平板傾注法平板涂布法12/28/202281/4/202312/28/202291/4/202312/28/202210MPN法適用于污染程度低，含有受到損傷的加工食品，目標微生物數(shù)量低，否則，應用直接計數(shù)方法間接計數(shù)法——最大可能數(shù)量（MPN）1/4/2023MPN法適用于污染程度低，含有受到損傷的加工食品，目標微生物11三、區(qū)分幾個關系1、國家標準與行業(yè)標準的關系？

食品微生物檢驗的國家標準是GB/T4789，其為基礎標準，行業(yè)標準方法原則上應與其一致，至少不能與國家標準相矛盾。進口產(chǎn)品用GB???出口產(chǎn)品用SN??????

2、國家標準與國際標準的關系？

為了公平貿易，國家標準應與國際標準接軌。應考慮優(yōu)先使用國際標準?，F(xiàn)狀。實例：2004年USDA來青進行等效性評估。3、[國內]國家標準/行業(yè)標準與[他國]國家標準/行業(yè)標準的使用？

根據(jù)ISO/IEC17025的規(guī)定，如果進口國要求使用他國國家標準/行業(yè)標準，原則上要滿足客戶的要求，否則，需與客戶協(xié)商。即使國內國家標準/行業(yè)標準與他國國家標準/行業(yè)標準等效或等同，也必須與客戶協(xié)商和溝通，只有做客戶統(tǒng)一的情況下方可使用。1/4/2023三、區(qū)分幾個關系1、國家標準與行業(yè)標準的關系？12/28/212第二部分微生物快速檢測系統(tǒng)1/4/2023第二部分微生物快速檢測系統(tǒng)12/28/202213第一節(jié)主要微生物檢驗快速檢測系統(tǒng)

一、以免疫學為基礎的檢驗法1/4/2023第一節(jié)主要微生物檢驗快速檢測系統(tǒng)一、以免疫學為基礎的檢14免疫磁珠檢驗法的優(yōu)點:特異性好靈敏度高≤1CFU所捕獲的菌是活菌快速、操作步驟簡便可快速處理較大量樣品1/4/2023免疫磁珠檢驗法的優(yōu)點:12/28/2022151/4/202312/28/202216商業(yè)化免疫磁珠有：沙門氏菌O157:H7單核細胞增生李斯特氏菌VTECO145

VTECO111VTECO103VTECO26等等SN/T***-****進出口食品中產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌的檢驗方法1/4/2023商業(yè)化免疫磁珠有：SN/T***-****進出口食品中17

可篩選沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157、李斯特氏菌、空腸彎曲菌、單核細胞增生李斯特氏菌、葡萄球菌腸毒素；可免疫濃縮沙門氏菌、免疫濃縮腸出血性大腸桿菌O157Mini-VIDAS自動微生物篩選儀1/4/2023可篩選沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O15718二、以分子生物學為基礎的檢驗法DIN10135：1999《沙門氏菌聚合酶連鎖反應(PCR)檢驗方法》、ISO/TS20863：2005《食品和動物飼料微生物學—聚合酶鏈反應(PCR)檢測食源病原體—熱循環(huán)器的性能試驗》、ISO/TS22174:2005《食品和動物飼料微生物學—聚合酶鏈反應(PCR)檢測食源病原體—通用要求和定義》、ISO20837:2006《食品和動物飼料微生物學—聚合酶鏈反應(PCR)檢測食源病原體—定性檢測用樣品的制備》、ISO/TS20838：2006《食品和動物飼料微生物學—聚合酶鏈反應(PCR)檢測食源病原體—定性方法的擴增和檢測條件》、HealthCanadaMFLP-72、USAFDABAM第9章和USAAPHA第40章規(guī)定可用PCR檢測食品中的致病弧菌（如霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌等）、HealthCanada

MFLP-24和USAFDABAM第24章和USAAPHA第35章規(guī)定可用PCR檢測食品中產(chǎn)志賀氏毒素的致病大腸桿菌和霍亂弧菌。SN/T1632.2：2005《奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法第2部分：PCR方法》SN/T1632.3：2005《奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法第3部分：熒光PCR方法》PCR檢測食品中霍亂弧菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌等致病菌的SN均在報批中，即將發(fā)布。1/4/2023二、以分子生物學為基礎的檢驗法DIN10135：1999《19PCR技術將是眾多食品微生物快速檢測中被認可的一枝獨秀的快速檢測技術之一。

但須注意：如何減少培養(yǎng)基成分的干擾？死菌的干擾和風險？等等1/4/2023PCR技術將是眾多食品微生物快速檢測中被認可20基因芯片-DNA點樣儀

基因芯片的基本技術路線1、采用數(shù)據(jù)庫中各種微生物的全基因組序列資料或部分基因組序列資料，通過生物信息學方法找出各種微生物的特異序列，每個檢測目標找3-5個特異序列，每個序列長度為25-75mer。并設計五條陰性序列（這些序列不代表任何一個待分析的微生物）。2、合成上述特異序列（探針）。探針將不是傳統(tǒng)的cDNA形式，而是oligo寡聚核酸，這樣將大大提高檢測靈敏度。3、利用基因芯片點樣系統(tǒng)將探針點樣到載體上。同一種微生物的特異性探針點樣到芯片的一個區(qū)域。4、尋找適當?shù)姆椒ǎ崛∥⑸锏幕蚪M核酸。5、加入相應的引物、熒光染料或用分子信標的方法，通過PCR擴增特異性片段。6、將帶有熒光染料標記的核酸與基因芯片雜交。7、雜交結果由基因芯片掃描儀進行掃描判讀，對于管帽芯片也可用熒光顯微鏡進行觀察。8、結果分析，針對雜交陽性位點，找出對應的陽性樣品。

SN/T1543:2005食源性致病菌基因芯片鑒定方法1/4/2023基因芯片-DNA點樣儀21三、生化鑒定系統(tǒng)1/4/2023三、生化鑒定系統(tǒng)12/28/202222BDPHOENIX?全自動微生物鑒定系統(tǒng)大腸桿菌（G-）沙門氏菌(G-)志賀氏菌(G-)彎曲桿菌(G-)弧菌(G-)小腸結腸炎耶爾森氏菌(G-)金黃葡萄球菌(G+)李斯特氏菌(G+)***產(chǎn)氣甲膜梭菌(G+)肉毒梭菌(G+)鏈球菌(G+)炭疽桿菌(G+)雙歧桿菌（G+）乳酸菌（G+）VITEK2COMPACT1/4/2023BDPHOENIX?大腸桿菌（G-）VITEK2COM23四、根據(jù)酶觸反應及代謝產(chǎn)物快速檢測細菌1/4/2023四、根據(jù)酶觸反應及代謝產(chǎn)物快速檢測細菌12/28/2022241/4/202312/28/2022251/4/202312/28/202226五、其他部分自動化系統(tǒng)1/4/2023五、其他部分自動化系統(tǒng)12/28/202227BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)BIOLOGOmniLog&OmniLogPlusMicroLog1MicroLog2MicroLog3(MicroStation)OmniLogMicroLog1/4/2023BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)BIOLOGOmniLog28第二節(jié)微生物快速檢測系統(tǒng)的局限性

