核酸藥物和制藥技術(shù)課件

反義核酸反義RNA分子：可以和目標(biāo)基因的mRNA互補(bǔ)的

一段寡聚核苷酸分子，它影響mRNA正常功能；反義DNA分子：類似于反義RNA分子，可以抑制基因表達(dá)的分子；RNA-DNA嵌合分子：經(jīng)化學(xué)修飾的寡聚核苷酸類似物：Oligo

反義核酸反義核酸反義RNA分子：可以和目標(biāo)基因的mRNA互補(bǔ)1作用機(jī)理與前體RNA結(jié)合－干擾RNA剪切和成熟與mRNA結(jié)合，封閉核糖體結(jié)合位點(diǎn)，影響翻譯與mRNA形成dsRNA，誘導(dǎo)RNaseH對(duì)其降解與互補(bǔ)DNA結(jié)合，形成DNA-RNA復(fù)合物，影響DNA復(fù)制作用機(jī)理與前體RNA結(jié)合－干擾RNA剪切和成熟與mRNA2特點(diǎn)雙鏈RNA（如siRNA）作用強(qiáng)烈；與核酶連接作用更強(qiáng)。特點(diǎn)雙鏈RNA（如siRNA）作用強(qiáng)烈；3核酶（Ribozyme)

核酶不是普通的蛋白質(zhì)酶，而是一類具催化活性的核酸分子,1980年Cech在嗜熱四膜蟲中首先發(fā)現(xiàn)。目前已知具有催化功能的RNA結(jié)構(gòu)可以分為5種發(fā)卡狀核酶

錘頭狀核酶Ⅰ型內(nèi)含子核酶

RNaseP核酶丁型肝炎病毒核酶核酶（Ribozyme)核酶不是普通的蛋白質(zhì)酶，而是一類4天然錘頭狀核酶示意圖GGACAUGGCCUCCUGUCACCGGA3′5′UUUGUUGCUGAUGAGUCCAAGCAGGUUAG底物位點(diǎn)催化活性位點(diǎn)天然錘頭狀核酶示意圖GGACAUGGCCUCCUGUC5反義核苷酸藥物的應(yīng)用

反義核酸技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室中取得了較好的效果，90年代以來國外一些制藥公司開展了若干反義藥物的臨床實(shí)驗(yàn)。

1997年，美國Genta公司研制了針對(duì)Bcl2基因的反義藥物，用于治療前列腺癌和其他惡性腫瘤。美國Hybridon公司研制了針對(duì)巨細(xì)胞病毒（CMV）感染的反義藥物并進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)。反義核苷酸藥物的應(yīng)用反義核酸技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室中取得了較好的6RNA干擾藥物RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控和基因沉默的過程，其廣泛存在于從植物、無脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物的各種生物。

RNAi的作用原理

雙鏈RNA誘導(dǎo)誘導(dǎo)RNAi的過程主要分為兩個(gè)階段：

Ⅰ啟動(dòng)階段Ⅱ執(zhí)行階段

RNA干擾藥物RNA干擾（RNAinterfere7核酸藥物和制藥技術(shù)課件8RNAi的作用原理

啟動(dòng)階段當(dāng)細(xì)胞中由于感染等原因出現(xiàn)雙鏈RNA分子時(shí)，細(xì)胞中一種稱為Dicer的核酸酶就會(huì)識(shí)別這些雙鏈RNA，并將其降解成21-23bp長的小干擾RNA（siRNA），單鏈siRNA與一些蛋白形成復(fù)合體，構(gòu)成“RNA誘導(dǎo)的沉默小體”（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）執(zhí)行階段當(dāng)目標(biāo)mRNA與RISC中的siRNA完全配對(duì)時(shí)，RISC就會(huì)切割目標(biāo)RNA，并由細(xì)胞中的核酸酶將其進(jìn)一步降解，從而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)RNAi的作用原理啟動(dòng)階段當(dāng)細(xì)胞中由于感染等原9啟動(dòng)階段原理圖啟動(dòng)階段RISCRISC前體Dicer（21-23bp）siRNA啟動(dòng)階段原理圖啟動(dòng)階段RISCRISC前體Dicer（210執(zhí)行階段原理圖執(zhí)行階段核酸酶切割胞內(nèi)其它AAAAAAA切割RISCAAAAAAAmRNA核酸酶切割胞內(nèi)其它AAAAAAA切割RISCAAAAAAAmRNA執(zhí)行階段原理圖執(zhí)行階段核酸酶切割胞內(nèi)其它AAAAAAA切割R11siRNA藥物長鏈的RNA會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞合成并分泌干擾素，干擾素又會(huì)抑制細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，造成一定的副作用。如果直接用21-23bp的小雙鏈RNA即siRNA，則不會(huì)誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)，卻能在細(xì)胞中激活RISC，發(fā)揮抑制基因表達(dá)的作用。