大部分快速方法適用于檢測單一微生物，適用于質量控制程序中快速篩選大量食品樣品中所存在的特殊病原體或毒素。然而，快速檢驗方法所得陽性者，僅僅是可疑，必須用標準參考方法予以證實，雖然證實試驗需要幾天，但不能予以限制。

快速檢驗方法的評估結果表明，其對于某類食品的性能優(yōu)于其它食品，很大程度上是由于食品成分干擾所致，有些食品成分對于快速方法中所應用的技術是比較麻煩的。例如，每一食品成分可能抑制DNA雜交或Taq聚合酶，但對抗原-抗體相互作用沒有影響，反之亦然。既然方法的靈敏度、特異性和精確性依賴于待驗食品，那么進行比較研究以確保某一特殊檢驗方法能有效分析此類食品是明智的。1/4/2023第二節(jié)微生物快速檢測系統(tǒng)的局限性大部分快29

基于DNA檢驗方法的特異性通過短的探針來顯示，因此用特殊探針或引物檢測毒素基因，陽性結果僅僅表明某細菌具有該基因序列，以及某細菌可能是產(chǎn)毒的，不能從客觀上說明該基因得以表達，并產(chǎn)生毒素，例如在梭菌和葡萄球菌中毒病例中，DNA雜交和PCR僅能檢測到基因的存在，但不能用來檢測預先形成的毒素是否存在。

隨著某一快速方法更加頻繁的使用，其好處和局限性同時變得更加明顯。使用者在選擇和徹底評估這些快速方法時，必須保持謹慎。1/4/2023基于DNA檢驗方法的特異性通過短的探針來顯示30FDA認可使用的檢測系統(tǒng)和試劑盒

檢測和鑒定食源性病原菌的微量生化復合試劑盒

微生物自動鑒定系統(tǒng)

核酸雜交分析（分子生物學）方法

免疫學分析方法

其它商品化快速檢測方法和培養(yǎng)基第三節(jié)微生物快速檢測系統(tǒng)的認可一、USDAFDA認可情況1/4/2023FDA認可使用的檢測系統(tǒng)和試劑盒檢測和鑒定食源性病原菌的311/4/202312/28/2022321/4/202312/28/2022331/4/202312/28/2022341/4/202312/28/2022351/4/202312/28/2022361/4/202312/28/202237二、AOAC、NMKL、AFNOR、

NORDVAL、MICROVAL的認可情況AOAC指南美國管理者(USregulators)ISO16140AOAC研究所NMKLNordValMicroValAOAC&OMA非美國管理者，如NATAAFNOR認可微生物快速檢測系統(tǒng)的主要知名技術組織或機構的相互關系認可(agreement)逐步淘汰(phasingout)1/4/2023二、AOAC、NMKL、AFNOR、

NORDVAL、MIC38第三部分方法的選擇1．客戶要求；2．方法的準確性；3．方法的特異性；4．方法的實用性；5．方法的穩(wěn)定性；6．方法的靈敏度；7．方法的檢測限和測量限；8．實驗室硬件條件（儀器、設備、場地設施、人員資質等）；9．商業(yè)快速檢測系統(tǒng)的供應保證、價格、認可程度和售后服務。1/4/2023第三部分方法的選擇1．客戶要求；12/28/202239通常情況下，實驗室應采用滿足客戶（注：對于企業(yè)實驗室，其所在單位為其內部客戶）需要并適用于所進行的檢測的方法，包括在抽樣的方法。應優(yōu)先使用以國際、區(qū)域或國家標準發(fā)布的方法。當認為客戶提出的方法不合適或已過期時，實驗室應通知客戶。

當客戶未指定所用方法時，除優(yōu)先使用國際、區(qū)域、國家或知名的技術組織發(fā)布的標準方法外，還可選擇非標準方法，但必須對所選擇的非標準方法進行嚴格驗證、確認和審批，如能滿足實驗室的預期用途，并經(jīng)客戶同意，也可使用。1/4/2023通常情況下，實驗室應采用滿足客戶（注：對于企業(yè)40第四部分微生物檢驗方法的編寫標準方法的一般構成和編寫順序：1．資料性技術要素：封面、目次*、前言、引言；

2．規(guī)范性一般要素：名稱、范圍、規(guī)范性引用文件*；3．規(guī)范性技術要素：術語和定義*、符號和縮略語、食品微生物檢驗(原理*、培養(yǎng)基和試劑、設備和材料、采樣*、制樣、增菌培養(yǎng)、篩選、鑒定和確認等)、結果判定（判定方法和判定標準）、結果報告*、規(guī)范性附錄*；

4．資料性補充要素：資料性附錄*、參考文獻*、索引*。上述構成要素不是任何一項標準都需要全部包括的，標有*者可根據(jù)標準化對象的特征和制定標準化的目的而取舍。第一節(jié)標準方法的編寫1/4/2023第四部分微生物檢驗方法的編寫標準方法的一般構成和編寫順序：411/4/202312/28/2022421/4/202312/28/202243第二節(jié)非標準方法的編寫

一般要求以接近國家標準（如GB/T1.1－2000）或行業(yè)標準推薦方法的格式進行編寫。等同、修改采用國際標準或國外先進標準時，其編寫格式和方法可與被采用的標準一致。力求標準結構嚴謹、層次分明、主題突出，簡單易懂。