siRNA的作用

體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型研究證明siRNA藥物可以成功抑制HIV、乙肝病毒、流感病毒、SARS冠狀病毒、口蹄疫病毒等的感染。

siRNA還可以治療一些非感染性疾?。好绹陂_發(fā)一種治療老年性黃斑變性的siRNA藥物siRNA藥物長鏈的RNA會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞合成并分泌干擾素，12siRNA藥物優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：與反義RNA相似，siRNA作為藥物具有目標(biāo)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)

與反義RNA相比，siRNA藥物的作用機(jī)制更加明確，效果更加肯定缺點(diǎn)：siRNA的作用需要與目標(biāo)RNA間發(fā)生完全的配對(duì)，因此對(duì)于目標(biāo)RNA的突變很敏感。個(gè)別位點(diǎn)的突變會(huì)使效果大打折扣

在用于抗病毒治療時(shí)，病毒可能出現(xiàn)抗藥突變株siRNA藥物優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：與反義RNA相似，siR13siRNA的設(shè)計(jì)和制備siRNA的制備

實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄正義鏈反義鏈混合雙鏈RNADicer酶加工Dicer酶加工siRNA構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄正義鏈構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄反義鏈正義鏈構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄正義鏈構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄反義鏈正義鏈構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄反義鏈正義鏈構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄反義鏈正義鏈構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄Dicer酶加工siRNADicer酶加工siRNADicer酶加工siRNA實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)?；旌戏戳x鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒雙鏈RNA混合反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒Dicer酶加工雙鏈RNA混合反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒siRNADicer酶加工雙鏈RNA混合反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒siRNA的設(shè)計(jì)和制備siRNA的制備實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基14siRNA的設(shè)計(jì)和制備

siRNA的設(shè)計(jì)應(yīng)選取對(duì)于疾病發(fā)生具有至關(guān)重要作用，而對(duì)細(xì)胞的其他功能影響不大的保守基因作為目標(biāo)基因，再根據(jù)目標(biāo)基因的序列設(shè)計(jì)siRNATomTuschl根據(jù)實(shí)驗(yàn)提出了一個(gè)設(shè)計(jì)siRNA的原則：選擇轉(zhuǎn)譯起始密碼子后50-100堿基的范圍，以AA作為正義鏈的第1，2個(gè)核苷酸，GC比為50﹪左右，同時(shí)在正義鏈和反義鏈的3′-都有TT兩個(gè)核苷酸的突變siRNA的設(shè)計(jì)和制備siRNA的設(shè)計(jì)應(yīng)選15siRNA的設(shè)計(jì)和制備

siRNA的制備siRNADicer酶加工雙鏈RNA混合反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒siRNADicer酶加工雙鏈RNA混合反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒大規(guī)模的化學(xué)合成方法：可以在合成時(shí)加入保護(hù)基團(tuán)增加siRNA的穩(wěn)定性大規(guī)模的化學(xué)合成方法：可以在合成時(shí)加入保護(hù)基團(tuán)增加siRNA的穩(wěn)定性大規(guī)模的化學(xué)合成方法：可以在合成時(shí)加入保護(hù)基團(tuán)增加siRNA的穩(wěn)定性siRNA的設(shè)計(jì)和制備siRNA的制備siRN16核酸藥物的修飾和給藥人體內(nèi)存在大量的核酸酶，在體內(nèi)應(yīng)用反義RNA，siRNA等新型核酸藥物治療時(shí)，一個(gè)關(guān)鍵問題就是保證它們能夠抵抗核酸酶的降解并被有效地運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞。RNA的化學(xué)修飾是一個(gè)有效的途徑修飾磷酸二酯鍵修飾核酸修飾骨架化學(xué)修飾修飾骨架化學(xué)修飾修飾核酸修飾骨架化學(xué)修飾修飾磷酸二酯鍵修飾核酸修飾骨架鄧子新《NatureChemicalBiology》2007.