一、非標準方法的編寫原則

1/4/2023第二節(jié)非標準方法的編寫一般要求以接近國家標44二、非標準食品微生物學檢驗方法的基本編寫格式（1）封面每項非標準微生物檢驗方法應該有封面，封面的內容有“×××（單位）×××（部門）非標準方法”字樣和非標準方法的標志（注：選擇性的）、中文名稱、英文名稱（注：選擇性的）、非標準方法的唯一性編號、代替非標準編號（注：選擇性的）、發(fā)布日期、實施日期、標準的審批部門等（見附錄1示例2）。（2）正文內容一般包含下列內容，必要時可增減相關條目：①目的、范圍；②方法提要或原理:簡述所用方法的主要步驟及采用的基本原理；③設備和材料：標明規(guī)格和型號；④培養(yǎng)基和試劑：必須符合GB/T4789.28和SN/T1583的規(guī)定；⑤檢驗程序：畫出主要的檢驗程序框圖；⑥操作步驟：包括試樣制備（含稀釋或按特定條件的制備）、培養(yǎng)（含前增菌培養(yǎng)和增菌培養(yǎng)，分離培養(yǎng)等，可根據(jù)需要取舍和分步描述）、初步鑒定（可根據(jù)需要取舍）、確證鑒定（含進一步的生化反應和血清學分型，可根據(jù)需要確定試驗內容）毒素試驗（可根據(jù)需要取舍）、動物試驗（可根據(jù)需要取舍）；⑦結果報告；⑧其它（包括內部質量保證要點、生物防護要求；）；⑨附錄（資料性附錄和規(guī)范性附錄）⑩方法來源（如參考文獻、儀器設備方法等）。1/4/2023二、非標準食品微生物學檢驗方法的基本編寫格式（1）封面12/45三、非標準方法的審批

制訂SOP，實施需要其它材料？進一步規(guī)范方法實驗室將全部材料送至主管部門實驗室提供材料和信息審核全部材料被批準和備案否實驗室申請認可，提交材料是是否需要采取后續(xù)措施（包括能力驗證、實驗室內試驗、實驗室間協(xié)作試驗等）？實驗室編寫和確認方法實驗室采取所需的措施主管部門組織技術專家組進行材料審查和技術審核（包括能力驗證結果、性能特征、實驗室內試驗結果、實驗室間協(xié)作試驗結果等），決定是否需要現(xiàn)場考查?，F(xiàn)場核查實驗室調研現(xiàn)場核查？否專家組評估所采取措施是否充分合理？是否是是否

非標準食品微生物學檢驗方法的審批程序1/4/2023三、非標準方法的審批制訂SOP，實施需要其它材料？進一步規(guī)46第三節(jié)標準操作程序的編寫標準操作程序（standardoperationpractices，SOP）是用來指導某個具體過程、事物所形成的技術性細節(jié)描述的可操作性文件，國內常常稱之為“作業(yè)指導書”，二者沒有本質區(qū)別。SOPs的編寫及使用是實驗室成功質量體系中的一部分，因為它能為操作人員提供正確完成一項工作的信息，從而保證不同操作人員都能在一定的不確定度范圍內得到相同的微生物檢驗結果。實驗室應關注以下四個方面SOPs：1．方法類：包括食品微生物檢驗方法中不詳細或不完善部分的補充，期間核查、方法確認及比對等；2．設備類：重要或復雜設備的使用、操作規(guī)范（如設備制造商提供的技術說明書不夠明細等）；3．樣品類：取樣、制樣和樣品處置的“實施細則”等；4．數(shù)據(jù)類：定量檢測結果的表達、異常數(shù)據(jù)的剔除、測量結果不確定度的評定等等。SOP是技術性的文件，并不要求必須制訂。一、定義和分類1/4/2023第三節(jié)標準操作程序的編寫標準操作程序（standardo47二、食品微生物檢驗SOP的編寫依據(jù)目前，在國內，尚未檢索到關于食品微生物檢驗SOP的編寫導則及相關要求；在國外，美國環(huán)境保護署(EPA)(/quality/sops.html)和美國農業(yè)部銷售司(AMS)(/science/mpo/)均發(fā)布關于微生物檢驗SOP的編寫導則及相關要求，前者是后者的藍本：①EPAQA/G-6《GuidanceforPreparingStandardOperatingProcedures(SOPs)》；②EPASOPADM-02-02《StandardOperatingProcedureforPreparationandReviewofStandardOperatingProcedures(SOPs)》；③USDAMDP-ADMIN-07《PreparationandMaintenanceofStandardOperatingProcedures(SOPs)》。以上文本均可從相應網(wǎng)站免費下載，同時EPA和USDAAMS制定了一系列與微生物檢驗相關的SOPs，這些SOPs的編寫結構和格式值得借鑒和參考。1/4/2023二、食品微生物檢驗SOP的編寫依據(jù)目前，在國內，尚未檢索到關48

SOP的格式方法一：參照美國農業(yè)部農業(yè)銷售司(AMS)的微生物數(shù)據(jù)程序/science/mpo/sops.htm

方法二：參照美國環(huán)境保護署（EPA）的EPAQUALITYSYSTEM

/quality/sops.html作業(yè)指導書與SOP無本質區(qū)別1/4/2023SOP的格式作業(yè)指導書與SOP無本質區(qū)別12/28/20249三、SOP的基本編寫格式

下面結合一個實例，介紹一下編寫微生物檢驗SOP的基本格式和要求：（1）封面①編寫單位：中英文對照。②標題：測定對象—測定項目—測定方法名稱(中英文對照)；測定對象：以產(chǎn)品為主，采用最常規(guī)的產(chǎn)品名稱（可參照國際、國家或行業(yè)的產(chǎn)品標準）；測定項目：應寫明具體被測項目；當被測項目為多項時，應一一列出，超過8項時，可只寫出前3個項目。③編寫人及時間：為保證SOP內容的全面性和準確性，由實驗室內具有一定資質的使用者編寫；④審核人及時間；⑤批準人及時間：批準人一般為實驗室的技術負責人；⑥文件編號：唯一編碼；⑦受控狀態(tài)：是否受控；⑧修訂號：第×××次修訂；⑨發(fā)放序號。（2）正文內容一般包含下列內容，必要時可增減相關條目：①目的；②范圍；③方法提要或原理:簡述所用方法的主要步驟及采用的基本原理；④程序提綱：包括培養(yǎng)基和血清、設備和玻璃器皿、取樣、測試樣品的制備、測試樣品和最初懸浮液、非選擇性前增菌、選擇性增菌、篩選、可疑典型菌落的分離和純化、生化鑒定、血清學確認和血清型、確認；⑤安全性；⑥質量保證；⑦參考文獻；⑧特殊程序：與④對應；⑨結果表達和測試報告；⑩附錄（資料性附錄和規(guī)范性附錄）。1/4/2023三、SOP的基本編寫格式下面結合一個實例，介紹一下編寫微生50SOP實例USDA：MDP-DATA-01MicrobiologicalDataandResultsReporting

EPA：QC-02-02Air-SurfaceMonitoringofMicrobiologyLaboratories山東CIQ：SOP沙門氏菌的檢測方法1/4/2023SOP實例USDA：MDP-DATA-01Microb51第五部分食品微生物檢驗方法的驗證和確認

一個實驗室擬用某一食品微生物檢驗方法前，無論是標準方法還是非標準方法，皆應對其進行嚴格驗證或確認。詳見《食品微生物實驗室質量管理手冊》1/4/2023第五部分食品微生物檢驗方法的驗證和確認一個52第一節(jié)驗證和確認導則

在《GB/T19000：2000質量管理體系基礎和術語》中，驗證被定義為“通過提供客觀證據(jù)對規(guī)定要求已得到滿足的認定”，確認被定義為“通過提供客觀證據(jù)對特定的預期用途或應用要求已得到滿足的認定”。在ISO/IEC17025中中,確認被定義為“通過核查并提供客觀證據(jù)，以證實某一特定預期用途的特殊要求得到滿足”。從以上定義可以看出，驗證要保證“做得正確”，而確認則要保證“做的東西正確”。驗證注重“過程”，確認注重“結果”。

一、概念1/4/2023第一節(jié)驗證和確認導則在《GB/T19000：2053二、微生物檢驗方法驗證和確認的依據(jù)

①美國官方分析化學家協(xié)會(AOAC)，執(zhí)行標準為：“AOACInternationalMethodsCommmitteeGuidelinesforValidationofQualitativeandQuantitativeFoodMicrobiologicalOfficialMethodsofAnlysis-2002”；②國際標準化組織(ISO)，執(zhí)行標準為：ISO/TR13843：2000《Waterquality--Guidanceonvalidationofmicrobiologicalmethods》和ISO16140:2003《Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs--Protocolforthevalidationofalternativemethods》；③NordVal：NV-DOC.D–2005-01-01《Protocolforthevalidationofalternativemicrobiologicalmethods》；④新加坡認可委員會(SAC)：C&BandENV002《MethodValidationofMicrobiologicalMethods》。此外，可參考GB/T18510-2001《煤和焦炭試驗可替代方法確認準則》。1/4/2023二、微生物檢驗方法驗證和確認的依據(jù)①美國官方分析化學家協(xié)54三、驗證和確認試驗技術用于驗證和確認食品微生物檢驗方法性能的試驗技術包括：①使用參考菌株進行核實；②與其他方法所得的結果進行比較；③實驗室間比對；④對影響結果的因素作系統(tǒng)性評審；⑤根據(jù)對方法的理論原理和實踐經(jīng)驗的科學理解，對所得結果不確定度進行評定。以上驗證和確認食品微生物檢驗方法性能的試驗技術，可概略分為兩大類：實驗室間驗證/確認試驗（協(xié)作試驗）和實驗室內驗證/確認試驗（單一試驗）。

實驗室間驗證/確認試驗是指在若干實驗室內由不同操作者進行的驗證/確認試驗，而實驗室內確認試驗是僅在特定的實驗室內進行的驗證/確認試驗。

1/4/2023三、驗證和確認試驗技術用于驗證和確認食品微生物檢驗方法性能的55四、對試驗人員的要求驗證和確認食品微生物檢驗方法的人員,必須符合以下要求：

A掌握方法中試樣處理的原理；

B掌握方法中食品成分對微生物的干擾以及微生物的增菌原理；C掌握方法中目標微生物分離、純化、鑒定和確認的原理；

D對儀器的構造要有基本了解；E對儀器/試劑盒的工作原理有基本了解；

F能熟練使用儀器/試劑盒；G熟悉儀器/試劑盒的維護和性能確認方法；

H熟悉方法所使用的試劑、材料和儀器/試劑盒；I熟練掌握分析步驟的每一個步驟；

J了解方法的關鍵所在；K能熟練進行分析結果的計算；

L掌握方法能獨立進行數(shù)據(jù)處理，并判斷結果的準確性。

1/4/2023四、對試驗人員的要求驗證和確認食品微生物檢驗方法的人員,必須56五、對協(xié)作實驗室的要求

如果進行實驗室間驗證/確認試驗（協(xié)作試驗），協(xié)作試驗室必須符合以下要求：A按ISO/IEC17025認可，并且進行協(xié)作試驗所需技術在實驗室認可范圍之內，必須提供一份實驗室認可證書和認可范圍；

B令人滿意地進行實際樣品的分析。C有操作和處理分析物或相關混合物及適用對象的經(jīng)驗；

D不能將試驗轉包給其他實驗室；E有獨立的質量保證體系和程序文件，應能提供一份組織結構圖，應能提供一份標準操作程序的提綱提要；

F擁有必需設備，并進行了規(guī)范的維護和校準，應能提供相關記錄；G有培訓和資格確認記錄，應能確保食品微生物檢驗方法的驗證和確認人員符合前文要求；

H有內部質量控制和外部質量評估措施，必須提供這些措施的記錄；I有適當?shù)牧钊藵M意地記錄和保護數(shù)據(jù)的系統(tǒng)。1/4/2023五、對協(xié)作實驗室的要求如果進行實驗室間57第二節(jié)食品微生物檢驗方法的驗證

建議實驗室在以下情況下對檢驗方法進行嚴格的驗證：

1.擬用經(jīng)過完整確認的標準方法以及經(jīng)過嚴格確認的并被審批的非標準方法時；2.培養(yǎng)基供應商、人員、設備、儀器/試劑盒等發(fā)生變動時。

1/4/2023第二節(jié)食品微生物檢驗方法的驗證建議實驗室在以58第三節(jié)食品微生物檢驗方法的確認

實驗室必須對非標準方法、實驗室設計（制定）的方法、超出其預定范圍使用的標準方法、擴充和修改過的標準方法進行嚴格的完整確認，否則不可使用?？筛鶕?jù)AOAC官方食品微生物定量和定性檢驗方法確認指南-2002、ISO/TR13843-2000、ISO16140:2003、NV-DOC.D–2005-01-01或C&BandENV002的方案進行確認，其中AOAC官方食品微生物定量和定性檢驗方法確認指南-2002和ISO16140:2003最常用，這兩個標準大同小異。1/4/2023第三節(jié)食品微生物檢驗方法的確認實驗室必須對59方法之一AOACINTERNATIONALMicrobiologyGuidelines-2002：

AOACINTERNATIONALMETHODSCOMMITTEEGUIDELINESFORVALIDATIONOFQUALITATIVEANDQUANTITATIVEFOODMICROBIOLOGICALOFFICIALMETHODSOFANALYSIS

AOAC國際方法委員會-2002：關于官方食品微生物定性和定量分析方法確認指南1/4/2023方法之一12/28/202260

方法之二

ISO16140:2003：Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs--Protocolforthevalidationofalternativemethods食品和動物飼料微生物學——備用方法確認規(guī)范