核酸藥物的修飾和給藥人體內(nèi)存在大量的核酸酶，在體內(nèi)應(yīng)17核酸藥物的修飾和給藥增強(qiáng)核酸藥物有效運(yùn)送到靶組織的方式：

Ⅰ用脂質(zhì)體等材料包埋核酸藥物靜脈注射。如果在脂質(zhì)體上加入有助于膜融合的分子如氯喹，可以進(jìn)一步提高它們進(jìn)入細(xì)胞的效率Ⅱ在核酸分子上連接一段可以進(jìn)入細(xì)胞的肽段即轉(zhuǎn)導(dǎo)肽不同的應(yīng)用目的應(yīng)采用不同的給藥方式：局部注射、靜脈注射，有報(bào)道表明核酸藥物還可以通過皮膚給藥核酸藥物的修飾和給藥增強(qiáng)核酸藥物有效運(yùn)送到靶組織的方18THANKYOUTHANKYOU19反義核酸反義RNA分子：可以和目標(biāo)基因的mRNA互補(bǔ)的

一段寡聚核苷酸分子，它影響mRNA正常功能；反義DNA分子：類似于反義RNA分子，可以抑制基因表達(dá)的分子；RNA-DNA嵌合分子：經(jīng)化學(xué)修飾的寡聚核苷酸類似物：Oligo

反義核酸反義核酸反義RNA分子：可以和目標(biāo)基因的mRNA互補(bǔ)20作用機(jī)理與前體RNA結(jié)合－干擾RNA剪切和成熟與mRNA結(jié)合，封閉核糖體結(jié)合位點(diǎn)，影響翻譯與mRNA形成dsRNA，誘導(dǎo)RNaseH對(duì)其降解與互補(bǔ)DNA結(jié)合，形成DNA-RNA復(fù)合物，影響DNA復(fù)制作用機(jī)理與前體RNA結(jié)合－干擾RNA剪切和成熟與mRNA21特點(diǎn)雙鏈RNA（如siRNA）作用強(qiáng)烈；與核酶連接作用更強(qiáng)。特點(diǎn)雙鏈RNA（如siRNA）作用強(qiáng)烈；22核酶（Ribozyme)

核酶不是普通的蛋白質(zhì)酶，而是一類具催化活性的核酸分子,1980年Cech在嗜熱四膜蟲中首先發(fā)現(xiàn)。目前已知具有催化功能的RNA結(jié)構(gòu)可以分為5種發(fā)卡狀核酶

錘頭狀核酶Ⅰ型內(nèi)含子核酶

RNaseP核酶丁型肝炎病毒核酶核酶（Ribozyme)核酶不是普通的蛋白質(zhì)酶，而是一類23天然錘頭狀核酶示意圖GGACAUGGCCUCCUGUCACCGGA3′5′UUUGUUGCUGAUGAGUCCAAGCAGGUUAG底物位點(diǎn)催化活性位點(diǎn)天然錘頭狀核酶示意圖GGACAUGGCCUCCUGUC24反義核苷酸藥物的應(yīng)用

反義核酸技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室中取得了較好的效果，90年代以來國外一些制藥公司開展了若干反義藥物的臨床實(shí)驗(yàn)。

1997年，美國Genta公司研制了針對(duì)Bcl2基因的反義藥物，用于治療前列腺癌和其他惡性腫瘤。美國Hybridon公司研制了針對(duì)巨細(xì)胞病毒（CMV）感染的反義藥物并進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)。反義核苷酸藥物的應(yīng)用反義核酸技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室中取得了較好的25RNA干擾藥物RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控和基因沉默的過程，其廣泛存在于從植物、無脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物的各種生物。