ISO/TR13843：2000Waterquality--Guidanceonvalidationofmicrobiologicalmethods水質——微生物方法的確認指南1/4/202312/28/202261方法之三1/4/2023方法之三12/28/202262謝謝Thankyou1/4/2023謝謝Thankyou12/28/202263

準確、可靠的檢驗結果是正確評價和保證食品安全性的先決條件，也是國際貿易上公平交易的有力科學依據(jù)。在食品微生物檢驗領域中，檢驗規(guī)程規(guī)范化和分析方法標準化是檢驗結果可信性的重要保證。避免“公說公有理，婆說婆有理”；避免“仁者見仁，智者見智”1/4/2023準確、可靠的檢驗結果是正確評價和保證食品安全性的先決64內容第一部分國內外食品微生物標準檢驗體系第二部分微生物檢驗快速檢測系統(tǒng)第三部分方法的選擇第四部分微生物檢驗方法的編寫第五部分食品微生物檢驗方法的驗證和確認1/4/2023內容第一部分國內外食品微生物標準檢驗體系1265第一部分國內外的食品微生物標準檢驗體系一、術語和定義

1、標準方法：指國際、區(qū)域、國家發(fā)布的經(jīng)過嚴格確認的以及公認的方法。標準方法包括參考方法和公定方法。

（1）參考方法：指適用于特殊待驗目標的經(jīng)過國際或國家公認的檢驗方法。對于食品微生物檢驗而言，典型的傳統(tǒng)的參考方法是培養(yǎng)法。

（2）公定方法：指知名的技術組織或機構（如AOAC）公布的檢測方法。

2、非標準方法：標準方法中未包含的需要確認后才能采用的方法。

可替代方法：指用來檢驗某一特定產(chǎn)品中某種目標微生物的與相應參考方法等效的方法（ISO16140:2003），如快速檢測試劑盒和自動化系統(tǒng)。值得說明的是，并非所有的可替代方法都是標準方法。1/4/2023第一部分國內外的食品微生物標準檢驗體系一、術語和定義可66二、國內外食品微生物檢測體系

國內主要食品微生物檢測體系

國家標準(GB)

檢驗檢疫行業(yè)標準(SN)

衛(wèi)生行標(WS)

農業(yè)行標(NY)國外主要食品微生物檢測體系

國際標準化組織(ISO)

美國食品藥品監(jiān)督局（FDA）(online)

美國官方分析化學師協(xié)會(AOAC)

美國農業(yè)部（USDA）(online)

加拿大健康署(HPB)(online)

美國公共衛(wèi)生協(xié)會(APHA)

北歐食品分析委員會（NMKL）

法國標準協(xié)會(AFNOR)標準、英國國家標準(BS)、日本國家標準(JIS)、韓國國家標準（KS）等

標準方法非標準方法科學書籍和期刊公布的方法；實驗室研發(fā)的未出版的方法；部分由設備制造商指定的方法；擴充和修改過的標準方法；企業(yè)標準；部分協(xié)會標準；部分地方標準等。食品微生物檢測方法標準方法未包含的方法

1/4/2023二、國內外食品微生物檢測體系國內主要食品微生物檢測體系67

食品中常規(guī)指示菌和致病菌的關系好氧菌總數(shù)腸桿菌科大腸菌群糞大腸菌群大腸桿菌沙門氏菌致瀉性大腸桿菌金黃色葡萄球菌糞鏈球菌弧菌科單增李斯特氏菌志賀氏菌芽孢桿菌O157厭氧梭菌彎曲菌1/4/2023食品中常規(guī)指示菌和致病菌的關系好氧菌總數(shù)腸桿菌科大腸68常規(guī)指示菌和致病菌的“危害分類”VeryfewmicrobesarealwayspathogenicManymicrobesarepotentiallypathogenicMostmicrobesareneverpathogenic如霍亂弧菌、O157、單核細胞增生李斯特氏菌等如腸球菌、蠟樣芽孢桿菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌等如乳酸桿菌、雙歧桿菌等1/4/2023常規(guī)指示菌和致病菌的“危害分類”Veryfewmicro69食品微生物檢測方法方法定量方法定性方法直接計數(shù)方法細菌總數(shù)*、大腸菌群*、大腸桿菌*、腸球菌*、金黃色葡萄球菌*、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、單核增生李斯特氏菌、沙門氏菌、彎曲菌屬、腸桿菌科*、副溶血性弧菌、亞硫酸鹽還原梭菌、李斯特氏菌屬、霉菌和酵母菌數(shù)*、嗜冷菌*、乳酸菌、雙歧桿菌等間接計數(shù)法(MPN法)大腸菌群*、糞大腸菌群*、大腸桿菌*、腸球菌*、金黃色葡萄球菌*、蠟樣芽孢桿菌、單核增生李斯特氏菌、腸桿菌科*、副溶血性弧菌、亞硫酸鹽還原梭菌等致病菌：單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、空腸彎曲菌、O157、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、肉毒梭菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、產(chǎn)毒霉菌等

帶*者通常被列為食品衛(wèi)生指示菌1/4/2023食品微生物檢測方法方法定量方法定性方法直接計數(shù)方法間接計70傳統(tǒng)直接計數(shù)法平板傾注法平板涂布法1/4/2023傳統(tǒng)直接計數(shù)法平板傾注法平板涂布法12/28/2022711/4/202312/28/2022721/4/202312/28/202273MPN法適用于污染程度低，含有受到損傷的加工食品，目標微生物數(shù)量低，否則，應用直接計數(shù)方法間接計數(shù)法——最大可能數(shù)量（MPN）1/4/2023MPN法適用于污染程度低，含有受到損傷的加工食品，目標微生物74三、區(qū)分幾個關系1、國家標準與行業(yè)標準的關系？

食品微生物檢驗的國家標準是GB/T4789，其為基礎標準，行業(yè)標準方法原則上應與其一致，至少不能與國家標準相矛盾。進口產(chǎn)品用GB???出口產(chǎn)品用SN??????