RNAi的作用原理

雙鏈RNA誘導(dǎo)誘導(dǎo)RNAi的過程主要分為兩個(gè)階段：

Ⅰ啟動(dòng)階段Ⅱ執(zhí)行階段

RNA干擾藥物RNA干擾（RNAinterfere26核酸藥物和制藥技術(shù)課件27RNAi的作用原理

啟動(dòng)階段當(dāng)細(xì)胞中由于感染等原因出現(xiàn)雙鏈RNA分子時(shí)，細(xì)胞中一種稱為Dicer的核酸酶就會(huì)識(shí)別這些雙鏈RNA，并將其降解成21-23bp長的小干擾RNA（siRNA），單鏈siRNA與一些蛋白形成復(fù)合體，構(gòu)成“RNA誘導(dǎo)的沉默小體”（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）執(zhí)行階段當(dāng)目標(biāo)mRNA與RISC中的siRNA完全配對(duì)時(shí)，RISC就會(huì)切割目標(biāo)RNA，并由細(xì)胞中的核酸酶將其進(jìn)一步降解，從而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)RNAi的作用原理啟動(dòng)階段當(dāng)細(xì)胞中由于感染等原28啟動(dòng)階段原理圖啟動(dòng)階段RISCRISC前體Dicer（21-23bp）siRNA啟動(dòng)階段原理圖啟動(dòng)階段RISCRISC前體Dicer（229執(zhí)行階段原理圖執(zhí)行階段核酸酶切割胞內(nèi)其它AAAAAAA切割RISCAAAAAAAmRNA核酸酶切割胞內(nèi)其它AAAAAAA切割RISCAAAAAAAmRNA執(zhí)行階段原理圖執(zhí)行階段核酸酶切割胞內(nèi)其它AAAAAAA切割R30siRNA藥物長鏈的RNA會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞合成并分泌干擾素，干擾素又會(huì)抑制細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，造成一定的副作用。如果直接用21-23bp的小雙鏈RNA即siRNA，則不會(huì)誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)，卻能在細(xì)胞中激活RISC，發(fā)揮抑制基因表達(dá)的作用。

siRNA的作用

體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型研究證明siRNA藥物可以成功抑制HIV、乙肝病毒、流感病毒、SARS冠狀病毒、口蹄疫病毒等的感染。

siRNA還可以治療一些非感染性疾病：美國正在開發(fā)一種治療老年性黃斑變性的siRNA藥物siRNA藥物長鏈的RNA會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞合成并分泌干擾素，31siRNA藥物優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：與反義RNA相似，siRNA作為藥物具有目標(biāo)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)

與反義RNA相比，siRNA藥物的作用機(jī)制更加明確，效果更加肯定缺點(diǎn)：siRNA的作用需要與目標(biāo)RNA間發(fā)生完全的配對(duì)，因此對(duì)于目標(biāo)RNA的突變很敏感。個(gè)別位點(diǎn)的突變會(huì)使效果大打折扣

在用于抗病毒治療時(shí)，病毒可能出現(xiàn)抗藥突變株siRNA藥物優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：與反義RNA相似，siR32siRNA的設(shè)計(jì)和制備siRNA的制備

實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄正義鏈反義鏈混合雙鏈RNADicer酶加工Dicer酶加工siRNA構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄正義鏈構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄反義鏈正義鏈構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄正義鏈構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄反義鏈正義鏈構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄反義鏈正義鏈構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄反義鏈正義鏈構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄Dicer酶加工siRNADicer酶加工siRNADicer酶加工siRNA實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)?；旌戏戳x鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒雙鏈RNA混合反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒Dicer酶加工雙鏈RNA混合反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒siRNADicer酶加工雙鏈RNA混合反義鏈正義鏈體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基因兩側(cè)分別帶有噬菌體T7、SP6等啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒siRNA的設(shè)計(jì)和制備siRNA的制備實(shí)驗(yàn)室制法：構(gòu)建目標(biāo)基33siRNA的設(shè)計(jì)和制備

siRNA的設(shè)計(jì)應(yīng)選取對(duì)于疾病發(fā)生具有至關(guān)重要作用，而對(duì)細(xì)胞的其他功能影響不大的保守基因作為目標(biāo)基因，再根據(jù)目標(biāo)基因的序列設(shè)計(jì)siRNATomTuschl根據(jù)實(shí)驗(yàn)提出了一個(gè)設(shè)計(jì)siRNA的原則：選擇轉(zhuǎn)譯起始密碼子后50-100堿基的范圍，以AA作為正義鏈的第1，2個(gè)核苷酸，GC比為