2、國家標準與國際標準的關系？

為了公平貿易，國家標準應與國際標準接軌。應考慮優(yōu)先使用國際標準。現(xiàn)狀。實例：2004年USDA來青進行等效性評估。3、[國內]國家標準/行業(yè)標準與[他國]國家標準/行業(yè)標準的使用？

根據(jù)ISO/IEC17025的規(guī)定，如果進口國要求使用他國國家標準/行業(yè)標準，原則上要滿足客戶的要求，否則，需與客戶協(xié)商。即使國內國家標準/行業(yè)標準與他國國家標準/行業(yè)標準等效或等同，也必須與客戶協(xié)商和溝通，只有做客戶統(tǒng)一的情況下方可使用。1/4/2023三、區(qū)分幾個關系1、國家標準與行業(yè)標準的關系？12/28/275第二部分微生物快速檢測系統(tǒng)1/4/2023第二部分微生物快速檢測系統(tǒng)12/28/202276第一節(jié)主要微生物檢驗快速檢測系統(tǒng)

一、以免疫學為基礎的檢驗法1/4/2023第一節(jié)主要微生物檢驗快速檢測系統(tǒng)一、以免疫學為基礎的檢77免疫磁珠檢驗法的優(yōu)點:特異性好靈敏度高≤1CFU所捕獲的菌是活菌快速、操作步驟簡便可快速處理較大量樣品1/4/2023免疫磁珠檢驗法的優(yōu)點:12/28/2022781/4/202312/28/202279商業(yè)化免疫磁珠有：沙門氏菌O157:H7單核細胞增生李斯特氏菌VTECO145

VTECO111VTECO103VTECO26等等SN/T***-****進出口食品中產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌的檢驗方法1/4/2023商業(yè)化免疫磁珠有：SN/T***-****進出口食品中80

可篩選沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157、李斯特氏菌、空腸彎曲菌、單核細胞增生李斯特氏菌、葡萄球菌腸毒素；可免疫濃縮沙門氏菌、免疫濃縮腸出血性大腸桿菌O157Mini-VIDAS自動微生物篩選儀1/4/2023可篩選沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O15781二、以分子生物學為基礎的檢驗法DIN10135：1999《沙門氏菌聚合酶連鎖反應(PCR)檢驗方法》、ISO/TS20863：2005《食品和動物飼料微生物學—聚合酶鏈反應(PCR)檢測食源病原體—熱循環(huán)器的性能試驗》、ISO/TS22174:2005《食品和動物飼料微生物學—聚合酶鏈反應(PCR)檢測食源病原體—通用要求和定義》、ISO20837:2006《食品和動物飼料微生物學—聚合酶鏈反應(PCR)檢測食源病原體—定性檢測用樣品的制備》、ISO/TS20838：2006《食品和動物飼料微生物學—聚合酶鏈反應(PCR)檢測食源病原體—定性方法的擴增和檢測條件》、HealthCanadaMFLP-72、USAFDABAM第9章和USAAPHA第40章規(guī)定可用PCR檢測食品中的致病弧菌（如霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌等）、HealthCanada

MFLP-24和USAFDABAM第24章和USAAPHA第35章規(guī)定可用PCR檢測食品中產(chǎn)志賀氏毒素的致病大腸桿菌和霍亂弧菌。SN/T1632.2：2005《奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法第2部分：PCR方法》SN/T1632.3：2005《奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法第3部分：熒光PCR方法》PCR檢測食品中霍亂弧菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌等致病菌的SN均在報批中，即將發(fā)布。1/4/2023二、以分子生物學為基礎的檢驗法DIN10135：1999《82PCR技術將是眾多食品微生物快速檢測中被認可的一枝獨秀的快速檢測技術之一。

但須注意：如何減少培養(yǎng)基成分的干擾？死菌的干擾和風險？等等1/4/2023PCR技術將是眾多食品微生物快速檢測中被認可83基因芯片-DNA點樣儀

基因芯片的基本技術路線1、采用數(shù)據(jù)庫中各種微生物的全基因組序列資料或部分基因組序列資料，通過生物信息學方法找出各種微生物的特異序列，每個檢測目標找3-5個特異序列，每個序列長度為25-75mer。并設計五條陰性序列（這些序列不代表任何一個待分析的微生物）。2、合成上述特異序列（探針）。探針將不是傳統(tǒng)的cDNA形式，而是oligo寡聚核酸，這樣將大大提高檢測靈敏度。3、利用基因芯片點樣系統(tǒng)將探針點樣到載體上。同一種微生物的特異性探針點樣到芯片的一個區(qū)域。4、尋找適當?shù)姆椒?，提取微生物的基因組核酸。5、加入相應的引物、熒光染料或用分子信標的方法，通過PCR擴增特異性片段。6、將帶有熒光染料標記的核酸與基因芯片雜交。7、雜交結果由基因芯片掃描儀進行掃描判讀，對于管帽芯片也可用熒光顯微鏡進行觀察。8、結果分析，針對雜交陽性位點，找出對應的陽性樣品。

SN/T1543:2005食源性致病菌基因芯片鑒定方法1/4/2023基因芯片-DNA點樣儀84三、生化鑒定系統(tǒng)1/4/2023三、生化鑒定系統(tǒng)12/28/202285BDPHOENIX?全自動微生物鑒定系統(tǒng)大腸桿菌（G-）沙門氏菌(G-)志賀氏菌(G-)彎曲桿菌(G-)弧菌(G-)小腸結腸炎耶爾森氏菌(G-)金黃葡萄球菌(G+)李斯特氏菌(G+)***產(chǎn)氣甲膜梭菌(G+)肉毒梭菌(G+)鏈球菌(G+)炭疽桿菌(G+)雙歧桿菌（G+）乳酸菌（G+）VITEK2COMPACT1/4/2023BDPHOENIX?大腸桿菌（G-）VITEK2COM86四、根據(jù)酶觸反應及代謝產(chǎn)物快速檢測細菌1/4/2023四、根據(jù)酶觸反應及代謝產(chǎn)物快速檢測細菌12/28/2022871/4/202312/28/2022881/4/202312/28/202289五、其他部分自動化系統(tǒng)1/4/2023五、其他部分自動化系統(tǒng)12/28/202290BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)BIOLOGOmniLog&OmniLogPlusMicroLog1MicroLog2MicroLog3(MicroStation)OmniLogMicroLog1/4/2023BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)BIOLOGOmniLog91第二節(jié)微生物快速檢測系統(tǒng)的局限性

大部分快速方法適用于檢測單一微生物，適用于質量控制程序中快速篩選大量食品樣品中所存在的特殊病原體或毒素。然而，快速檢驗方法所得陽性者，僅僅是可疑，必須用標準參考方法予以證實，雖然證實試驗需要幾天，但不能予以限制。

快速檢驗方法的評估結果表明，其對于某類食品的性能優(yōu)于其它食品，很大程度上是由于食品成分干擾所致，有些食品成分對于快速方法中所應用的技術是比較麻煩的。例如，每一食品成分可能抑制DNA雜交或Taq聚合酶，但對抗原-抗體相互作用沒有影響，反之亦然。既然方法的靈敏度、特異性和精確性依賴于待驗食品，那么進行比較研究以確保某一特殊檢驗方法能有效分析此類食品是明智的。1/4/2023第二節(jié)微生物快速檢測系統(tǒng)的局限性大部分快92

基于DNA檢驗方法的特異性通過短的探針來顯示，因此用特殊探針或引物檢測毒素基因，陽性結果僅僅表明某細菌具有該基因序列，以及某細菌可能是產(chǎn)毒的，不能從客觀上說明該基因得以表達，并產(chǎn)生毒素，例如在梭菌和葡萄球菌中毒病例中，DNA雜交和PCR僅能檢測到基因的存在，但不能用來檢測預先形成的毒素是否存在。

隨著某一快速方法更加頻繁的使用，其好處和局限性同時變得更加明顯。使用者在選擇和徹底評估這些快速方法時，必須保持謹慎。1/4/2023基于DNA檢驗方法的特異性通過短的探針來顯示93FDA認可使用的檢測系統(tǒng)和試劑盒

檢測和鑒定食源性病原菌的微量生化復合試劑盒

微生物自動鑒定系統(tǒng)

核酸雜交分析（分子生物學）方法

免疫學分析方法

其它商品化快速檢測方法和培養(yǎng)基第三節(jié)微生物快速檢測系統(tǒng)的認可一、USDAFDA認可情況1/4/2023FDA認可使用的檢測系統(tǒng)和試劑盒檢測和鑒定食源性病原菌的941/4/202312/28/2022951/4/202312/28/2022961/4/202312/28/2022971/4/202312/28/2022981/4/202312/28/2022991/4/202312/28/2022100二、AOAC、NMKL、AFNOR、

NORDVAL、MICROVAL的認可情況AOAC指南美國管理者(USregulators)ISO16140AOAC研究所NMKLNordValMicroValAOAC&OMA非美國管理者，如NATAAFNOR認可微生物快速檢測系統(tǒng)的主要知名技術組織或機構的相互關系認可(agreement)逐步淘汰(phasingout)1/4/2023二、AOAC、NMKL、AFNOR、

NORDVAL、MIC101第三部分方法的選擇1．客戶要求；2．方法的準確性；3．方法的特異性；4．方法的實用性；5．方法的穩(wěn)定性；6．方法的靈敏度；7．方法的檢測限和測量限；8．實驗室硬件條件（儀器、設備、場地設施、人員資質等）；9．商業(yè)快速檢測系統(tǒng)的供應保證、價格、認可程度和售后服務。1/4/2023第三部分方法的選擇1．客戶要求；12/28/2022102通常情況下，實驗室應采用滿足客戶（注：對于企業(yè)實驗室，其所在單位為其內部客戶）需要并適用于所進行的檢測的方法，包括在抽樣的方法。應優(yōu)先使用以國際、區(qū)域或國家標準發(fā)布的方法。當認為客戶提出的方法不合適或已過期時，實驗室應通知客戶。

當客戶未指定所用方法時，除優(yōu)先使用國際、區(qū)域、國家或知名的技術組織發(fā)布的標準方法外，還可選擇非標準方法，但必須對所選擇的非標準方法進行嚴格驗證、確認和審批，如能滿足實驗室的預期用途，并經(jīng)客戶同意，也可使用。1/4/2023通常情況下，實驗室應采用滿足客戶（注：對于企業(yè)103第四部分微生物檢驗方法的編寫標準方法的一般構成和編寫順序：1．資料性技術要素：封面、目次*、前言、引言；

2．規(guī)范性一般要素：名稱、范圍、規(guī)范性引用文件*；3．規(guī)范性技術要素：術語和定義*、符號和縮略語、食品微生物檢驗(原理*、培養(yǎng)基和試劑、設備和材料、采樣*、制樣、增菌培養(yǎng)、篩選、鑒定和確認等)、結果判定（判定方法和判定標準）、結果報告*、規(guī)范性附錄*；

4．資料性補充要素：資料性附錄*、參考文獻*、索引*。上述構成要素不是任何一項標準都需要全部包括的，標有*者可根據(jù)標準化對象的特征和制定標準化的目的而取舍。第一節(jié)標準方法的編寫1/4/2023第四部分微生物檢驗方法的編寫標準方法的一般構成和編寫順序：1041/4/202312/28/20221051/4/202312/28/2022106第二節(jié)非標準方法的編寫

一般要求以接近國家標準（如GB/T1.1－2000）或行業(yè)標準推薦方法的格式進行編寫。等同、修改采用國際標準或國外先進標準時，其編寫格式和方法可與被采用的標準一致。力求標準結構嚴謹、層次分明、主題突出，簡單易懂。

一、非標準方法的編寫原則

1/4/2023第二節(jié)非標準方法的編寫一般要求以接近國家標107二、非標準食品微生物學檢驗方法的基本編寫格式（1）封面每項非標準微生物檢驗方法應該有封面，封面的內容有“×××（單位）×××（部門）非標準方法”字樣和非標準方法的標志（注：選擇性的）、中文名稱、英文名稱（注：選擇性的）、非標準方法的唯一性編號、代替非標準編號（注：選擇性的）、發(fā)布日期、實施日期、標準的審批部門等（見附錄1示例2）。（2）正文內容一般包含下列內容，必要時可增減相關條目：①目的、范圍；②方法提要或原理:簡述所用方法的主要步驟及采用的基本原理；③設備和材料：標明規(guī)格和型號；④培養(yǎng)基和試劑：必須符合GB/T4789.28和SN/T1583的規(guī)定；⑤檢驗程序：畫出主要的檢驗程序框圖；⑥操作步驟：包括試樣制備（含稀釋或按特定條件的制備）、培養(yǎng)（含前增菌培養(yǎng)和增菌培養(yǎng)，分離培養(yǎng)等，可根據(jù)需要取舍和分步描述）、初步鑒定（可根據(jù)需要取舍）、確證鑒定（含進一步的生化反應和血清學分型，可根據(jù)需要確定試驗內容）毒素試驗（可根據(jù)需要取舍）、動物試驗（可根據(jù)需要取舍）；⑦結果報告；⑧其它（包括內部質量保證要點、生物防護要求；）；⑨附錄（資料性附錄和規(guī)范性附錄）⑩方法來源（如參考文獻、儀器設備方法等）。1/4/2023二、非標準食品微生物學檢驗方法的基本編寫格式（1）封面12/108三、非標準方法的審批

制訂SOP，實施需要其它材料？進一步規(guī)范方法實驗室將全部材料送至主管部門實驗室提供材料和信息審核全部材料被批準和備案否實驗室申請認可，提交材料是是否需要采取后續(xù)措施（包括能力驗證、實驗室內試驗、實驗室間協(xié)作試驗等）？實驗室編寫和確認方法實驗室采取所需的措施主管部門組織技術專家組進行材料審查和技術審核（包括能力驗證結果、性能特征、實驗室內試驗結果、實驗室間協(xié)作試驗結果等），決定是否需要現(xiàn)場考查?，F(xiàn)場核查實驗室調研現(xiàn)場核查？否專家組評估所采取措施是否充分合理？是否是是否

非標準食品微生物學檢驗方法的審批程序1/4/2023三、非標準方法的審批制訂SOP，實施需要其它材料？進一步規(guī)109第三節(jié)標準操作程序的編寫標準操作程序（standardoperationpractices，SOP）是用來指導某個具體過程、事物所形成的技術性細節(jié)描述的可操作性文件，國內常常稱之為“作業(yè)指導書”，二者沒有本質區(qū)別。SOPs的編寫及使用是實驗室成功質量體系中的一部分，因為它能為操作人員提供正確完成一項工作的信息，從而保證不同操作人員都能在一定的不確定度范圍內得到相同的微生物檢驗結果。實驗室應關注以下四個方面SOPs：1．方法類：包括食品微生物檢驗方法中不詳細或不完善部分的補充，期間核查、方法確認及比對等；2．設備類：重要或復雜設備的使用、操作規(guī)范（如設備制造商提供的技術說明書不夠明細等）；3．樣品類：取樣、制樣和樣品處置的“實施細則”等；4．數(shù)據(jù)類：定量檢測結果的表達、異常數(shù)據(jù)的剔除、測量結果不確定度的評定等等。SOP是技術性的文件，并不要求必須制訂。一、定義和分類1/4/2023第三節(jié)標準操作程序的編寫標準操作程序（standardo110二、食品微生物檢驗SOP的編寫依據(jù)目前，在國內，尚未檢索到關于食品微生物檢驗SOP的編寫導則及相關要求；在國外，美國環(huán)境保護署(EPA)(/quality/sops.html)和美國農業(yè)部銷售司(AMS)(/science/mpo/)均發(fā)布關于微生物檢驗SOP的編寫導則及相關要求，前者是后者的藍本：①EPAQA/G-6《GuidanceforPreparingStandardOperatingProcedures(SOPs)》；②EPASOPADM-02-02《StandardOperatingProcedureforPreparationandReviewofStandardOperatingProcedures(SOPs)》；③USDAMDP-ADMIN-07《PreparationandMaintenanceofStandardOperatingProcedures(SOPs)》。以上文本均可從相應網(wǎng)站免費下載，同時EPA和USDAAMS制定了一系列與微生物檢驗相關的SOPs，這些SOPs的編寫結構和格式值得借鑒和參考。1/4/2023二、食品微生物檢驗SOP的編寫依據(jù)目前，在國內，尚未檢索到關111

SOP的格式方法一：參照美國農業(yè)部農業(yè)銷售司(AMS)的微生物數(shù)據(jù)程序/science/mpo/sops.htm

方法二：參照美國環(huán)境保護署（EPA）的EPAQUALITYSYSTEM

/quality/sops.html作業(yè)指導書與SOP無本質區(qū)別1/4/2023SOP的格式作業(yè)指導書與SOP無本質區(qū)別12/28/202112三、SOP的基本編寫格式

下面結合一個實例，介紹一下編寫微生物檢驗SOP的基本格式和要求：（1）封面①編寫單位：中英文對照。②標題：測定對象—測定項目—測定方法名稱(中英文對照)；測定對象：以產(chǎn)品為主，采用最常規(guī)的產(chǎn)品名稱（可參照國際、國家或行業(yè)的產(chǎn)品標準）；測定項目：應寫明具體被測項目；當被測項目為多項時，應一一列出，超過8項時，可只寫出前3個項目。③編寫人及時間：為保證SOP內容的全面性和準確性，由實驗室內具有一定資質的使用者編寫；④審核人及時間；⑤批準人及時間：批準人一般為實驗室的技術負責人；⑥文件編號：唯一編碼；⑦受控狀態(tài)：是否受控；⑧修訂號：第×××次修訂；⑨發(fā)放序號。（2）正文內容一般包含下列內容，必要時可增減相關條目：①目的；②范圍；③方法提要或原理:簡述所用方法的主要步驟及采用的基本原理；④程序提綱：包括培養(yǎng)基和血清、設備和玻璃器皿、取樣、測試樣品的制備、測試樣品和最初懸浮液、非選擇性前增菌、選擇性增菌、篩選、可疑典型菌落的分離和純化、生化鑒定、血清學確認和血清型、確認；⑤安全性；⑥質量保證；⑦參考文獻；⑧特殊程序：與④對應；⑨結果表達和測試報告；⑩附錄（資料性附錄和規(guī)范性附錄）。1/4/2023三、SOP的基本編寫格式下面結合一個實例，介紹一下編寫微生113SOP實例USDA：MDP-DATA-01MicrobiologicalDataandResultsReporting

EPA：QC-02-02Air-SurfaceMonitoringofMicrobiologyLaboratories山東CIQ：SOP沙門氏菌的檢測方法1/4/2023SOP實例USDA：MDP-DATA-01Microb114第五部分食品微生物檢驗方法的驗證和確認

一個實驗室擬用某一食品微生物檢驗方法前，無論是標準方法還是非標準方法，皆應對其進行嚴格驗證或確認。詳見《食品微生物實驗室質量管理手冊》1/4/2023第五部分食品微生物檢驗方法的驗證和確認一個115第一節(jié)驗證和確認導則

在《GB/T19000：2000質量管理體系基礎和術語》中，驗證被定義為“通過提供客觀證據(jù)對規(guī)定要求已得到滿足的認定”，確認被定義為“通過提供客觀證據(jù)對特定的預期用途或應用要求已得到滿足的認定”。在ISO/IEC17025中中,確認被定義為“通過核查并提供客觀證據(jù)，以證實某一特定預期用途的特殊要求得到滿足”。從以上定義可以看出，驗證要保證“做得正確”，而確認則要保證“做的東西正確”。驗證注重“過程”，確認注重“結果”。

一、概念1/4/2023第一節(jié)驗證和確認導則在《GB/T19000：20116二、微生物檢驗方法驗證和確認的依據(jù)

①美國官方分析化學家協(xié)會(AOAC)，執(zhí)行標準為：“AOACInternationalMethodsCommmitteeGuidelinesforValidationofQualitativeandQuantitativeFoodMicrobiologicalOfficialMethodsofAnlysis-2002”；②國際標準化組織(ISO)，執(zhí)行標準為：ISO/TR13843：2000《Waterquality--Guidanceonvalidationofmicrobiologicalmethods》和ISO